漢源地區花椒揮發油GC-MS 指紋圖譜的構建

摘 要：【目的】為漢源地區花椒的產地鑒定和品質分級提供參考。【方法】選取漢源縣不同鄉鎮的20 個花椒材料作為樣品，采用水蒸氣蒸餾法制備漢源花椒揮發油，運用氣相色譜- 質譜聯用儀進行揮發油成分的分析和鑒定，采用峰面積歸一法計算組分的相對質量分數，采用聚類分析和主成分分析進行分類，再運用中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統軟件構建指紋圖譜并計算相似度。【結果】從漢源地區花椒揮發性物質中分離出60 多種成分，20 份樣品的揮發性成分相近且種類差別較小，包括烯烴類、醇類、酯類、烷烴類、苯類、酮類、呋喃類、酸類、醛類等，其中前3 類的相對質量分數較高。分類分析結果表明20 份花椒樣品不存在差異較大的樣品，滿足建立指紋圖譜的條件。通過構建漢源地區花椒揮發性成分指紋圖譜，標定出19 個共有峰為漢源花椒揮發性物質特征峰，分別為α- 蒎烯、檜烯、β- 水芹烯、β- 蒎烯、β- 月桂烯、D- 檸檬烯、β- 羅勒烯、紫蘇烯、芳樟醇、香茅醛、α-松油醇、香芹酮、乙酸芳樟酯、乙酸松油酯、橙花醇乙酸酯、乙酸香葉酯、石竹烯、γ- 楓香脂、大根香葉烯D，各樣品的圖譜與對照圖譜的相似度均在0.9 以上，表明建立的指紋圖譜可靠。【結論】完成了揮發油GC-MS 指紋圖譜的構建，該指紋圖譜可用于漢源地區花椒的產地鑒定、品質評價及種質資源研究。

關鍵詞：漢源；花椒；揮發油；GC-MS 指紋圖譜；聚類分析

中圖分類號：S602 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2025）01—0223—09

花椒Zanthoxylum bungeanum 種質資源類型豐富且種植區域廣泛，不同種質資源間表觀形態相似，加之各地命名方式不同，導致“同名不同物”等現象頻發，為花椒產地辨別帶來困難。四川省是我國花椒主產區，特別是漢源縣所產的漢源花椒，種植歷史悠久，自唐代起就被譽為“貢椒”，其品質優良、香氣濃郁，先后被列入《國家地理標志產品名錄》和《中歐地理標志合作和保護協定產品保護名錄》[1]。然而，由于缺乏有效的產地識別技術和質量控制手段，漢源花椒在市場上屢遭假冒，嚴重影響其品牌信譽和產業效益。現行評價標準主要依賴理化指標和感官評定[2-4]，難以客觀、全面地區分漢源花椒的真偽和品質。因此，建立一種科學、精準的產地鑒定方法和品質評價體系，對保護漢源花椒品牌至關重要。

指紋圖譜技術以其專屬性強、可量化分析等特點，在中藥質量控制與鑒別、環境監測、生物化工及電子技術等領域得到廣泛應用[5]。其中，基于香氣特征的指紋圖譜被廣泛用于“道地藥材”的鑒別。GC-MS 聯用技術能夠高效解析花椒揮發油的化學成分[6-7]，為構建花椒揮發油指紋圖譜提供了可靠手段。目前，國內外研究者已對青花椒與紅花椒、不同產區花椒的揮發性成分進行了指紋圖譜研究[8-11]，并探討了不同加工工藝對花椒揮發油的影響[12]。花椒的品質受產地環境（如氣候、海拔、土壤）、品種及加工方式等因素影響顯著，已有研究結果顯示，甘肅武都花椒[13] 和貴州頂壇花椒[14] 的指紋圖譜特征成分存在明顯差異。目前，鮮見關于漢源花椒的指紋圖譜研究，無法滿足其產地鑒別與品質控制的需求。本研究中以漢源花椒揮發油為研究對象，采用氣相色譜-質譜聯用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術，結合聚類分析和主成分分析分析，構建漢源花椒的特征指紋圖譜，旨在為其產地溯源和品質評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

漢源縣位于四川省雅安市西南部，屬亞熱帶季風性濕潤氣候，冬暖夏涼，四季分明。雨量偏少且不均，氣候垂直變化大。年均氣溫22 ℃，日照時長1 450 h，年活動積溫5 844.7 ℃，氣候溫暖，光照充足。

1.2 主要材料與試劑

以正常生長發育的成熟花椒果實為樣品。20份花椒果實樣品采自漢源縣不同鄉鎮的種植園，采摘地點和采摘時間如表1 所示。S1 ～ S14 品種為漢源花椒，S15 ～ S17 為四川省農業特色植物研究院自有花椒品種（自漢源花椒的芽變材料中選育出來的新品種），S18 ～ S20 為四川省農業特色植物研究院選育的花椒優良種質資源（自漢源花椒中選育的新材料），S1 ～ S20 號花椒的培育管理方式相同。

石油醚、無水硫酸鈉均為分析純，購自東莞市勛業化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

JJ-2B粉碎機，購自上海達洛科學儀器有限公司；1 L 揮發油提取器，購自睢縣泳洋玻璃儀器有限公司；AB-L 分析天平，購自梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司；單四極桿Trace1300/ISQ7000氣相色譜- 質譜聯用儀，購自美國賽默飛世爾科技公司；BCD-215TD GA 電冰箱，購自青島海爾股份有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 供試液制備

把干燥、去雜、除籽的花椒果實樣品粉碎，過篩（孔徑0.25 mm），混合均勻后稱取10.000 0 g，置于揮發油提取器中，加數粒玻璃珠，加入400 mL蒸餾水進行蒸餾，控制油滴從冷凝管緩慢滴下，持續回流3 ～ 4 h，將收集到的揮發油以適量無水乙醚溶解，加入適量無水硫酸鈉吸水，置于-20 ℃冰箱中保存過夜。在GC-MS 進樣前，經濾膜（孔徑0.22 μm）過濾，即得樣品供試液。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為熱電氣相色譜柱TG-5SILMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫：初始柱溫50 ℃，維持1 min；以3 ℃ /min 的速度升至75 ℃，維持5 min；再以3 ℃ /min 的速度升至100 ℃，維持5 min；最后以5 ℃ /min 的速度升至230 ℃，維持5 min。載氣為高純度氦氣，進樣量為2 μL，進樣溫度為230 ℃，檢測器溫度為260 ℃，分流比為40∶1，溶劑延遲時間為4 min。

1.4.3 MS 條件

選用EI 離子源，離子源溫度為250 ℃，傳輸線溫度為240 ℃，四極桿溫度為150 ℃，掃描范圍（質量與電荷之比，m/z）50 ～ 300 amu，利用NIST17 標準譜庫對各揮發性成分進行定性分析。所有樣品在相同條件下檢測，供試液平行進樣3 次，并記錄樣品的GC-MS 總離子流圖等信息。采用檢索標準譜庫（NIST 17）對花椒揮發油色譜圖中的共有峰進行定性，1.5 數據處理與分析。指紋圖譜建立和相似度分析采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）軟件，作圖采用Origin 2022 軟件，顯著性、聚類、主成分分析采用IBM SPSS 26.0 軟件。

2 結果與分析

2.1 方法學考察[15]

2.1.1 精密度

制備S7 號樣品揮發油供試液，在相同GC 色譜條件下連續進樣6 次，記錄色譜圖。設參照峰為分離度較好且穩定的D- 檸檬烯，計算其余共有峰的保留時間和相對峰面積的相對標準偏差。結果顯示，保留時間和相對峰面積的相對標準偏差均小于3%，表明該儀器精密度良好。

2.1.2 重復性

制備S7 號樣品揮發油供試液，在相同GC 色譜條件下進樣，每份供試液重復測定3 次，記錄色譜圖。設D- 檸檬烯為參照峰，計算其余共有峰的保留時間和相對峰面積的相對標準偏差。結果顯示，保留時間和相對峰面積的相對標準偏差均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.1.3 穩定性

制備S7 號樣品揮發油供試液，分別在室溫下放置0、3、6、9、12、18、24 h 后進樣，記錄色譜圖。設D- 檸檬烯為參照峰，計算其余共有峰的保留時間和相對峰面積的相對標準偏差。結果顯示，保留時間和相對峰面積的相對標準偏差均小于3%，表明供試液在24 h 內穩定性良好。

2.2 漢源地區花椒的揮發性成分分析

2.2.1 揮發性成分的鑒定

S1 ～ S20 漢源地區花椒揮發油GC-MS 總離子流見圖1。從圖1 可見，各樣品的色譜峰分離較好，總體相似，表明20 份花椒樣品的揮發性成分較為相近。采用標準譜庫檢索的結果表明，漢源地區花椒揮發性成分包括烯烴類、醇類、酯類、烷烴類、苯類、酮類、呋喃類、酸類、醛類（圖2），其中烯烴類、醇類、酯類物質種類較多。這些揮發性成分具有明顯的呈香特性，共同構成了漢源地區花椒的特殊香氣特征。

將共有峰進行標準譜庫檢索時，選擇匹配度大于95% 的組分，用峰面積歸一法計算組分的相對質量分數，記錄相對質量分數大于0.1% 的組分，結果見表2，由表2 可知，漢源地區花椒共有的主要揮發性成分為D- 檸檬烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯、β- 蒎烯、β- 羅勒烯、紫蘇烯、大根香葉烯D、L-α-松油醇、檜烯、γ- 楓香脂。與侯瑩瑩等[13] 所測的武都花椒相比，漢源地區花椒的酯類物質相對含量高，漢源地區花椒具有β- 蒎烯、D- 檸檬烯、芳樟醇、紫蘇烯相對含量較高的特點，武都花椒具有α- 蒎烯、桉葉醇、水芹烯的相對含量較高的特點。與邊甜甜等[12] 所測的甘肅隴南花椒相比，漢源地區花椒的β- 蒎烯、檸檬烯、芳樟醇、紫蘇烯、γ- 楓香脂等相對含量較高，隴南花椒的乙酸芳樟酯、β- 胡椒烯等的相對含量較高。有8 種物質與課凈璇等[8] 測定的漢源紅花椒中11 種特征物質保持一致，但物質的相對含量存在差異，可能與品種或成熟時間不同有關，也可能是土壤條件不同[16] 或花粉傳播促進了種質資源之間基因交流造成的[17-18]。

2.2.2 揮發性成分的聚類分析和主成分分析

為了排除差異較大的樣品，建立穩定的指紋圖譜，將20 份樣品的共有峰面積進行系統聚類分析，結果如圖3 所示。當平方歐氏距離大于13 時，20 個樣品可被聚為2 類，S8 為單獨一類，可能與該樣品中L-α- 松油醇相對質量分數較高（9.3843%）有關，其余樣品歸為一類；當平方歐氏距離不大于13 時，后一類又可聚為2 類，其中S2、S7、S13、S5、S20、S10、S6、S11、S1、S3、S9、S14 為一類，S17、S18、S12、S15、S16、S4、S19 為一類，可能與前者中醛類、酮類物質相對含量顯著高于后者，且烯烴類的相對含量顯著低于后者有關。聚類分析結果顯示，不同的漢源地區花椒在揮發性成分上存在差異，但從整體上不存在差異性較大的樣品，表明樣品滿足指紋圖譜的構建要求。這可能與花椒生長在相同的地理環境和采用相同的栽培管理方式有關。

將20 份花椒樣品的共有峰面積進行主成分分析，并對特征值進行降維處理，得出降維后的特征值和方差貢獻率，特征值大于1 的主成分有4 個，累計貢獻率為84.06%，表明這4 個主成分能夠較好地代表漢源花椒揮發性成分的基本特征值和主要信息。由圖4 中空間散點的距離可知，S8 為單獨一類，其他樣品聚為一類，這與聚類分析結果一致，進一步說明所采樣品滿足構建指紋圖譜的要求。

2.3 漢源地區花椒揮發性成分GC-MS 指紋圖譜構建

在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統中導入20 份漢源花椒樣品的色譜信息，經參照峰選擇、多點校正、Mark 峰匹配，生成對照指紋圖譜（圖5），并進行相似度分析。由圖5 可知，樣品在38 min 內出峰較為集中，根據GC-MS 標準指紋圖譜（R）篩選出19 個特征峰為漢源花椒揮發性成分的指紋峰，各樣品的圖譜與標準對照指紋圖譜的相似度為0.933 0 ～ 0.982 5，表明20 份花椒樣品具有較好的相似性，所構建的指紋圖譜對漢源花椒GC-MS 圖譜中的有效成分信息表達得比較全面，構建的特征指紋圖譜信息具有可靠性。

圖5 中標注的1 ～ 19 號指紋峰分別代表的化學物質為10 種烯烴類、5 種酯類、2 種醇類、1 種醛類和1 種酮類（表3）。由表3 可知，漢源花椒的特征揮發性成分按出峰先后依次為α- 蒎烯、檜烯、β- 水芹烯、β- 蒎烯、β- 月桂烯、D- 檸檬烯、β- 羅勒烯、紫蘇烯、芳樟醇、香茅醛、α- 松油醇、香芹酮、乙酸芳樟酯、乙酸松油酯、橙花醇乙酸酯、乙酸香葉酯、石竹烯、γ- 楓香脂、大根香葉烯D。不同于課凈璇等[8]、葉洵等[11]、侯瑩瑩等[13] 所測特征峰物質，這19 種物質可作為漢源花椒的特征性物質。

3 結論與討論

通過對20 份漢源花椒樣品的揮發性物質進行成分分析，發現其揮發性成分組成相近，差異較小。根據化學結構，主要成分包括烯烴類、醇類、酯類、烷烴類、苯類、酮類、呋喃類、酸類、醛類，其中烯烴類、醇類和酯類成分的相對質量分數較高。本研究中構建的GC-MS 指紋圖譜共標定19 種特征性物質：α- 蒎烯、檜烯、β- 水芹烯、β- 蒎烯、β-月桂烯、D- 檸檬烯、β- 羅勒烯、紫蘇烯、芳樟醇、香茅醛、α- 松油醇、香芹酮、乙酸芳樟酯、乙酸松油酯、橙花醇乙酸酯、乙酸香葉酯、石竹烯、γ-楓香脂、大根香葉烯D。指紋圖譜相似度均在0.9以上，表明所建指紋圖譜方法可靠，可用于漢源花椒的產地鑒定、品質評價及種質資源研究。

本研究中首先明確了漢源花椒揮發性物質的GC 分離方法，確定了出峰數量多、分離度好、峰形理想的氣相色譜參數。通過標準質譜庫比對定性，采用峰面積歸一化法計算主要組分的相對質量分數。其次對20 份漢源花椒揮發物質樣品進行了成分分析鑒定，發現其揮發性成分相近，組間差異較小。該結論與葉洵等[11]、朱琳[19]、劉振平等[20] 的研究成果一致，采用GC-MS 和電子鼻等手段進行測定分析的結果均表明漢源花椒具有獨特的風味特征，在聚類分析和主成分分析結果中被單獨歸為一類，證實花椒風味受產地因素影響較大。但這些研究中建立的指紋圖譜和所標記的紅花椒共有峰物質與本研究均存在差異，可能與采收時間、保存條件或提取方法不同有關。

從20 份樣品中共鑒定出60 多種揮發性成分，共同構成了漢源花椒的香氣特征。根據化學結構，揮發性成分包括烯烴類、醇類、酯類、烷烴類、苯類、酮類、呋喃類、酸類、醛類等，其中相對質量分數最高的物質為烯烴類，然后依次是醇類、酯類。聚類分析和主成分分析結果表明，產區為漢源縣的20 個花椒樣品揮發性物質組分相似性較大，根據指紋圖譜標定出20 份漢源花椒樣品的19種共有組分。該結論和課凈璇等[8] 的部分研究結果吻合，均檢測到乙酸松油酯、乙酸橙花酯和乙酸香葉酯等特征酯類物質，這些成分對漢源花椒的優質香氣具有重要貢獻。但在本研究中未檢測出崖柏烯和1- 石竹烯，可能與檢測條件、品種差異或成熟度有關。

漢源縣獨有的亞熱帶季風氣候和黃棕壤等條件共同塑造了漢源花椒獨有的香氣特征[21]。這種地理標志性特征的形成機制有待深入研究。漢源花椒作為一種高級食用香料，其揮發性物質不但可被作為原料的重要品質指標，而且對其深加工產品的風味特性具有決定性影響。本研究中僅以當季鮮品花椒為材料，未涉及漢源花椒的不同加工產品和貯藏不同時間后的材料，所以僅適合用于當季原料的鑒定。對不同加工工藝下漢源花椒制品和長期貯藏花椒原料中的揮發物質成分分析及產地鑒定尚待研究。

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[ 本文編校：聞 麗]

基金項目：四川省科技廳基本科研業務費項目（23JDKY06）；國家現代農業產業技術體系四川花椒創新團隊（SCCXTD-2024-23）；雅安市創建國家現代產業科技創新中心“揭榜掛帥”項目（kczx2023-2025-20）。