根系分泌物對漆酶誘導17β-雌二醇聚合轉移的影響及機制

摘要：以廣泛種植的玉米（Zea mays L.）為代表性農作物，選擇17β-雌二醇（E2）為環境中典型雌激素，采用批量平衡試驗方法，探究了玉米根系分泌物（M-REs）對云芝（Trametes versicolor）漆酶誘導E2轉化動力學、產物分布和植物毒性的影響及機制。結果表明：漆酶3 h內能夠轉化95%以上E2，其轉化動力學常數（k）為1.08 h-1。40～80 mg·L-1 M-REs抑制了漆酶誘導的E2轉化（k=0.82～0.96 h-1），而5～20 mg·L-1 M-REs對E2轉化表現出促進效果（k=1.14～1.45 h-1）。漆酶誘導E2轉化的可識別中間產物中不僅含有E2自聚合產物（如二聚體、三聚體和四聚體等低聚物），還包括大量E2和M-REs的共聚合產物（如E2與香草酸、阿魏酸、原兒茶酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的共二聚體）。隨著漆酶誘導聚合反應時間的延長，E2和M-REs中特定的小分子代謝物會產生高度復雜且具有多種功能基團的C C、C O C或C N C鍵結合的共沉淀聚合產物。研究表明，E2和M-REs共沉淀聚合產物不僅有效地緩解了E2對玉米種子的毒害作用，還刺激了玉米根的生長發育，漆酶誘導共聚合轉移有望為農作物根際雌激素的凈污和解毒提供新思路和途徑。

關鍵詞：玉米根系分泌物；真菌漆酶；17β-雌二醇；共聚合轉移；植物毒性

中圖分類號：X503.231 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2025）03-0806-09 doi：10.11654/jaes.2024-1145

17β-雌二醇（E2，lg Kow=3.94）作為內分泌干擾效應最高的雌激素，普遍地存在于環境中。生物體攝入過量的E2會導致其生殖系統紊亂，甚至引發遺傳變異和癌癥疾病[1]。隨著我國工農業的快速發展，日益增加的雌激素隨著城市污水排放、畜禽養殖廢水釋放和地表徑流等途徑進入農田生態環境，進一步增加了農作物的雌激素污染風險[2-4]。例如，玉米（Zea maysL.）和小麥（Triticum acstivnm L.）等農作物可以吸收環境中雌激素，并在根、莖葉和可食用部位儲存[5-6]。這些雌激素會隨著膳食攝入而到達人體中，進而干擾人類內分泌系統[1]。因此，如何減輕農作物中雌激素污染問題已引起了全球的廣泛關注。根際在農作物吸收、運輸及分配雌激素方面起到至關重要的作用[6-7]。根系分泌物能夠增強根際區域的污染物降解，進而調節農作物對雌激素的攝取和轉運[8-9]。根系分泌物中含有豐富的糖類、氨基酸和酚類等小分子代謝物，其中某些特定的代謝物可能改變雌激素在根際微域的命運，并影響雌激素的根際轉化和農作物對雌激素的攝取[10-11]。

生物炭吸附、芬頓氧化和微生物代謝是農作物根際有機污染物修復的傳統策略。然而，這些方法往往難以徹底去除有機污染物，且有著修復周期長、運營成本昂貴和使用條件苛刻等不可避免的缺陷[12-15]。生物酶作為一種簡單、綠色、環保、易操作的根際修復劑，它不僅可以高效地催化雌激素等多種有機污染物的氧化和去除，也有望促進環境中有機碳的聚合和腐殖化，生成具有刺激農作物生長發育的類腐殖質產品[16-18]。漆酶（EC 1.10.3.2）是自然界中廣泛分布的一種藍色含銅多酚氧化還原酶，該類酶對酚類和非酚類污染物均有很強的氧化效果[19-20]。漆酶在T1-Cu 位點引發底物的單電子氧化轉移，并快速地產生不穩定的活性自由基中間體；同時，氧氣在三核銅簇中心（T2-Cu/T3-Cu位點）被還原成水[19]。緊接著，這些活性中間體通過自聚合或共聚合途徑自發地相互連接，形成低溶解度和生物可利用性的聚合產物。該過程不僅有助于降低污染物的生物毒性，也可以增加環境中有機碳的存儲[10，17]。可見，漆酶誘導的雌激素聚合轉移反應有望消除農作物根際有機污染風險。盡管如此，農作物根系分泌物在漆酶調控雌激素聚合轉移中扮演何種角色仍不清楚。

本研究以全球廣泛種植的玉米為模式農作物，選擇具有高氧化還原電位（約760 mV）的云芝（Trametesversicolor）漆酶為催化劑、雌激素中毒性最高的E2為目標污染物，研究玉米根系分泌物（M-REs）中小分子代謝物對漆酶誘導E2 氧化和聚合轉移的影響及機制[21]。采用批量平衡試驗方法，探索M-REs 對漆酶誘導E2轉化動力學的影響；借助高分辨質譜（HRMS）檢測手段，鑒定漆酶誘導E2和M-REs中特定的小分子代謝物形成的主要中間產物，并定量地分析E2自聚合產物的時間變化趨勢；通過掃描電子顯微鏡（SEM）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和13C核磁共振（13C-NMR）等技術，表征E2自/共沉淀聚合產物的微觀形態、官能團和化學結構特性；利用小型盆栽試驗，評估E2和M-REs 共聚合產物對玉米種子發芽率和發芽指數（GI）的影響。研究結果有助于揭示漆酶誘導聚合轉移中E2和玉米根系釋放的小分子代謝物的互作機制，旨在為農作物根際雌激素污染的酶促凈污和解毒提供創新思路。

1 材料與方法

1.1 生物材料和化學試劑

玉米種子購自安徽省農業科學院。T. versicolor漆酶（淺褐色，活性≥0.5 U·mg-1）、E2（C18H24O2）、2，6-二甲氧基苯酚（DMP，C8H10O3）和Hoagland 培養液購自Sigma - Aldrich 試劑公司（上海）。色譜級甲醇（CH3OH）和乙腈（C2H3N）購自Aladdin 試劑公司（上海）。所制備的E2（1 mmol·L-1）、M-REs（5 g·L-1）、漆酶（100 U·mL-1）和檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖溶液（CPBS，10 mmol·L-1）等母液儲存于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.2 玉米根系分泌物的收集

玉米種子經過75%乙醇表面消毒殺菌5 min，采用滅菌的去離子水充分清洗3次并浸泡8 h后，置于人工氣候箱（HBRG-500LED）中催芽，預培養至株高8～10 cm。選擇40株長勢均勻、大小一致的玉米幼苗重新移栽到2 000 mL滅菌的新鮮Hoagland培養液中繼續培養15 d。通過0.45 μm水系微孔濾膜過濾培養液并冷凍干燥，獲得玉米根系分泌物（M-REs）。人工氣候箱的光照和黑暗培養時間為14 h/10 h，晝夜溫度為25 ℃/20 ℃，相對濕度為60%～70%，日間光照強度約為180 μmol·m-2·s-1。