利用基因組測序技術鑒定家蠶轉基因位點方法的建立

摘要：

建立一種基于基因組測序技術高效鑒定家蠶轉基因插入位點的方法， 并分析測序深度對位點鑒定準確性的影響， 從而為家蠶及其他物種利用基因組測序技術開展低成本、 高通量的轉基因位點鑒定提供參考。 首先， 采集兩份家蠶轉基因材料的蛹， 進行全基因組測序， 并經過質量控制篩選出高質量的測序后讀段（reads）。 以載體序列和家蠶基因組為參考， 經兩輪比對分析， 得到覆蓋基因組和載體的目標reads。 利用目標reads上的基因組序列在家蠶泛基因組數據庫中進行比對分析， 進而獲得插入位點的具體位置。 隨后， 運用Seqtk軟件對數據進行抽樣， 分析不同測序深度對位點鑒定準確性的影響。 兩份材料的基因組測序數據分別為9.76 G和11.18 G， 質控后讀段（clean reads）數量分別為32 639 026和37 394 695， 測序深度約為20×。 序列比對分析和聚合酶鏈式反應（PCR）實驗驗證結果顯示： TransGene_1的插入位點位于1號染色體1 899 494 bp與1 899 495 bp之間； TransGene_2的插入位點位于21號染色體959 510 bp與959 515 bp之間， 且插入位點均處于基因間區。 利用兩份轉基因材料的基因組測序數據進行不同測序深度的模擬分析， 發現轉基因材料TransGene_1在測序深度為6×時就能夠得到覆蓋兩側斷點的reads， 實現精確定位， 而TransGene_2則需要測序深度達到10×及以上才能實現精確定位。

關"鍵"詞：家蠶； 轉基因插入位點； 基因組測序； 測序深度； 轉基因鑒定

中圖分類號：S882

文獻標志碼：A

文章編號：16739868（2025）04011310

Establishment of A Genome Sequencing Method for

Identification of Transgenic Sites in Silkworm

ZHOU Ang，"JIANG Jingjing，"ZUO Weidong，"CHEN Xin，

TONG Xiaoling，"DAI Fangyin，"LI Chunlin

State Key Laboratory of Resource Insects， Southwest University/Key Laboratory of Sericultural Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Southwest University， Chongqing 400715， China

Abstract：

This study aims to establish a method for efficiently identifying transgenic insertion sites in silkworms through genome sequencing． It also analyzes how sequencing depth affects the accuracy of site identification， and provides a reference for low-cost， high-throughput transgenic site identification in silkworms and other species． Two silkworm transgenic materials were collected for whole genome resequencing． High-quality reads were selected through quality control． Target reads covering the genome and vector were obtained through two rounds of comparison analysis using the vector sequence and silkworm genome as references． The specific location of the insertion site was obtained by comparing the genome sequence in the target reads with the silkworm pan-genome database． Subsequently， we used the seqtk software to sample the data， and analyzed how different sequencing depths affected the accuracy of site identification． The genome sequencing data of the two materials were 9.76 G and 11.18 G， and the number of clean reads were 32 639 026 and 37 394 695， respectively， and the sequencing depth was about 20×． Sequence alignment analysis and PCR experimental verification results indicate that the insertion site of TransGene_1 is located between 1 899 494 bp and 1 899 495 bp on chromosome 1， while the insertion site of TransGene_2 is between 959 510 bp and 959 515 bp on chromosome 21． Both insertion sites were located in the intergenic region． Using the genome sequencing data of the two transgenic materials for simulation analysis under different sequencing depths， we found that the transgenic material TransGene_1 can obtain reads covering both breakpoints at a sequencing depth of 6×， achieving precise positioning， while TransGene_2 needs a sequencing depth of 10× or above to achieve precise positioning．

Key words：

silkworm； transgenic insertion site； genomic sequencing； sequencing depth； transgenic identification

栽桑養蠶是我國先民的偉大創舉， 有著超5 000年的歷史。 蠶桑產業作為我國特色優勢產業， 在脫貧攻堅進程中發揮了關鍵作用， 是當前鄉村振興的優勢特色產業之一。 培育高產且優質的蠶品種是推動養蠶業健康發展以及增加蠶農收入的重要根基。 基因編輯技術在農業育種方面的應用越發廣泛， 不僅為作物抗病性的改良給予了關鍵支撐， 還極大地推動了作物品質的提升^［1-2］。 在家蠶育種領域， 轉基因技術也被廣泛用于創制優質育種素材^［3-7］。 就轉基因素材來講， 明確其插入位點對其育種用途和推廣極為關鍵。 此外， 家蠶亦是重要的實驗動物， 基于家蠶展開的功能基因研究對理解昆蟲發育^［8］、 遺傳^［9］以及進化^［10］有著重要的參考價值。 轉基因技術同樣是功能基因研究的重要方式， 確定轉基因材料中目的片段的插入位點對明確目的基因的功能是不可或缺的。 所以， 構建高效、 精準的鑒定家蠶轉基因位點的方法對家蠶育種和功能基因的研究有著重大意義。

傳統上， 常用DNA印跡雜交^［11］確定轉基因材料中目的片段的拷貝數， 再通過以聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎的方法確定插入位點， 后者包括反向PCR、 交錯式熱不對稱PCR、 質粒拯救法、 外源接頭PCR以及Sanger測序等。 例如文獻［12］利用反向PCR方法成功找到Bt11轉基因玉米的側翼序列； 文獻［13］利用交錯式熱不對稱PCR方法成功分離了山藥Pal和Pgi基因的5，-側翼區域； 文獻［14］利用質粒拯救法成功在水稻中獲取到插入T-DNA序列。 然而， 這些基于PCR的鑒定方法往往過程繁瑣。 例如， 反向PCR方法需要將轉基因系基因組酶切處理并環化， 再經數輪巢式PCR擴增， 才可能鑒定到插入位點^［15］； 交錯式熱不對稱PCR方法需采用溫度梯度和不對稱的引物設計， 以增加擴增特異性^［16］； 質粒拯救法需使用限制酶對DNA進行處理， 并將其導入大腸桿菌內， 使用PCR篩選陽性菌落并測序^［17］。 其他方法也涉及較多關鍵中間環節， 使得傳統基于PCR的鑒定方法不僅檢測效率低、 對實驗人員技術要求較高， 且其成功率不高， 部分情況下需重復多次才能完成插入位點鑒定。 綜合來看， 傳統轉基因位點鑒定方法操作復雜、 特異性低， 且受連接效率、 退火溫度、 引物設計因素等限制^［18］。 隨著以轉基因技術為代表的分子育種技術的廣泛應用， 有必要在各物種中建立更高效、 更精準的轉基因位點鑒定方法。

近年來， 隨著高通量測序技術的普及， 個體基因組測序成本迅速降低， 使得利用基因組測序技術高效鑒定轉基因插入位點成為可能。 目前， 在擬南芥^［19-20］、 玉米^［21-22］、 大豆^［23-24］、 水稻^［25-26］、 小鼠^［27-28］、 豬^［29-30］、 花椒樹^［31］、 月季^［32-33］等的研究中皆有利用基因組測序技術進行轉基因位點鑒定的報道， 但在家蠶的研究中尚未有過相關研究和報道。

本研究利用全基因組測序技術， 對兩個轉基因家蠶品系的插入位點進行鑒定， 建立一套快速確定家蠶轉基因插入位點的方法。 此外， 還分析了測序深度如何影響插入位點檢測的準確性。

1"材料與方法

1.1"樣本與基因組測序

轉基因材料TransGene_1和TransGene_2是本實驗室前期構建的2個過表達家蠶品系。 TransGene_1： 利用同源重組的辦法， 將目的基因表達核連接到piggyBac-{3×P3-EGFP}載體上， 通過胚胎顯微注射技術注射至新產非滯育蠶卵（G0代）； 隨后， 飼養G0代至化蛾（G1代）， 并在G1代蟻蠶剛孵化時篩選復眼發出綠光的個體； 再飼養自交產生G2代， 逐代篩選， 最終獲得純合的轉基因過表達品系。 TransGene_2： 將目標基因與家蠶A4啟動子、 SV40終止子通過中間載體pSL1180構建表達核［A4-Gene-SV40］， 酶切回收表達核后與piggyBac-［3×P3-EGFP］載體連接； 再通過顯微注射技術將重組載體轉入家蠶非滯育卵（低溫催青卵）； 最后利用熒光顯微鏡篩選復眼有綠色熒光的G1代個體逐代自交飼育， 逐代篩選， 最終得到轉基因過表達品系。

使用TransGene_1和TransGene_2的蛹提取基因組DNA， 使用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒建立DNA文庫（百邁客生物科技有限公司）， 利用HiSeq X平臺進行雙端測序， 每條reads長150 bp。

1.2"數據處理

為了獲得高質量的基因組測序數據用于后續研究， 采取了以下步驟： ① 剔除N堿基含量超過5%的reads； ② 剔除質量值低于20且比例超過30%的reads。 第一輪比對選用插入序列為參考， 首先利用軟件BWA（Burrows-Wheeler-Alignment Tool）v0.7.17將clean reads比對至參考序列； 隨后， 使用軟件samtools v1.6^［34］對結果進行排序與篩選。 第二輪比對選用家蠶基因組Bomo_genome^［35］為參考基因組， 以第一輪比對結果為輸入進行比對， 同樣對結果進行排序與篩選。 使用結果中的部分reads提交至網站http： //silkmeta.org.cn/^［36］進行BLAST分析， 以獲得具體的插入位置。

1.3"準確性驗證

根據reads對比結果確定轉基因載體的插入方向， 拼接轉基因材料序列， 并設計引物加以確認（表1）。 引物設計原則如下： 設計3對引物， 其中2對為斷點檢測引物（即一條引物設計于基因組上， 另一條設計于載體（左臂或右臂））， 剩下一對為基因組檢測引物， 上下游均位于基因組上。 借助凝膠電泳情況以及PCR產物測序結果， 驗證插入位點鑒定的準確性。

1.4"測序深度依賴性檢測

利用軟件seqtk對雙端測序文件予以隨機抽取， 從而模擬不同深度的測序狀況， 隨機種子隨機生成， 每個深度設置11個重復。 本研究總共設置9個梯度， 模擬測序深度從2×至16×的情形。

2"結果與分析

2.1"插入位點鑒定策略與測序結果

本研究運用全基因組測序技術對家蠶轉基因的插入位點予以鑒定， 具體分為以下4個步驟（圖1）： 其一， 針對測序結果開展質量控制與過濾操作， 去除低質量以及不適于分析的測序結果， 留存clean reads以作后續分析之用。 其二， 于第一輪比對期間， 挑選帶有載體序列的reads， 將插入序列當作參考， 運用clean reads與之進行比對并對結果加以篩選。 經篩選后的結果可分為兩類， 一類是完全比對成功的reads； 另一類是僅有部分序列能夠比對上的reads， 此類reads又可細分為比對上左臂和比對上右臂兩種情況， 這兩種情況中的reads均為需要保留的reads。 其三， 在第二輪比對時， 篩選出與參考基因組存在部分相同序列的reads。 其四， 在實驗驗證步驟里， 利用與參考基因組比對上的最長部分進行序列對比操作， 確定插入位點， 并設計引物開展實驗驗證。

分析表明， TransGene_1的基因組測序總共獲取了約9.76 GB的數據， 其中包含32 639 026條clean reads， Q30達到98.02%。 TransGene_2的基因組測序共得到了約11.18 GB的數據， 涵蓋37 394 695條clean reads， Q30為97.95%。 這兩份材料的測序深度均約為20×（表2）， 測序質量均符合后續分析要求。

綠色短線代表基因組序列， 黑色短線為插入序列； 紅色箭頭為總長檢測引物， 對應下方第1、 2泳道結果； 藍色箭頭為斷點檢測引物， 對應后續泳道結果； PCR驗證結果中黑色部分代表陽性結果， 白色部分代表陰性結果。

2.2"插入位點定位及序列比對分析

依據本研究的插入位點定位策略， 初步判定轉基因品系TransGene_1的插入位點處于1號染色體的1 899 494 bp之處， 其插入方向為從同源右臂至同源左臂（圖2b）； 而轉基因品系TransGene_2的插入位點位于21號染色體的959 510 bp之處， 插入方向為從同源左臂至同源右臂（圖2c）。

為深入分析， 對轉基因材料的序列予以拼接和比對， 且統計了可與家蠶參考基因組比對的reads的長度。 在轉基因品系TransGene_1中， 最短堿基數為34 bp， 最長堿基數為105 bp， 平均堿基數為55.4 bp。 而在TransGene_2中， 最短堿基數為32 bp， 最長堿基數為118 bp， 平均堿基數為65.7 bp。 獲取具有可比對到家蠶參考基因組上的長堿基數的測序后讀段（reads）， 有助于保證此分析方法比對結果的準確性（表3）。

2.3"插入位點鑒定準確性驗證

為了驗證本實驗方法的準確性， 于轉基因品系TransGene_1中設計了3對引物加以驗證： 左臂斷點的擴增產物長度為304 bp， 右臂斷點的擴增產物長度為537 bp， 野生型家蠶預計僅擴增590 bp的基因組序列。 電泳結果表明： TransGene_1左、 右臂斷點產物的擴增長度和預期相符， 并且未擴增基因組序列， 這顯示該品系為轉基因純合型； 野生型家蠶僅擴增基因組序列， 未擴增左、 右臂斷點， 與預期一致（圖3a）。

在轉基因品系TransGene_2中， 同樣設計了3對引物來進行驗證， 結果與預期相符（圖3b）。 隨后， 對以上兩個轉基因品系的左、 右臂斷點擴增產物開展Sanger測序（圖3c、 圖3d）， 結果和之前拼接的序列一致， 驗證了本研究方案的準確性。

2.4"插入位點鑒定的深度依賴性分析

為深入探究測序深度對插入位點鑒定準確性的影響， 本研究按一定比例對clean reads進行隨機抽樣， 梯度設為2×、 4×、 6×直至16×， 對抽取的reads開展兩輪比對， 每個梯度重復11次， 以此模擬并比較不同測序深度下轉基因插入位點的鑒定效率（圖4）。

利用兩份轉基因材料（TransGene_1與TransGene_2）的全基因組測序數據， 對不同測序深度下轉基因材料插入位點的鑒定情況進行了模擬（表4）。 結果表明， 測序深度對插入位點的鑒定效果存在顯著影響。 測序深度為2×時， 兩份材料的未檢測率分別為40.4%與18.2%， 檢測率分別為36.4%和18.2%， 這表明此時鑒定效率較低。 測序深度為5×時， 兩種載體的未檢測率均降為0%， 檢測率分別提升至90.9%和72.7%， 這意味著在此測序深度下鑒定效率有較大提高。 測序深度為6×時， TransGene_1的鑒定率達到100%； 測序深度為10×時， TransGene_2的鑒定率也達到100%， 顯示在這兩個深度下鑒定效率分別達到最優。 所以， 本研究認為， 針對兩份轉基因材料插入位點的鑒定， 測序深度處于6×到10×之間， 即可確保鑒定的有效性。

3"討論與結論

3.1"轉基因位點鑒定

轉基因生物的安全性一直是備受關注的焦點， 涉及轉基因操作技術安全問題與轉基因產品安全性評估。 在這方面， 文獻［37］已對轉基因水稻可能給土壤質量和土壤生物帶來的影響進行了深入研究。 準確掌握轉基因插入位點， 對評估轉基因生物安全性極為關鍵。 本研究運用全基因組測序技術， 針對兩個前期構建的家蠶轉基因品系開展了插入位點定位及后續驗證工作。 序列分析結果表明： TransGene_1的插入位點位于1號染色體1 899 494 bp與1 899 495 bp之間； TransGene_2的插入位點位于21號染色體959 510 bp與959 515 bp之間， 這兩個插入位點均屬于基因間區。 具體來說， TransGene_1插入位點距離上游基因KWMTBOMO00059 1 173 bp， 距離下游基因KWMTBOMO00060 3 194 bp； TransGene_2插入位點距離上游基因KWMTBOMO12353 25 903 bp， 距離下游基因KWMTBOMO12354 30 067 bp。

本研究借助全基因組測序技術精確鑒定了兩個轉基因品系的插入位點， 并設計了檢測引物， 用于對轉基因品系插入位點進行準確分型。 這些檢測引物不但可用于轉基因品系的追蹤與鑒別， 而且可作為分子標記在其育種、 選育中發揮作用。

3.2"鑒定準確性對測序深度的依賴性分析

本研究在測序深度為20×時， 成功借助全基因組測序數據對插入位點予以鑒定， 這表明在此測序深度下能夠獲取同時包含載體與基因組序列的reads。 通常而言， 較高的測序深度可提升捕獲特定reads的概率^［38］， 但相應地會使測序費用與分析成本增加。 本研究探究了測序深度對位點鑒定準確性的影響。 利用現有數據開展不同深度的模擬測試， 結果顯示， 最低測序深度為6×時即可實現對插入位點的準確鑒定。 有趣的是， 本研究采用兩份數據進行相同的模擬測試， 然而另一份具有較多clean bases的材料卻需在測序深度為10×的條件下方能完成鑒定任務， 這或許是不同測序文庫及插入位點的保守性存在差異所致。

在將全基因組測序與生物信息學手段相結合進行分析時， 充足的高質量數據至關重要。 文獻［39］利用測序深度達182×的全基因組測序數據， 針對快速循環育種中的轉基因蘋果T1109開展轉基因插入驗證， 并與測序深度為167×的野生型蘋果進行比較， 結果表明在轉基因蘋果T1109中未檢測到意外的轉基因插入事件； 文獻［40］于測序深度為8×的轉基因小鼠中成功鑒定出Pmel-1 TCR α和β轉基因的基因組插入位點， 這與本研究得出的最低測序深度（6×）相近。 更高的測序深度能夠獲取更多的高質量數據， 在運用生物信息學手段進行分析時能得到更精確的結果， 但同時也可能致使假陽性結果增多。 文獻［41］對G2-6轉基因水稻進行了T-DNA插入位點鑒定， 在測序深度為70×時發現3條非水稻同源序列的reads， 并通過實驗證實這是由污染導致的假陽性。 所以， 在運用全基因組測序技術進行轉基因位點鑒定時， 應當結合物種特性以及插入基因的特點， 選取適宜的測序深度。

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責任編輯"廖坤