灰葡萄孢菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗性的AS-PCR快速檢測技術

摘要：

灰霉病是一種由灰葡萄孢菌引起、 果蔬上常見的真菌病害， 其發生對農業生產造成巨大損失。 由于二甲酰亞胺類殺菌劑（DCFs）的廣泛使用， 灰葡萄孢菌對其已經產生了抗藥性， 為快速檢測灰葡萄孢菌對DCFs抗性， 基于灰葡萄孢菌BOS1基因的點突變I365S和I365N， 建立了一種灰葡萄孢菌對DCFs抗性的等位基因特異性PCR（AS-PCR）快速分子檢測方法。 首先， 以BOS1基因為靶序列設計特異性引物， 然后對PCR體系的退火溫度、 內參引物與特異性引物濃度配比進行優化， 并對引物靈敏度和特異性進行評價， 最后利用快速抽提法提取田間病原菌DNA進行抗藥性檢測。 結果表明： 正向特異性引物I365S-7F、 I365S-8F和I365N-8F分別與引物I365-R結合組成的引物對可以檢測出I365S和I365N抗性菌株， 最適退火溫度分別為57 ℃、 58 ℃和58 ℃； 內參引物與特異性引物濃度比例為1∶2， 其靈敏度分別為7 ng/μL、 70 ng/μL和70 ng/μL， 并具有特異性； 利用NaOH裂解法快速提取田間菌株DNA進行抗藥性檢測， 其結果與測序結果一致。 以上結果說明該AS-PCR技術具有特異性強、 操作簡單等優勢， 可為田間灰葡萄孢菌對DCFs類抗性菌株的快速檢測提供一種較為可行的方法。

關"鍵"詞：灰葡萄孢菌； 二甲酰亞胺類殺菌劑； 等位基因特異性PCR； 抗藥性

中圖分類號：S436.631

文獻標志碼：A

文章編號：16739868（2025）04010112

Rapid Detection of the Resistance of Botrytis cinerea to

Dicarboximide Fungicides by AS-PCR

LIU Mengqing^1，2，"TU Zijuan^1，2，"YU Yang^1，2，"YANG Yuheng^1，2，

FANG Anfei^1，2，"TIAN Binnian^1，2，"WANG Jing^1，2，"BI Chaowei^{1， 2}

1."Yibin Academy of Southwest University， Yibin Sichuan 644000， China；

2."College of Plant Protection， Southwest University， Chongqing 400715， China

Abstract：

Gray mold is a common fungal disease in fruits and vegetables caused by Botrytis cinerea， which causes great losses to agricultural production． Due to the widespread use of dicarboximide fungicides （DCFs）， B."cinerea has developed resistance to this fungicide． In order to rapidly detect resistance of B."cinerea to DCFs， we developed an allele-specific PCR （AS-PCR） rapid molecular detection method for the resistance of B."cinerea to DCFs based on the point mutations I365S and I365N of BOS1 gene． First， we designed specific primers with BOS1 gene as the target sequence， then optimized the base mismatch， annealing temperature， the concentration ratio of internal reference primers and specific primers of PCR system， and evaluated the specificity and sensitivity of primers． Finally， we used rapid extraction method to extract DNA from field samples for detection and application． The results showed that the primer pairs composed of the forward specific primers I365S-7F， I365S-8F and I365N-8F respectively with reverse primer I365-R could distinguish the resistant and sensitive strains of I365S and I365N mutation， and the optimal annealing temperatures was 57 ℃， 58 ℃ and 58 ℃， respectively． The concentration ratio of internal reference primers and specific primers was 1∶2， the sensitivities were 7 ng/μL， 70 ng/μL and 70 ng/μL， respectively， and the amplifications were specific． The results of PCR detection with DNA extracted from field strains by NaOH lysis method were consistent with the sequencing results． In conclusion， AS-PCR technology has the advantages of strong specificity and simple operation， which provides a feasible and rapid detection method for monitoring the resistance of gray mold to DCFs kind of fungicides．

Key words：

Botrytis cinerea； dicarboximide fungicides； allele-specific PCR； drug resistance

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是一種典型的死體營養型病原菌， 引起的灰霉病是一種具有毀滅性的真菌病害， 其產孢量大、 寄主范圍廣泛， 植物整個生育期皆可發病， 低溫高濕條件下灰霉病加重， 可引起作物腐爛或幼苗死亡， 嚴重威脅果蔬等重要經濟作物的產量和質量^［1-2］。

目前防治灰霉病主要以化學防治為主， 常用的殺菌劑有苯并咪唑類、 二甲酰亞胺類、 苯胺基嘧啶類、 苯吡咯類、 琥珀酸脫氫酶抑制劑類等^［3-4］。 由于灰葡萄孢菌具有寄主范圍廣、 繁殖速度快、 遺傳變異強以及寄生適合度高等特點， 導致其在過去幾十年大量用藥情況下對多種作用機制的殺菌劑均產生了嚴重的抗性， 增加了抗藥性的風險^［5］。

1967年由日本公司研究發現二甲酰亞胺類殺菌劑（Dicarboximide Fungicides， DCFs）對灰葡萄孢菌具有良好的防治效果^［6］， 并在20世紀70年代首次引入中國市場^［7］， 主要包括異菌脲、 腐霉利和乙烯菌核利等。 但隨著該類藥劑的廣泛使用， 灰葡萄孢菌對其抗性問題日益嚴重。 據報道， 1979年德國和法國分別有近80%和60%的灰葡萄孢菌對該類藥劑產生抗性； 2021年， 巴西灰葡萄孢菌對異菌脲的抗性達到44%^［8］。 在中國各地都檢測到了高頻的DCFs抗性菌株^［9-10］， 2013年宋晰等^［9］研究表明在內蒙古、 遼寧等地采集的灰葡萄孢菌對腐霉利的平均抗性頻率均高達90%以上； 2018年， 杜穎^［10］發現遼寧對腐霉利抗性達到94%以上； 2021年， 四川灰葡萄孢菌對腐霉利抗性頻率達80%^［11］； 2022年， 江蘇灰葡萄孢菌對異菌脲抗性頻率達51.44%^［12］。

該類藥劑抗性機理可能是通過過度激活相關信號的傳導途徑造成甘油等滲透壓穩定劑在菌體內大量積累， 從而導致外部水的大量涌入造成細胞膨脹后死亡^［13］。 植物病原真菌抗藥性的產生大多是由特定基因的單核苷酸突變導致^［14-15］。 Orth等^［16］認為DCFs抗性是由單基因控制的， 其靶標位點可能與雙組份組氨酸激酶（TCHK）有關， 真菌中雙組分組氨酸激酶通常由5～6個重復HAMP區域、 HisKA、 HATPase、 REC等結構域組成， 但該類藥劑與靶標位點的精確作用機理尚不明確^［17-19］。 灰葡萄孢菌雙組分組氨酸激酶信號途徑中包括雙組分組氨酸激酶BOS1、 反應調控蛋白BRRG-1、 促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedProteinKinase， MAPK）BOS2和MAPK的激酶BOS4、 BOS5等重要元件， 但僅雙組分組氨酸激酶BOS1對DCFs抗性起作用^［20］。 目前， 很多研究者認為雙組分組氨酸激酶BOS1基因保守區域HAMP點突變導致灰葡萄孢對該類殺菌劑抗性的產生。 通過對比不同國家中采集的灰葡萄孢菌DCFs抗性和敏感菌株的DNA序列， 發現抗性菌株中分別存在BOS1基因365位或369位氨基酸替換^［21-22］； Banno等^［23］和Ma等^［24］研究者也表明BOS1上I365SV、 V368F、 Q360P和Q396H點突變與DCFs抗性有關。 除該基因點突變外， 其他抗性機制也可能會導致抗藥性產生（如鏈格孢菌^"［25］"）， 但這種機制目前還未在灰葡萄孢菌中有相關報道。 現已報道的BOS1上存在的點突變有I365N/R/S、 Q369P/H、 V368F、 N373S和T447S等， 其中 365、 369、 373 位氨基酸的突變最為常見， 這些突變會使HAMP區域的空間構象發生改變從而導致灰霉病菌對DCFs產生不同水平的抗性^［26-27］。 研究結果顯示， 重慶地區灰葡萄孢菌對DCFs抗性BOS1^I365S、 BOS1^I365N點突變占主導地位， 比例分別為37.5%和52.1%^［28］。

及時了解和發現地區抗藥性發展情況， 可根據結果更改用藥策略， 因此掌握病原菌抗藥性的快速檢測方法也顯得尤為重要。 檢測殺菌劑抗性的傳統方法包括菌落直徑法、 孢子萌發法、 抑菌圈法和最低濃度抑制法等^［29-34］， 但此類方法檢測周期長、 操作繁瑣、 效率低。 分子檢測方法具有簡單、 快速和通量高等優點。 等位基因特異性PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR， AS-PCR）就是一種高通量檢測單核苷酸突變的分子技術， 該方法操作簡單、 特異性強、 成本相對較低， 只需要PCR儀和瓊脂凝膠電泳即可完成檢測。 如Ma等^［35］、 羅梅等^［36］和郭東鋒等^［37］利用AS-PCR技術分別成功檢測了白僵菌對苯并咪唑類殺菌劑、 桃褐腐病菌對多菌靈以及馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的抗性菌株。 本研究基于灰葡萄孢菌DCFs抗性突變靶標BOS1基因I365S和I365N點突變， 建立了能快速檢測抗性菌株的AS-CR技術并將其初步應用于田間抗性監測， 旨在實踐中對灰葡萄孢菌DCFs抗性群體進行動態監測。

1"材料與方法

1.1"供試菌株

灰葡萄孢菌BOS1^I365S點突變菌株CS3、 CS8、 H9和XM9， BOS1^I365N點突變菌株B1、 B31、 B32和XM5， 敏感菌株B05.10、 C25、 lp1和H4； 小麥赤霉病菌、 高粱炭疽病菌、 稻瘟病菌、 稻曲病菌、 核盤菌和木霉菌。

1.2"試驗方法

1.2.1"AS-PCR引物設計

從NCBI網站下載二甲酰亞胺類殺菌劑作用靶標雙組分組氨酸激酶的編碼基因BOS1（序列號： AF396827.2）， 并根據抗性菌株BOS1基因HAMP區域點突變I365S和I365N（突變位置見圖1）， 同時借助于軟件 primer premier 5.0完成引物設計， 對相應的突變方式分別設計相應的正向特異性引物， 將突變位點設計在正向引物的3，末端， 且在突變點前后1～2個堿基設計錯配進而提高引物的特異性， 引物序列如表1、 表2。 以CTAB法^［38］提取的灰葡萄孢敏感菌株和抗性菌株DNA為模板進行PCR擴增， 擴增PCR產物預期大小為526 bp。

1.2.2"AS-PCR反應退火溫度的確定

為明確10對引物是否可以區分敏感菌株和抗性菌株， 分別以敏感菌株B05.10、 BOS1^I365S點突變菌株CS3， BOS1^I365N點突變菌株B1的DNA為模板進行AS-PCR進行擴增， ddH₂O作為空白對照。 每組引物設置8個退火溫度（68 ℃、 67 ℃、 66 ℃、 63 ℃、 61 ℃、 58 ℃、 57 ℃和56 ℃）進行擴增。 反應體系： 2×Taq Master Mix 12.5 μL、 10 μmol/L正反向引物各1 μL、 DNA模板1 μL和ddH₂O補足至25 μL； 反應程序： 95 ℃預變性3 min； 95 ℃變性30 s， 退火30 s， 72 ℃延伸1 min， 共34次循環； 72 ℃終延伸10 min。 PCR反應后用1%瓊脂凝膠電泳并記錄結果。

1.2.3"多重AS-PCR特異性引物與內參引物濃度的確定

為避免假陰性出現， 本實驗特引入內參引物進行多重AS-PCR擴增。 內參引物選用真菌的通用ITS引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS86（5′-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3′）。 內參引物和特異性引物的濃度比例分別設置為1∶1、 1∶2、 1∶4和1∶5， 即特異性引物濃度為10 μmol/L， 內參引物濃度分別為10 μmol/L、 5 μmol/L、 2.5 μmol/L和2 μmol/L。 反應體系同1.2.2， 程序中退火溫度為最適退火溫度。

1.2.4"多重AS-PCR反應體系特異性的檢測

為評價引物的特異性， 分別選擇小麥赤霉病菌、 高粱炭疽病菌、 稻瘟病菌、 稻曲病菌、 核盤菌、 木霉菌以及灰葡萄孢菌標準菌株B05.10和抗性菌株（CS3和B1）DNA作為模板， 反應體系和程序同1.2.3。

1.2.5"多重AS-PCR反應體系靈敏度的檢測

將提取的抗性菌株DNA模板梯度稀釋為原濃度的10⁰、 10^-1、 10^-2、 10^-3、 10^-4、 10^-5和10^-6。 得到7個DNA濃度梯度進行AS-PCR反應靈敏度檢測， 反應體系和程序同1.2.3。

1.2.6"AS-PCR檢測體系的驗證

本研究采用灰葡萄孢菌菌株進行檢測體系的驗證， 即BOS1^I365S（CS8、 H9和XM9）和BOS1^I365N（B31、 B32和XM5）點突變菌株和敏感菌株（C25、 lp1和H4）的DNA為模板， 反應體系和程序同1.2.3。

1.2.7"AS-PCR檢測體系田間應用

本研究利用在重慶市北碚區本勛農業園（106.44°E， 29.76°N）采集的草莓灰霉病病果， 挑取病果表面的菌絲和孢子， 采用NaOH裂解法^"［39］直接快速提取病原菌DNA， 反應體系中DNA量相應改為5 μL， 其他成分和反應程序同1.2.3。 將AS-PCR檢測結果為陽性的部分菌株PCR擴增的BOS1基因產物送至上海生物工程有限公司測序， 將測序結果翻譯成蛋白序列與NCBI中標準菌株B05.10用DNAMAN軟件進行氨基酸比對。

2"結果與分析

2.1"AS-PCR特異性引物

利用上述根據突變位點設計的引物， 分別以BOS1^I365S點突變菌株CS3、 BOS1^I365N點突變菌株B1和敏感菌株B05.10的DNA為模板進行PCR擴增， 引物對I365-7F/I365-R和I365S-8F/I365-R均只能在以BOS1^I365S點突變菌株為模板情況下擴增出條帶（圖2a、 2b）； 引物對I365N-8F/I365-R也僅在以BOS1^I365N點突變菌株為模板情況下才能擴增出條帶（圖2c）。 說明篩選過的這3組引物可區分敏感和抗性菌株， 由此， 選擇這3組引物進行后續試驗。

2.2"最適的退火溫度

以BOS1^I365S點突變菌株CS3、 BOS1^I365N點突變菌株B1和敏感菌株B05.10為模板， 在不同退火溫度下進行擴增， 電泳檢測結果如圖2。 引物對I365S-7F/I365-R和I365N-8F/I365-R在退火溫度為56～68 ℃時均能擴增出條帶（圖2a、 2c）， 引物對I365S-8F/I365-R在退火溫度為56～61 ℃時擴增出條帶（圖2b）， 且圖2a中16泳道、 b和c中15泳道條帶最亮， 最終確定引物對I365S-7F/I365-R退火溫度為57 ℃、 I365S-8F/I365-R和I365N-8F/I365-R退火溫度為58 ℃。

2.3"多重AS-PCR內參引物濃度

真菌通用引物為ITS1/ITS4， 但由于該組引物擴增出的內參片段大小與目標片段差距不大， 在利用凝膠電泳進行檢測時無法區分目標片段與內參片段。 所以本研究選用ITS4/ITS86作為內參引物， 并利用該組通用引物與特異性引物進行多重AS-PCR擴增。 當特異性引物與內參引物濃度比例為4∶1時， 敏感菌株擴增出的內參條帶較微弱， 但當比例為2∶1時， 敏感和抗性菌株內參條帶擴增條帶較亮且更加穩定（圖3）。 因此， 最終確定內參引物與特異性引物濃度比例為1∶2， 即內參引物濃度為5 μmol/L。

2.4"多重AS-PCR的特異性

本研究選用不同真菌以及灰葡萄孢標準菌株B05.10和抗性菌株（CS3和B1）對該體系的特異性進行評價， 分別以該菌株為模板進行PCR擴增， 結果如圖4所示， 其a、 b和c分別對應引物對I365S-7F/I365-R、 I365S-8F/I365-R和I365N-8F/I365-R， 只有抗性菌株能夠擴增出特異性和內參2種條帶， 其他真菌均只能擴增出內參條帶， 說明該體系具有特異性。

2.5"多重AS-PCR的靈敏度

將抗性菌株模板（70 ng/μL）梯度稀釋后進行擴增， 電泳結果見圖5， a中引物對I365S-7F/I365-R可在稀釋度10^-2時擴增出特異性條帶， b和c中引物對I365S-8F/I365-R和I365N-8F/I365-R可在稀釋度為10^-1時擴增出特異性條帶， 即引物對I365S-7F/I365-R、 I365S-8F/I365-R和I365N-8F/I365-R的靈敏度分別為0.7 ng/μL、 7 ng/μL和7 ng/μL。

2.6"驗證AS-PCR檢測體系

本研究首先選用3株敏感菌株（C25、 lp1和H4）和6株分別為I365S（CS8、 H9和XM9）、 I365N（B31、 B32和XM5）突變方式的抗性菌株來檢測這4組引物特異性穩定性。 如圖6所示， a、 b和c分別對應引物對I365S-7F/I365-R、 I365S-8F/I365-R和I365N-8F/I365-R， 3組引物在以抗性菌株為模板的情況下均能擴增出2條帶， 在以敏感菌株為模板的情況下只能擴增出1條帶， 說明該體系能夠區分抗性和敏感菌株。

2.7"田間應用AS-PCR檢測體系

將田間采集的樣本取樣57個并粗提DNA為模板進行PCR檢測， 發現其中13個樣本可在I365S檢測體系中檢測出2條PCR產物（圖7a-7c）， 抗性菌株比例為22.8%； 22個樣本可在I365N檢測體系中檢測出2條PCR產物（圖8a-8c）， 抗性菌株比例為38.6%， 說明這些樣本中可能分別含有I365S和I365N突變方式抗性菌株。 然后擴增比對AS-PCR檢測為陽性的部分菌株的BOS1基因， 確證其抗性突方式分別為I365S（圖7e）和I365N（圖8e）。 以上結果說明本AS-PCR檢測體系可以快速準確地應用于田間灰葡萄孢菌二甲酰亞胺殺菌劑抗性。

3"結論與討論

由于缺少優良的抗病品種， 目前灰葡萄孢菌主要以化學防治為主。 二甲酰亞胺類殺菌劑（Dicarboximide Fungicides， DCFs）于20世紀70年代引入中國， 隨著該藥劑的廣泛使用， 近些年在中國江蘇^［12］、 四川^［11］、 遼寧^［40］等地區都檢測到了高頻的DCFs抗性菌株。 抗性檢測技術的建立是防治的基礎， 為能夠及時了解地區抗性發展情況調整用藥策略， 建立抗性檢測技術是非常必要的。

傳統抗性檢測方法用時較長、 工作量大、 試驗條件嚴格。 隨著分子生物學技術的發展， 許多現代分子技術在抗藥性檢測中得到了很好的應用， 特別是基于PCR的檢測技術， 如實時熒光定量、 高分辨率溶解曲線法、 雙雜交探針法和限制性片段長度多態性等， 但這些方法應用儀器精密度高、 價格昂貴且步驟繁瑣， 并不適用于田間應用。 等位基因特異性PCR技術具有操作簡單、 過程開蓋次數少而污染概率低、 特異性強、 成本相對低（只需要一臺PCR儀和一對特異性引物即可實現檢測）、 時間相對快速等優點， 已經有許多研究者利用該技術成功檢測出抗藥性菌株， 如Muoz等^［41］、 Yin等^［42］和Oshima等^［22］分別成功利用該技術檢測了灰葡萄孢菌苯對苯并咪唑類、 琥珀酸脫氫酶抑制劑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑抗性菌株。 但國內外尚沒有應用該技術檢測灰葡萄孢菌對DCFs抗性的報道。

前期研究發現， 重慶地區灰葡萄孢菌DCFs抗性菌株中BOS1^I365N（52.1%）和BOS1^I365S（37.5%）點突變占比較大^［28］， 因此， 本研究建立的多重AS-PCR檢測體系對于監測灰葡萄孢菌對DFCs抗性頻率具有較好的應用價值。

本研究成功建立了可快速檢測灰葡萄孢菌對DCFs抗性的AS-PCR技術， 最終確定為3組引物I365S-7F/I365-R、 I365S-8F/I365-R和I365N-8F/I365-R可分別特異性區分BOS1^I365S和BOS1^I365N點突變菌株， 并對反應條件和反應體系進行優化， 提高了該檢測技術的特異性和擴增效率， 最后應用于田間樣本快速檢測， 證明該方法可行。

在引物設計時， 需在突變點前后1～2個堿基進行錯配^［43］， 是因為DNA聚合酶理想情況下需要在引物與模板完全匹配的情況下才能順利擴增， 但實際情況中引物3，末端與模板不互補也能實現延伸擴增。 錯配不同會影響最終擴增效率和特異性， 如羅梅等^［36］在進行引物篩選時， 引入G-A錯配時無法區分敏感和抗性菌株， 但G-C錯配可實現區分且擴增較穩定， 當錯配2個堿基時擴增效率低。 本研究中G-C錯配可很好地實現區分， 且錯配為2個堿基AA-TG時也可明顯區分且擴增效率尚可， 說明建立檢測體系可能因引物靶標序列和引物長度的不同具有差異性， 所以在建立檢測體系時需要根據具體靶標來設計錯配并經過重復試驗反復驗證， 從而篩選出能夠特異性檢測出抗性菌株的引物對。

為保證試驗數據的可靠性， 引入內參引物進行多重AS-PCR， 可選擇真菌通用引物^［37］或其他非靶標基因^{［36，44］}。 本研究選用前者， 常用引物對為ITS1/ITS4， 該內參引物在灰葡萄孢菌中擴增產物與特異性引物擴增產物相差小， 電泳無法區分， 通過ITS區內參引物篩選， 最終確定ITS4/ITS86引物作為內參進行多重PCR。 內參引物的引入可以很好地排除假陰性的干擾， 且節約了試劑、 DNA模板等原料。 但由于不同引物在同一體系中同時擴增存在模板和試劑競爭， 所以在多重PCR擴增過程中需要調節特異性引物和內參引物濃度比例。 本研究發現特異性引物和內參引物的比例為4∶1時條帶較淺， 且由于人工操作重復加入的每個相同體系時存在的誤差會導致該引物擴增不出產物， 所以最終選擇特異性引物和內參引物ITS4/ITS86濃度比例為2∶1。

特異性檢測表明， 該檢測技術可以準確地從同種或不同種群體中檢測到DCFs抗性菌株， 具有很高的特異性。 為能夠更貼近田間實際應用， 將CTAB大量精提DNA的方法替換為少量粗提的NaOH裂解法， 將田間菌株在不進行分離純化情況下粗提DNA作為模板進行PCR檢測， 擴增出特異性條帶的菌株為BOS1^I365S、 BOS1^I365N點突變， 且該檢測結果與測序結果一致。 這簡化了病原菌DNA提取步驟， 縮短了操作時間， 使得檢測更加簡單快速。

Muoz等^［41］設計2對引物并成功檢測灰葡萄孢菌抗苯并咪唑類殺菌劑β-微管蛋白E198A點突變菌株。 每對引物其中1條為3，末端位于突變位點上的內引物， 兩條引物方向相反， 且分屬于不同基因型（突變序列與野生型）； 另外兩條為通用外引物， 且兩條引物與突變位點的距離不一樣。 這樣， 在反應過程中， 無論檢測模板為突變型或者野生型， 其擴增產物都為兩種， 但產物片段長度不一， 因此， 根據擴增出的片段長度即可辨別該菌株是否為突變型， 但該體系只能檢測1種突變方式。 目前， 本研究通過設計2對引物分別在2個體系內將BOS1^I365S和BOS1^I365N點突變菌株進行區分， 可采取上述Muoz等^［41］的方式同時加入內參引物， 即可在一個體系內排除假陰性干擾的情況下又能同時檢測2種突變方式。

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責任編輯"王新娟