FN-EDA在稽留流產患者絨毛組織中的表達與微血管密度的相關性研究

［摘要］目的分析稽留流產患者絨毛組織中纖粘連蛋白可變性剪切片段（FN-EDA）表達量與微血管密度的相關性。方法納入深圳市龍華區婦幼保健院2022年1月至2023年8月收治的稽留流產患者46例為研究組，隨機選取同期人工流產患者46例為對照組。采集研究對象的絨毛組織標本，檢測FN-EDA表達量及微血管密度；比較兩組研究對象的FN-EDA表達量與微血管密度的差異；分析FN-EDA表達量與微血管密度的相關性；采用受試者工作特征曲線分析FN-EDA表達量預測稽留流產的價值。結果研究組與對照組絨毛組織FN-EDA全部為陽性，其中研究組（＋＋＋）占比（8.70%）低于對照組（82.61%），差異有統計學意義（χ2＝64.061，P＜0.001）；研究組和對照組FN-EDA光密度值分別為0.106±0.044、0.224±0.079，微血管密度分別為8.74±0.801、13.30±2.346，差異有統計學意義（t值分別為-8.909、-17.960，P＜0.001）；FN-EDA光密度值與微血管密度呈正相關（r＝0.474，P＜0.001）；FN-EDA光密度值預測稽留流產曲線下面積（AUC）為0.934，靈敏度為0.804，特異度為0.935，最佳臨界值為0.146；微血管密度預測稽留流產AUC為0.972，靈敏度為0.913，特異為0.957，最佳臨界值9.218。結論稽留流產者絨毛組織FN-EDA陽性表達量低于人工流產者，FN-EDA光密度值與微血管密度正相關，FN-EDA表達量對預測稽留流產有較高價值。

［關鍵詞］纖粘連蛋白；稽留流產；絨毛組織；微血管密度；人工流產

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2025.04.010

［中圖分類號］R714.21［文獻標識碼］A［文章編號］1673-5293（2025）04-0065-06Expression of FN-EDA in villous tissue of missed miscarriage patients and

its correlation with microvascular density

MEI Juanjuan，QIN Hong，LI Yanhua

（Department of Pathology，Shenzhen Longhua District Maternal and Child Health Hospital，

Guangdong Shenzhen 518172，China）［Abstract］ Objective To analyze the correlation between the expression of fibronectin variable splice fragment （FN-EDA） and microvascular density in the villous tissues of patients with missed miscarriage. Methods A total of 46 patients with missed miscarriage admitted to Shenzhen Longhua District Maternal and Child Health Hospital from January 2022 to August 2023 were enrolled as the study group，and 46 patients with induced abortion during the same period were randomly selected as the control group.The villous tissue samples of the study subjects were collected to detect the expression of FN-EDA and the density of microvessels.The differences in FN-EDA expression and microvascular density between the two groups were compared.The correlation between FN-EDA expression and microvessel density was analyzed.The receiver operating characteristic curve was used to analyze the value of FN-EDA expression in predicting missed miscarriage. Results The FN-EDA of villus tissue in the study group and the control group was all positive，and the proportion of villus tissue in the （＋＋＋） study group （8.70%） was lower than that in the control group （82.61%），and the difference was statistically significant （χ2＝64.061，P＜0.001）.The optical density of FN-EDA in the study group and the control group were 0.106±0.044 and 0.224±0.079，and the microvessel density were 8.74±0.801 and 13.30±2.346，respectively，with statistically significant differences （t values were -8.909 and -17.960，P＜0.001，respectively）.The FN-EDA optical density value is positively correlated with microvascular density （r＝0.474，P＜0.001）.The area under the curve （AUC） of FN-EDA optical density value for predicting the area under the curvemissed miscarriage was 0.934，the sensitivity was 0.804，the specificity was 0.935，and the optimal critical value was 0.146.The AUC of microvessel density in predicting missed miscarriage was 0.972，the sensitivity was 0.913，the specificity was 0.957，and the optimal cutoff value was 9.218. Conclusion The positive expression level of FN-EDA in the chorionic tissue of missed miscarriage patients is lower than that of induced abortion patients，the FN-EDA optical density value is positively correlated with microvascular density，and the expression level of FN-EDA has high value in predicting missed abortion.

［Key words］ fibronectin;missed miscarriage;villous tissue;microvascular density;induced abortion稽留流產是指胚胎或胎兒已死亡但長期稽留于宮腔內，可導致孕婦感染、大出血及凝血功能障礙等嚴重后果，嚴重危害孕婦健康［1］。目前稽留流產的誘發機制尚不完全明確，且缺乏有效的預測手段，已有研究表明其發生與基因缺陷、母體疾病、免疫功能異常等因素密切相關［2-3］。纖粘連蛋白（fibronectin，FN）是一種在創傷愈合、胚胎發育及免疫功能中起關鍵作用的高分子量糖蛋白，其序列中可變性剪切片段（extra domain A，EDA）能夠增強FN對細胞分化、遷移及增殖的功能，且在胚胎發育過程中對脈管系統和血管細胞的發育至關重要，EDA片段的表達可能成為稽留流產的重要生物標志物［4］。因此，本研究旨在分析稽留流產患者絨毛組織中FN-EDA的表達量，并探討其與微血管密度之間的相關性，以期為稽留流產的預測提供依據。

1材料與方法

1.1研究對象

納入深圳市龍華區婦幼保健院2022年1月—2023年8月收治的稽留流產患者46例為研究組，隨機選取同期本院收治的正常早孕自愿終止妊娠人工流產的患者46例為對照組。

納入標準：①孕6～12周；②年齡20～30歲；③近兩年月經規則；④妊娠期間無明顯的感染史；⑤無保胎治療史；⑥研究組符合《早期妊娠稽留流產治療專家共識》中的稽留流產診斷標準［5］：未見胎心博動，或宮腔內妊娠囊平均直徑≥25mm未見胚胎，或宮腔妊娠未見卵黃囊且2周后仍未見胎心博動，或宮腔內妊娠可見卵黃囊但11天后仍未見胎心博動；⑦患者生殖器解剖結構正常；⑧對照組妊娠囊大小與孕周天數相符合，超聲檢查可證實胚胎存活。排除標準：①母體患者有肝、腎、心、腦等重要器官疾病者；②母體孕早期有毒物、射線接觸史、家族遺傳史等；③合并惡性腫瘤疾病及血液、免疫系統疾病者。本研究經深圳市龍華區婦幼保健院醫學倫理委員會批準（批號：202261618）。

1.2標本采集與處理

兩組患者均采用負壓吸宮術取出孕產物，無菌采集胎盤絨毛組織標本，剔除標本血塊，采用生理鹽水漂洗至樣本無血色，采用10%甲醛固定，常規石蠟包埋待檢。

1.3 FN-EDA檢測

檢測方法：連續切片，切片厚度5μm，脫蠟水化，PBS沖洗，甲醛固定20～30min，室溫孵育5min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，加入小鼠抗人波形蛋白抗體（以色列Prospec，貨號：ANT-245），免疫組織化學法染色，4℃冰箱孵育12h，PBS漂洗后加入羊抗小鼠免疫球蛋白抗體（以色列Prospec，貨號：1010-04），室溫孵育30min，滴加顯色試劑顯色1min。脫水封片后，400倍光鏡鏡檢并攝影，2名高年資醫師采用雙盲法獨立讀片。

半定量判定：鏡檢隨機選取10個視野，根據細胞胞核、胞漿染色強度，著色為陽性細胞，根據著色強度和陽性細胞百分比，參照既往研究計分方法計分，不著色計0分、淺黃計1分、棕黃計2分、棕褐計3分；著色為陽性細胞，視野內陽性細胞占比≤5%計0分、5%＜陽性細胞≤25%計1分、25%＜陽性細胞≤50%計2分、陽性細胞＞50%計3分［6］。著色強度計分與陽性細胞百分比計分兩者相乘為FN-EDN半定量檢測判定結果，取10個視野平均值。乘積為0分FN-EDA檢測為陰性（-），1分及以上為陽性，1～2分為（＋）、3～4分為（＋＋）、5分及以上為（＋＋＋）。

定量判定：采用HMIAS-2000圖像分析系統進行定量分析，采用光密度值代表染色強度，光密度值越大染色越強。每張切片隨機選取10個鏡檢視野，由軟件自動計算得出光密度值，取10個視野光密度值平均值。

1.4微血管密度檢測

連續切片，5μm厚度，脫蠟水化，PBS沖洗，溫孵育5min后PBS沖洗，羊血清封閉液孵育，加入1∶100濃度CD34于4℃冰箱孵育12h，PBS沖洗，加入羊抗免二抗（以色列Prospec，貨號：111-035-003）室溫孵育30min，辣根過氧化物酶顯色。脫水封片后，200倍光鏡鏡檢并攝影，2名高年資醫師采用雙盲法獨立讀片。

結果判讀：參考Weidner標準［7］計算微血管密度，選取10個200倍下視野，計算微血管染色數目，取10個視野平均值。

1.5統計學方法

采用SPSS 26.0軟件統計分析。以例數（百分數）［n（%）］表示計數資料，行卡方檢驗觀察組間是否存在差異；以均數±標準差（x-±s）表示符合正態分布的計量資料，行獨立樣本t檢驗觀察組間是否存在差異；以中位數和百分位數表示偏態分布的計量資料，行秩和檢驗觀察組間是否存在差異；采用相關性分析探索FN-EDA表達量與微血管密度的關系；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，探索FN-EDA表達量對稽留流產的診斷預測價值。P＜0.05為有統計學意義。

2結果

2.1兩組患者一般資料

表1為兩組患者一般資料，兩組患者年齡、孕周、體重指數、孕次、產次、孕囊直徑、頂臀長、胚芽長度差異均無統計學意義，t值于-0.834～0.775之間，P＞0.05。

2.2兩組患者FN-EDA表達及微血管密度比較

表2為兩組患者絨毛組織中FN-EDA表達及微血管密度比較結果。兩組患者FN-EDA全部為陽性，在陽性分布上差異有統計學意義，其中研究組（＋＋＋）占比（8.70%）低于對照組（82.61%），χ2＝64.061，P＜0.05；研究組FN-EDA光密度值、微血管密度低于對照組，差異有統計學意義，t＝-8.909、-17.960，P＜0.05。

圖1為稽留流產患者與人工流產患者絨毛組織FN-EDA染色結果。稽留流產患者與人工流產患者絨毛組織均可見棕黃、棕褐著色，但人工流產患者著色更強，陽性細胞占比高于稽留流產患者（放大倍數為10×10）。

圖2為稽留流產患者與人工流產患者絨毛組織微血管染色結果。稽留流產患者絨毛組織微血管染色數目低于人工流產患者（放大倍數為10×10）。

2.3 FN-EDA表達量與微血管密度相關性

表3為兩組患者FN-EDA光密度值與微血管密度相關性分析結果。FN-EDA光密度值與微血管密度呈正相關，r＝0.474，P＜0.001。

2.4 FN-EDA表達及微血管密度對稽留流產的預測價值

圖3、表4為FN-EDA光密度值及微血管密度預測稽留流產發生的ROC曲線分析結果。FN-EDA光密度值預測曲線下面積為0.934，靈敏度0.804，特異度0.935，最佳臨界值0.146；微血管密度預測曲線下面積為0.972，靈敏度0.913，特異度0.957，最佳臨界值9.218，均有較高的預測價值。兩項聯合預測，任意一項陽性時預測靈敏度1.000，特異度0.826，誤診率較高；兩項均為陽性預測靈敏度0.891，特異度1.000，漏診率較高。

3討論

3.1稽留流產患者絨毛組織FN-EDA表達及微血管密度特征

目前有關孕婦絨毛組織FN的研究，多集中于FN類型及定性測定，未見關于孕婦絨毛組織中FN-EDA表達量的相關研究。Tran等［8］研究發現，FN的EDA片段僅見于組織型纖維連接蛋白中，在大多數成熟的正常組織中一般不存在，多見于胚胎組織、惡性腫瘤組織FN中。本研究證實上述研究結果，稽留流產患者與人工流產者中FN-EDA均為陽性表達，提示FN-EDA參與了胚胎組織的增殖。但稽留流產患者FN-EDA陽性表達量低于人工流產者，FN-EDA表達量過低或是稽留流產發生的相關因素之一。

胎盤組織微血管對胚胎的正常發育至關重要，胎兒生長發育依賴胎盤獲取營養物質［9］。植枝福等［10］研究發現，稽留流產患者中絨毛組織的微血管密度低于人工流產者平均水平，這一結果在Arpita等［11］的研究中得到證實，稽留流產患者胎盤血管網絡發育不良，微血管密度偏低。本研究與上述研究結果一致，稽留流產組患者絨毛組織微血管密度為8.74±0.801，人工流產患者絨毛組織微血管密度為13.30±2.346，稽留流產患者平均水平低于人工流產患者，微血管密度過低或是稽留流產發生的相關誘因。

3.2微血管密度與絨毛組織FN-EDA表達量的相關性

絨毛組織微血管發育受多種生長因子及基因的影響，目前未見關于FN-EDA表達量與絨毛組織微血管密度相關性的研究報道。Longstreth等［12］研究中發現，FN-EDA有促進細胞鋪展與遷移的作用，在肝纖維化發生過程中有促進內皮細胞的血管增生功能。楊姍姍等［13］研究指出，FN-EDA在血管增生和血管重構中具有促進作用。本研究結果顯示，絨毛組織微血管密度與FN-EDA光密度值呈正相關關系，這一結果或可提示FN-EDA參與了絨毛組織微血管生長，FN-EDA片段含量過低是絨毛組織微血管發育不良的相關因素。在孕早期胎盤血管網建立時，FN參與了絨毛組織分化重塑為微血管網的過程，EDA片斷具有促進細胞增殖建立微血管網的功能，FN-EDA過低時，會導致胎盤微血管網分化建立過程中受到阻礙，導致胎盤微血管發育不良［14-15］。

3.3 FN-EDA表達量及微血管密度對稽留流產的預測價值

目前，未見關于FN-EDA表達量與稽留流產相關性的研究，僅見FN與分娩關系的相關報道。Asiegbu等［16］研究中發現，早產孕婦相較于正常孕婦，陰道分泌物中的FN濃度顯著升高，FN高表達可提示早產風險。李小葉等［17］研究發現，FN陰性表達提示早產危險較低。但本研究中，提示FN-EDA低表達提示有更高的稽留流產風險。分析其原因，與本研究和上述研究所采集的標本來源不同有關。上述研究采集陰道分泌物標本，當發生羊膜破裂、絨毛膜剝離等原因時，FN進入陰道分泌物中，導致早產及自然流產孕婦FN水平高于正常孕婦［18］。而本研究使用孕產物采集胎盤絨毛組織標本，FN-EDA片段非來自于羊膜破裂、羊膜炎等原因所致的異常溢出。

早期流產篩查相關研究報道顯示，超聲檢測、凝血指標、D-二聚體及孕酮等激素檢測對篩查早期流產有較高的價值［19-20］。但上述指標大多作為結局指標，提示受檢者近期的流產風險或診斷是否已發生稽留流產。本研究結果顯示，絨毛組織中的FN-EDA及微血管密度預測稽留流產的均有較高的靈敏度和特異度，可作為稽留流產的標志物，稽留流產的發生或與FN-EDA表達量、微血管密度過低相關。分析其原因，絨毛組織是胎兒血液與母血進行物質交換的場所，是胎兒正常發育的關鍵［21］。絨毛微血管密度不足可導致胎兒無法從母血中獲取足夠的氧、營養物質及免疫因子等必需物質，導致胎兒發育受限甚至死亡，造成死胎、流產等不良結局［22］。而在FN-EDA除了與胎盤微血管網的發育相關外，還有助于胎盤和子宮間的緊密結合。本研究結果提示，早期流產及稽留流產或與絨毛組織的FN-EDA表達量、微血管密度偏低相關，通過絨毛組織FN-EDA表達量、微血管密度篩查或可預測稽留流產風險，并為預防治療稽留流產提供參考。

綜上所述，FN-EDA在稽留流產與人工流產者絨毛組織中為陽性表達，稽留流產者絨毛組織FN-EDA陽性表達量低于人工流產者，絨毛組織微血管密度與FN-EDA表達量顯著正相關，FN-EDA過低可導致胎盤微血管系統發育不足，胚胎無法獲取足夠的營養，導致稽留流產的發生。FN-EDA表達量過低對稽留流產風險有提示作用，對稽留流產的預測有較高價值。本研究的局限性在于，稽留流產組的標本采集于已經發生稽留流產結局的患者，檢測的FN-EDA表達量和微血管密度僅能表征是否發生稽留流產，此外本研究樣本量小，兩個指標能否提前預測稽留流產風險及風險臨界值的確定還需要進一步展開前瞻性研究及多中心研究。

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［專業責任編輯：王麗］

［中文編輯：牛惠；英文編輯：李曉雪］