抑制CAR-T細胞衰竭的策略研究

通信作者簡介：郝新寶，醫學博士，血液/腫瘤學教授、主任醫師，博士生導師（南京醫科大學及海南醫科大學）。海南醫科大學第一附屬醫院血液內科學科帶頭人。長期從事血液病、腫瘤的醫療、教學和科研工作，同時開展小分子化合物、大分子蛋白藥物及細胞藥物開發、臨床研究轉化及項目管理30多年。曾承擔國家自然科學基金、軍隊及省部級課題共計20余項，在國內外期刊發表論文逾100篇，谷歌學術統計總引用約2 600次，單篇最高引用797次，H-index 15，培養博士、碩士研究生30多人。E-mail：haoxb@hainmc.edu.cn。

【摘要】 免疫治療在臨床抗腫瘤治療中取得了良好的療效，尤其是嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法作為一種新興的腫瘤免疫療法，在血液系統惡性腫瘤臨床治療中取得了突破性的療效。但CAR-T細胞在治療過程中會面臨逐漸衰竭的問題，特別是在實體瘤的治療中，導致抗腫瘤療效欠佳及復發等風險。文章分析了CAR-T細胞衰竭的可能機制，并闡述了抑制CAR-T細胞衰竭的相關研究進展，以期設計合理的治療策略，減少CAR-T細胞的衰竭，提高CAR-T細胞的效能。

【關鍵詞】 CAR-T細胞；T細胞衰竭；衰竭機制；調控策略

Research on strategies to inhibit CAR-T cell exhaustion

FU Qiongyu， HAO Xinbao ， TAO Shi

（Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University， Haikou 570100， China）

Corresponding author： HAO Xinbao， E-mail： haoxb@hainmc.edu.cn

【Abstract】 Immunotherapy has achieved good efficacy in clinical anti-tumor therapy， especially chimeric antigen receptor T cell （CAR-T cell） therapy， as an emerging tumor immunotherapy， has achieved breakthrough efficacy in the clinical treatment of hematologic malignancies. However， CAR-T cell face the problem of gradual exhaustion during the treatment process， especially in the treatment of solid tumors， which will lead to poor anti-tumor efficacy and possible risks such as recurrence. This paper analyzed the possible mechanism of CAR-T cell exhaustion and describes the relevant research progress in inhibiting CAR-T cell exhaustion， with a view to designing reasonable therapeutic strategies to reduce CAR-T cell exhaustion and improve the efficacy of CAR-T cell.

【Key words】 CAR-T cell； T cell exhaustion； Mechanisms of exhaustion； Governance policies

免疫療法在腫瘤治療中取得了顯著的效果，尤其是嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法，在抗腫瘤方面取得了突破性的進展。盡管CAR-T療法在治療血液系統惡性腫瘤方面取得了成功，但T細胞在體內易耗盡，尤其是進入實體腫瘤后，因此CAR-T細胞衰竭是實體腫瘤治療成功的主要障礙之一［1］。T細胞耗竭現象首次在慢性淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）感染小鼠的CD8+ T細胞中被觀察到，并在癌癥和其他感染模型中得到證實［2］。在慢性感染或癌變過程中，由于病原體或腫瘤細胞的抗原或炎癥因子對T細胞的刺激持續時間較長，導致記憶和效應T細胞功能逐漸喪失，這一過程即T細胞衰竭。T細胞衰竭的特征包括多種抑制受體的共同表達、效應功能的逐漸喪失以及效應細胞的過度分化。腫瘤中的T細胞衰竭與免疫治療的效果呈負相關，因此，探索CAR-T細胞衰竭的機制對于減少CAR-T細胞衰竭、提高CAR-T細胞效能以及設計新的治療策略至關重要。本文綜述了CAR-T細胞衰竭的機制以及基于這些機制的CAR-T細胞治療策略的最新研究進展，旨在更好地理解CAR-T細胞療法在腫瘤治療中的作用，為提高其療效提供科學依據。

1 CAR-T細胞衰竭的機制

1.1 CAR的結構設計影響CAR-T細胞衰竭

CAR由3個主要部分組成：細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域。CAR-T細胞技術經歷了4代的發展，第一代CAR-T細胞只有CD3結構域（CD3 domain，CD3ζ）；第二代CAR-T細胞包括CD3ζ和共刺激結構域（costimulatory domain，CM）；第三代CAR-T細胞有2個不同的CM；第四代CAR-T細胞具有額外的細胞內結構域，用于調節細胞因子或其他共刺激分子的表達［3］。第一代CAR含有一個單鏈可變片段（single-chain fragment variable，scFv），該片段與CD3ζ的細胞內信號域相連。這些CAR僅提供T細胞啟動信號而缺乏共刺激分子，通過CD3ζ的信號傳導不足以啟動靜息T細胞，由于信號傳導能力有限，第一代CAR-T細胞不能實現持續應答［3-4］。第二代CAR包括一個CM（CD28、4-1BB、OX-40、ICOS和CD134），為T細胞的激活提供了第二個信號，可以防止CAR-T細胞的衰竭，其中含CD28和ζ鏈的CAR-T細胞（chimeric antigen receptor T-cell with CD28 and ζ-chain，CD28ζCAR-T細胞）與含4-1BB和ζ鏈的CAR-T細胞（chimeric antigen receptor T-cell with 4-1BB and ζ-chain，4-1BBζCAR-T細胞）相比，4-1BBζCAR-T細胞在體內的持久性更強，但殺傷作用更弱，因此研究人員將這2種共刺激分子整合到CAR-T細胞的結構中，從而開發了第三代CAR-T細胞［3］。第三代CAR具有多個CM，進一步增強T細胞的活化、增殖和細胞因子的產生；第四代CAR-T細胞被設計為在識別目標抗原時分泌特定的細胞因子，這是通過在CAR結構中添加第二個基因來實現的，該基因編碼細胞因子或其他免疫調節因子（酶或配體）；第三代和第四代的抗腫瘤作用增強，但毒性和其他副作用增加［5］。見表1。

1.2 體外擴增條件影響CAR-T細胞衰竭

在CAR-T細胞制造過程中，多個技術因素都會影響T細胞在體內的持久性和有效性，包括冷凍保存、培養中接收的激活信號的劑量和培養時間［6］。為了獲得足夠的CAR-T細胞數量，這些細胞需要在體外擴增。在擴增過程中，通常添加細胞因子白介素-2（interleukin-2，IL-2），但這種做法可能導致CAR-T細胞衰竭并降低它們在體內的持久性。相比之下，在輔助性T細胞9（T helper 9 cell，Th9）培養條件下極化和擴增的CAR-T細胞（T9 CAR-T）對已建立的腫瘤具有增強的抗腫瘤活性。與IL-2極化的T1 CAR-T細胞相比，T9 CAR-T細胞分泌IL-9及少量干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），表達中樞記憶表型和較低水平的衰竭標志物，并表現出強大的增殖能力，因此T9 CAR-T細胞比T1 CAR-T細胞在體內對血液和實體腫瘤具有更大的抗腫瘤活性［7］。此外，CAR-T細胞的衰竭水平隨著體外擴增時間的延長而增加，因此，培養時間較短的“年輕”細胞在體內表現出較低的衰竭標志物和更強的長期殺傷功能［8］。這些發現提示在CAR-T細胞的生產中，需要精細調控培養條件和時間，以優化CAR-T細胞的持久性和療效。

1.3 抑制性受體持續高表達與T細胞衰竭相關

衰竭的T細胞表現出多種抑制性受體（inhibitory receptor，IR）過表達的特征，相關IR如程序性細胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）、淋巴細胞激活基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）、2B4（CD244）、CD160、T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T-cell immunoglobulin mucin-3，TIM-3）、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）等。IR通過以下4種不同的方式誘導T細胞衰竭：①抑制激活受體的細胞內信號，②上調T細胞衰竭相關基因，③影響T細胞的代謝，④阻止共刺激信號［9］。在慢性感染和癌癥中，由于抗原持續存在，多個IR表現出持續高表達的狀態，這是耗盡的CD8+ T細胞的生物標志之一。IR在多種免疫細胞表面被發現，它們與配體結合后，通過多種分子機制負向調節免疫細胞的功能，其中PD-1和CTLA-4與CD8+ T細胞衰竭的關系最為密切［10］。PD-1主要表達于活化的T細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）和調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）。在活化的T細胞表面，外周抗原被T細胞識別后，PD-1表達上調；外周T細胞受體（T-cell receptor，TCR）識別腫瘤抗原后，程序性細胞死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）或PD-L2會結合PD-1并激活下游相關信號通路，通過反饋抑制阻斷TCR信號通路，下調由B細胞淋巴瘤-2樣蛋白1（B-cell lymphoma-2-like 1，BCL2L1）編碼的B細胞淋巴瘤-超大蛋白（B-cell lymphoma-extra-large，Bcl-xL）等特異性抗凋亡蛋白分子和促炎因子的表達，最終抑制T細胞的存活、增殖和免疫功能［11］。CTLA-4在衰竭T細胞（exhausted T cell，Tex）、活化T細胞和Treg中高度表達，CTLA-4和CD28都是免疫球蛋白超家族成員（immunoglobulin superfamily，IgSF），CTLA-4對B7-1/2具有較高的親和力，CTLA-4與CD28 競爭結合B7-1/2，CD28與B7-1/2結合可促進T細胞增殖和激活，而CTLA-4與B7-1/2結合則阻止早期T細胞激活［12］。

1.4 抗原持續暴露導致T細胞衰竭

在慢性感染或癌癥中，T細胞在相關高水平抗原的慢性刺激下會依次分化至終末衰竭，Tex可表現為IR的持續表達（如PD-1、LAG-3、2B4和CTLA-4的持續表達），產生效應細胞因子如IFN-γ和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的能力減弱，以及T細胞增殖能力的降低［13］。在人和小鼠模型中，T細胞耗竭的程度與抗原刺激的持續時間呈正相關。一項關于CD8+ T細胞衰竭的研究顯示，T細胞與抗原短時間孵育后，部分Tex可以恢復功能，但長期孵育則無法恢復Tex的功能［9］。例如符合CAR-T細胞治療條件的患者通常患有復發/難治性疾病，由于廣泛的癌癥病史，患者的T細胞暴露于慢性腫瘤抗原以及多種化學治療藥物，據報道，白血病誘導的T細胞功能障礙導致自體CAR-T細胞的效果不理想。與健康個體產生的CAR-T細胞相比，這些CAR-T細胞清除腫瘤的效果較差［14］。因此CAR-T細胞的衰竭與長期暴露于抗原有密切關系。

1.5 腫瘤微環境影響CAR-T細胞的衰竭

腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）包括腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞等多種細胞以及可溶性因子如細胞因子、代謝物和細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）［15］。TME復雜的成分對CAR-T細胞發揮了復雜的調節作用。在TME中，存在多種機制阻礙CAR-T細胞的治療效果，包括代謝燃料的競爭、CAR-T細胞耗竭機制、物理障礙阻止有效CAR-T細胞浸潤、免疫抑制細胞因子和細胞類型。TME不僅阻礙CAR-T細胞運輸到作用位點，影響CAR-T細胞的代謝功能，還產生導致T細胞衰竭的免疫抑制環境［16］。TME中的強抗炎信號，如細胞因子IL-10和轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β），誘導巨噬細胞和DC向免疫抑制活性極化，從而抑制CAR-T細胞功能；Treg、髓源性抑制細胞和癌癥相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）也有助于拮抗CAR-T細胞，最終導致惡劣的微環境使得CAR-T細胞衰竭和失活［1］。IL-10由癌細胞和多種免疫細胞（Treg、DC、B細胞、單核/巨噬細胞等）分泌，IL-10對其他效應免疫細胞有抑制作用，包括有效的抗腫瘤細胞毒性NK細胞和CD8+ T細胞［17］。TGF-β由許多腫瘤細胞分泌，調節TME中多種類型的免疫細胞，包括T細胞、NK細胞和巨噬細胞；典型的TGF-β信號通路SMAD既控制腫瘤轉移，又控制免疫調節從而調節腫瘤免疫。TGF-β在TME中的主要作用之一是產生調節性T細胞，從而抑制抗腫瘤免疫［18］。例如TGF-β下游激活的SMAD2/3誘導瘤內CD8+ T細胞上PD-1的表達，導致胃癌患者的CD8+ T細胞功能障礙、衰竭和腫瘤生長增加［19］。

1.6 轉錄因子的表達影響CAR-T細胞的耗竭

Tex的轉錄譜與效應T細胞和記憶T細胞明顯不同，多種轉錄因子包括干擾素調節因子4 （interferon regulatory factor 4，IRF4）、堿性亮氨酸拉鏈ATF樣轉錄因子（basic leucine zipper ATF-like transcription factor，BATF）、活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）、核受體亞家族4A組（nuclear receptor subfamily 4 group A，NR4A）、胸腺細胞選擇相關高遷移率組框蛋白（thymocyte selection-associated high mobility group box protein，TOX）、T細胞因子-1（T-cell factor 1，TCF-1）、T細胞中表達的T-box（T-box expressed in T cells，T-bet）、EOMES和B細胞誘導成熟蛋白1（B lymphocyte-induced maturation protein 1，BLIMP1）等構成復雜的調控網絡，參與T細胞耗竭的過程［20-21］。特別是IRF4、BATF、NR4A1等在T細胞抗原受體（T-cell receptor，TCR）信號下游發揮作用，參與T細胞衰竭狀態的形成，并且這些轉錄因子大多參與包括PD-1在內的多種IR的表達，從而限制效應因子的功能［21］。研究表明，在LCMV感染中，衰竭細胞比記憶T細胞具有更高的核EOMES∶T-bet比率，因此可以使用T細胞中T-bet和EOMES的相對水平來定義衰竭［22］。多種轉錄因子參與了CAR-T細胞衰竭的調控網絡，調節轉錄因子可以抑制CAR-T細胞的衰竭。

2 抑制CAR-T細胞衰竭的調控策略

2.1 優化CAR-T細胞結構

CAR-T細胞的結構與其功能特性密切相關，包括scFv分子、CM和細胞內信號傳導結構域在內的組成元件都對激活和耗竭具有調控作用，通過優化CAR的結構和調控其表達模式，可以有效地減弱強直性CAR信號，防止CAR-T細胞衰竭［23］。例如，有研究者設計了帶有短或長scFv連接體的CD22 CAR和CD33 CAR，發現短scFv連接體（CART22-short或CART33-short）具有優異的細胞毒性，分泌更多的IFN-γ、IL-2和TNF-α，導致衰竭相關表面蛋白的表達降低，具有顯著的抗白血病活性，提高了動物的存活率，因此CD22 CAR和CD33 CAR提高了CAR-T細胞在體內的作用時間［24］。CD28和4-1BB是兩種最常見的共刺激分子，它們與CAR-T細胞中的抗原識別結構域相連；與含有CD28/CD3的CAR-T細胞相比，含有共刺激分子4-1BB/CD3的CAR-T細胞可以延長存活時間，減少衰竭，并具有更好的分化表型［9］。在第二代CAR的結構中加入了可以調節細胞因子（如IL-12、

IL-18、IL-21、IL-23）表達的結構域，這些細胞因子的表達通過改善TME或促進記憶性T細胞的生成來增加CAR-T細胞在體內的持久性［3］。

2.2 改進CAR-T細胞體外擴增技術

CAR-T細胞在體外擴增是治療的一個關鍵步驟，這一過程會影響CAR-T細胞的衰竭。為了改進體外擴增技術，研究人員進行了多項創新，例如CAR-T細胞擴增期間抑制從頭甲基化可以阻斷異常DNA甲基化（DNA methylation，DNAm），從而提高治療效果。Salz等［25］的研究結果證實了這些有害的DNAm變化是在培養擴增過程中不斷獲得的，通過縮短培養期以避免功能失調的甲基化程序可能是提高過繼細胞療法的有前景的制造策略。

此外，CAR的強直信號傳導，即在沒有腫瘤抗原刺激的情況下自發的CAR激活被認為是控制CAR-T療效的關鍵，如Chen等［26］的研究提出了一個CAR-T功能適應度和CAR強直信號強度之間的關聯模型，該模型由CAR抗原結合域表面的帶正電荷貼片（positively charged patch，PCP）控制；在這個模型中，低效率的強直信號導致CAR-T缺乏持久性，而過度的強直信號導致CAR-T耗竭，因此通過在CAR設計中修改PCP或在離體培養過程中調整離子濃度來微調強直信號，可以獲得最佳的CAR-T細胞適應性；合理調整PCP以優化CAR-T細胞的強直信號和體內適應性是下一代CAR的一種有前景的設計策略。

2.3 阻斷免疫檢查點的應用

免疫檢查點阻斷在腫瘤免疫治療中對防止T細胞衰竭起著重要作用。靶向免疫檢查點可有效緩解T細胞衰竭，阻斷PD-1及其配體PD-L1與CTLA-4可顯著提高T細胞的殺傷功能，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）單克隆抗體已被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床［20］。Chong等［27］的研究顯示，在靶向CD19的CAR-T細胞（chimeric antigen receptor T-cell targeting CD19，CD19 CAR-T細胞）治療后難治性和（或）復發的B細胞淋巴瘤患者中，使用PD-1抑制劑派姆單抗的患者有25%實現了完全緩解或部分緩解。使用飛行時間質譜細胞技術（mass cytometry by time of flight，CyTOF）的深度免疫分析顯示，臨床應答者的CAR-T細胞活化和增殖增加，T細胞耗竭減少，這表明PD-1抑制劑在改善T細胞衰竭和增強CD19 CAR-T細胞療效方面具有一定的作用。此外，利用CRISPR-Csa9技術［一種高效、精準的基因編輯工具，該系統由CRISPR相關蛋白Cas9和單導RNA（single guide RNA，sgRNA）組成］破壞CAR-T細胞中的IR可顯著增強其對免疫抑制性TME的抗性，這是一種很有前景的癌癥免疫治療方式。研究表明，CAR-T細胞中CRISPR-Cas9對免疫檢查點的破壞，如PD-1破壞的表皮生長因子受體Ⅲ型突變體嵌合抗原受體（epidermal growth factor receptor variant Ⅲ-chimeric antigen receptor，

EGFRvⅢ-CAR）-T細胞在膠質母細胞瘤中表現出增強的細胞毒性和衰竭減少［28-29］。Agarwal等［30］的研究發現，在臨床前白血病和骨髓瘤模型中，CRISPR-Cas9介導的CTLA-4缺失可改善CAR-T細胞增殖和抗腫瘤療效，CTLA-4缺陷允許在高抗原負荷條件下無對抗CD28信號傳導和維持T細胞表面的CAR表達；在臨床研究中，CTLA-4的缺失挽救了之前CAR-T細胞治療失敗的白血病患者的T細胞功能，因此選擇性刪除CTLA-4可以激活功能失調的慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）患者的T細胞，為提高患者對CAR-T細胞治療的反應提供了一種策略。這些研究強調了免疫檢查點阻斷在CAR-T細胞治療中的重要性，并指出了通過基因編輯技術改善CAR-T細胞衰竭的新途徑。

2.4 克服腫瘤微環境的免疫抑制提高CAR-T細胞療效

TME中的可溶性免疫抑制因子［如腺苷、吲哚胺2，3-雙加氧酶1（indoleamine2，3-dioxygenase1，IDO1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和TGF-β］、免疫抑制非腫瘤細胞［如髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）、腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）、基質細胞］和膠原蛋白可促進T細胞的衰竭［9］。近年來，為了克服復雜的TME以提高CAR-T細胞療效，研究者們開發了多種新策略。例如Li等［31］的研究發現，腺苷A2A受體（A2A receptor，A2AR）和腺苷A2B受體（A2B receptor，A2BR）在人源性CAR-T細胞中表達上調，并且只有A2AR對腺苷誘導的CART細胞功能損傷負責；在體外用CRISPR-Cas9破壞人CAR-T細胞中的A2AR基因，可以增加CAR-T細胞的抗腫瘤功能并阻止其衰竭。Chen等［32］設計了CAR-T細胞，使其分泌雙特異性陷阱蛋白，共同靶向PD-1和TGF-β，這種改造的CAR-T細胞能夠減弱抑制性T細胞信號，增強T細胞的持久性和擴張性，提高效應細胞功能和抗衰竭能力。Liu等［33］研究了成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）靶向CAR-T細胞，發現其可以通過重塑TME來增加序貫CAR-T治療的抗腫瘤活性。FAP靶向CAR-T細胞清除CAF，減少了MDSC的募集、分化和免疫抑制作用，改善了現有的CD8+ T細胞。此外，FAP靶向CAR-T細胞還能抑制腫瘤部位的MDSC，并促進CLDN18.2靶向CAR-T細胞的浸潤和存活。

2.5 CAR-T細胞衰竭的轉錄調控

在CAR-T細胞衰竭的調控網絡中，多種轉錄因子扮演著關鍵角色。在連續的TCR信號傳導作用下，Tex細胞經歷了從前體Tex（precursor Tex cells，Tpex）細胞到過渡性Tex細胞，最終到終末Tex（terminal Tex cells，Texterm）細胞的層次分化軌跡。在這個過程中，關鍵轉錄因子如TCF-1、TOX和T-box家族成員（T-bet、Eomes）輪流調節不同Tex簇的衰竭程序［34］。Zheng等［35］的研究利用免疫功能正常的B細胞急性淋巴細胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）小鼠模型證明，調節性核糖核酸酶1（Regnase-1）缺乏會促進TCF-1表達，從而增強CAR-T細胞的擴增和記憶樣細胞的形成，改善CAR-T介導的腫瘤清除，并持續緩解和對繼發性腫瘤攻擊的保護。由于Regnase-1直接靶向轉錄因子7（transcription factor 7，Tcf7）信使RNA （messenger RNA，mRNA），其缺乏會增加TCF-1的表達，促進Tpex的形成，支持CAR-T細胞的長期持久性和功能。Seo等［36］利用CAR-T細胞模型發現，TOX和胸腺細胞選擇相關高遷移率組框蛋白2（thymocyte selection-associated high mobility group box protein 2，TOX2）在CD8+ CAR+ PD-1high TIM3high（耗盡）的腫瘤浸潤淋巴細胞（chimeric antigen receptor-tumor infiltrating lymphocytes，CAR-TILs）中被高度誘導，并且TOX和TOX2雙缺位（TOX double-knock out，TOX DKO）的CAR-TILs在抑制腫瘤生長和延長腫瘤小鼠生存方面比野生型（wild-type，WT）、TOX缺位或TOX2缺位的CAR-TILs更有效。該研究表明TOX和NR4A轉錄因子對NFAT下游CD8+ T細胞衰竭的轉錄程序至關重要，提示破壞TOX和NR4A的表達或活性有希望作為癌癥免疫治療的策略。

2.6 CAR-T細胞衰竭的表觀遺傳調控

CAR-T細胞的表觀遺傳重塑被認為是提升其療效的一種潛在手段，它可能通過減少耗竭、改善運輸和穿透能力、促進記憶表型來實現這一目標，從而增強CAR-T細胞持久性和改善患者預后［37］。本文重點關注表觀遺傳調控對T細胞衰竭的影響。Zebley等［38］對復發/難治性B細胞急性淋巴細胞白血病患者輸注后的CD8+ CD19-CAR-T細胞進行了縱向全基因組DNA甲基化分析，發現輸注后的CAR-T細胞表現為與記憶電位相關基因［如Tcf7和淋巴細胞增強因子1（lymphoid enhancer factor 1，LEF1）］的抑制以及DNA甲基化特征［如C-X3-C趨化因子受體1（C-X3-C chemokine receptor 1，CX3CR1）、BATF和TOX的去甲基化］，這些變化標志著其向衰竭祖T細胞的過渡，因此CD19-CAR-T細胞經歷了與耗竭相關的DNA甲基化編程。從頭DNA甲基化會促使T細胞衰竭，而甲基化抑制則會增強體內T細胞恢復活力。例如地西他濱是一種被批準用于臨床的DNA甲基轉移酶抑制劑，在體外和體內，地西他濱處理的嵌合抗原受體（decitabine-treated chimeric antigen receptor，dCAR）-T細胞的抗腫瘤活性、細胞因子的產生和增殖都得到了增強，此外，dCAR-T細胞可以在低劑量下根除大體積腫瘤，且腫瘤浸潤的dCAR-T細胞在體內保持相對較高的記憶相關基因表達和較低的衰竭相關基因表達［39］。這些發現表明了表觀遺傳調控有可能在未來成為逆轉CAR-T細胞衰竭的重要方法。

2.7 CAR-T細胞衰竭的代謝調節策略

代謝在T細胞存活、激活、發育、增殖、分化和抗腫瘤效應功能中起著關鍵作用，通過體外代謝調節可以改善免疫功能和持久性，涉及的關鍵代謝途徑包括糖酵解、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）、線粒體生物發生和脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）［40］。目前，針對減少CAR-T細胞衰竭的代謝調節有很多新策略，例如Renauer等［41］用多組學方法鑒定了腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）和丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）作為人類原代T細胞和CAR-T細胞中的關鍵代謝酶，研究表明ADA的過表達能夠改善不同供體來源的CD19特異性和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）特異性CAR-T細胞的功能，通過增強癌癥溶解、CAR-T細胞增殖、中樞記憶生成以及減少衰竭來評估。研究還顯示，ADA過表達在體內實體瘤模型中顯著提高了HER2特異性CAR-T細胞的療效。Lontos等［42］的研究發現了一種抗抑制的工程版過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator 1 α，PGC-1α）可以代謝重編程人類CAR-T細胞，PGC-1α轉導的CAR-T細胞的轉錄組學分析表明，這種方法有效地誘導了線粒體生物發生，但也上調了與效應功能相關的程序；用這些細胞治療患有人類實體瘤的免疫缺陷動物，大大提高了體內療效；該研究數據進一步支持了代謝重編程在免疫調節治療中的作用，并強調了PGC-1α等基因作為有吸引力的候選基因，可與嵌合受體或TCR一起用于實體瘤的細胞治療。

2.8 增加記憶T細胞比例提高CAR-T細胞的持久性

T細胞有多種亞群，每個亞群都有不同的增殖潛能。初始T細胞（naive T cell，TN）、干細胞記憶T細胞（stem cell memory T cell，TSCM）和中樞記憶T細胞（central memory T cell，TCM）相較于效應T細胞具有更高的增殖潛能，這些細胞比例的增加能夠提高CAR-T細胞在體內的持久性［43］。因此為了增強CAR-T細胞的持久性，研究者致力于提高記憶T細胞在CAR-T細胞中的比例。不同類型的細胞因子對免疫細胞有不同的激活作用，例如IL-2細胞因子傾向于激活CD8+ T細胞增殖產生效應功能，而IL-21細胞因子則更傾向于激活具有中樞記憶表型的細胞，其在體內的持久性更強，抗腫瘤活性更高，因此在設計和臨床應用工程細胞因子時，需要考慮它們對免疫細胞激活的偏好，以確定不同工程細胞因子的具體應用［44］。

TSCM樣特性對CAR-T細胞治療的成功至關重要，Kondo等［45］研究報道了NOTCH/OP9系統能有效地將傳統的人類CAR-T細胞轉化為TSCM樣CAR-T細胞（CAR-iTSCM細胞），并且線粒體代謝重編程在這種轉化中發揮了關鍵作用，NOTCH信號在iTSCM形成過程中促進線粒體生物發生和脂肪酸合成，這對iTSCM細胞的特性至關重要；叉頭框蛋白M1（Forkhead box M1，FOXM1）被認為是NOTCH的下游靶標，負責這些代謝變化和隨后的iTSCM分化；與NOTCH誘導的CAR-iTSCM細胞一樣，FOXM1誘導的CAR-iTSCM細胞與常規CAR-T細胞相比具有更強的抗腫瘤潛能，表明NOTCH或FOXM1驅動的CAR-iTSCM形成是改善癌癥免疫治療的有效策略。

3 結語與展望

本文探討了CAR-T細胞衰竭的可能機制，并概述了當前抑制CAR-T細胞衰竭的主要策略。期待未來可以設計出能夠更有效地抵抗衰竭或靶向衰竭誘導因子的CAR-T細胞，以此提高CAR-T細胞的抗腫瘤療效。在致力于延緩CAR-T細胞衰竭的同時，也需要關注CAR-T細胞療法可能產生的毒副作用，如細胞因子釋放綜合征和神經毒性等，及時采取相應措施預防及治療。

利益沖突聲明：本研究未受到企業、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

參 考 文 獻

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（責任編輯：鄭巧蘭）