胸腺素β4在RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中的抗炎作用機制

【摘要】 目的 探討胸腺素β4（Tβ4）對脂多糖（LPS）誘導的小鼠單核-巨噬細胞RAW264. 7極化趨向，以及其對炎癥反應的影響。方法 用LPS誘導RAW264.7細胞建立炎癥模型。采用CCK-8法檢測細胞活力，酶聯免疫吸附法檢測細胞因子［腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）］的質量濃度；Griess法檢測細胞培養上清液中一氧化氮（NO）的分泌情況；實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測核因子-κB（NF-κB）、環氧酶-2（COX-2）、

TNF-α、IL-6 mRNA表達水平；蛋白免疫印跡法檢測誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、NF-κB、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）和磷酸化IκBα（p-IκB-α）蛋白水平；熒光染色雙標法觀察巨噬細胞的極化狀態；免疫熒光染色檢測NF-κB定位及表達。結果 1 000 μg/L的胸腺素β4作用于RAW264.7細胞24 h后，細胞存活率為90.2%，與空白對照組比較差異有統計學意義（P lt; 0.05）。各質量濃度的Tβ4均可有效抑制NO的產生（均P lt; 0.000 1）。

Tβ4降低 LPS誘導的炎癥模型 RAW264. 7細胞中促炎因子（TNF-α和IL-6）質量濃度及NO濃度，下調NF-κB、COX-2、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平和iNOS、p-NF-κB和p-IκBα蛋白表達水平，抑制NF-κB的核轉移，降低CD80的表達（均P lt; 0.05）。結論 Tβ4具有抑制炎癥反應的作用，其機制可能與抑制NF-κB信號通路和巨噬細胞M1極化有關。

【關鍵詞】 胸腺素β4；膿毒癥；巨噬細胞；感染；炎癥；NF-κB通路

The anti-inflammatory mechanism of thymosin β4 in a RAW 264.7 macrophage inflammation model

WU Tianyu1， LIN Yujun1， LIN Xiaoyu1， ZHU Yi1， YU Muxue1， LIU Wangkai1，2

（1.Department of Neonatology， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China； 2. Department of Pediatrics， Guangdong Maternal and Child Health Hospital， Guangzhou 511400， China）

Corresponding author： LIU Wangkai， E-mail： liuwk@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To explore the effects of Thymosin β4 （Tβ4） on the lipopolysaccharide （LPS）-induced polarization tendency of murine monocyte-macrophage RAW264.7 cells and its influence on inflammatory responses. Methods An inflammation model was established by LPS induction in RAW264.7 cells. Cell viability was assessed using the CCK-8 assay. The concentrations of cytokines ［tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6）］ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Nitric oxide （NO） secretion in the cell culture supernatant was detected using the Griess method. Real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） was employed to detect mRNA expression levels of nuclear factor-κB （NF-κB）， cyclooxygenase-2 （COX-2）， TNF-α， and IL-6. Western blotting was used to analyze protein levels of inducible nitric oxide synthase （iNOS）， NF-κB， phosphorylated NF-κB （p-NF-κB）， NF-κB inhibitor α （IκB-α）， and phosphorylated IκBα （p-IκB-α）. The polarization status of macrophages was observed using double fluorescence staining. Immunofluorescence staining was performed to examine NF-κB localization and expression. Results After treatment with 1 000 μg/L Tβ4 for 24 hours， the cell viability of RAW 264.7 cells was 90.2%， showing a statistically significant difference compared to the blank control group （P lt; 0.05）. Tβ4 at various concentrations effectively inhibited NO production （all P lt; 0.000 1）. Tβ4 decreased the concentrations of pro-inflammatory cytokines（TNF-α and IL-6） and NO in the LPS-induced RAW264.7 inflammatory model. It also downregulated mRNA expression of NF-κB， COX-2， TNF-α， and IL-6， as well as protein expression of iNOS， p-NF-κB， and p-IκBα. Additionally， Tβ4 inhibited NF-κB nuclear translocation and decreased CD80 expression （all P lt; 0.05）. Conclusion Tβ4 exhibits anti-inflammatory effects， the mechanisms of which may be associated with the inhibition of the NF-κB signaling pathway and suppression of macrophage M1 polarization.

【Key words】 Thymosin β4； Sepsis； Macrophages； Infection； Inflammation； NF-κB pathway

膿毒癥是由感染引起的宿主反應失調，導致危及生命的器官功能障礙［1］，是重癥患者最常見的死亡原因［2］。在膿毒癥中，機體對感染的反應導致免疫細胞激活和大量炎癥介質的釋放，這些炎癥介質誘發了局部或全身性的炎癥反應。若炎癥反應進一步惡化并導致免疫系統嚴重受抑，便可能引發膿毒癥，這表明機體的免疫和炎癥反應已經失衡至無法自我調節的程度［3］。炎癥反應是身體對感染或組織損傷的自然反應，構成了防御外來病原體的前線。膿毒癥反應的發病機制包括炎癥反應、免疫失調等復雜反應［4］。巨噬細胞的持續性激活是推動膿毒癥反應進展的關鍵因素之一［5］。研究表明，巨噬細胞作為炎癥反應的核心細胞，是固有免疫不可或缺的組成部分，在膿毒癥的發生、發展中起著至關重要的作用［6］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭陰性細菌感染的生物標志物［7］，其誘導的RAW264.7巨噬細胞是經典的細胞炎癥模型，而RAW264.7細胞炎癥模型也是篩選抗炎藥物的經典模型［8］。因此，抑制巨噬細胞的炎癥反應可為膿毒癥的治療提供新的思路，對其深入研究具有一定的價值。

胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是一種小分子多肽，廣泛且保守地存在于哺乳動物（除紅細胞外）的各類細胞中［9］。其不僅分布于細胞質與細胞核中，還能作為內分泌因子參與機體多種生理功能的調節。現有研究表明，Tβ4具有保護并修復心肌組織、促進角膜修復和傷口愈合、誘導血管新生、參與神經系統的修復、促進毛發的生長以及減輕炎癥損傷等多種生物學功能［10］。此外研究表明，Tβ4可作用于核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路，從而改善肝纖維化［11］。然而，當前對于Tβ4的抗炎作用機制的了解尚不全面。因此，本研究通過使用LPS激活RAW264.7細胞，構建體外炎癥模型，探索Tβ4對于RAW264.7細胞中的炎癥反應及其在NF-κB信號通路中的作用，以期明確Tβ4的抗炎活性和相關機制，為Tβ4的深入研究和臨床應用推廣提供實驗數據支撐，并為膿毒癥的臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

包括Raw264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7，上海中喬新舟生物科技有限公司），Tβ4凍干粉劑（上海易恩化學技術有限公司），大腸桿菌來源脂多糖LPS［西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］，CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術股份有限公司），一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術股份有限公司），白介素-6（interleukin-6， IL-6）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯免疫吸附測定試劑盒（欣博盛生物科技有限公司），反轉錄預混型試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），ChamQ qPCR專用預混液試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），一抗IκBα、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）、NF-κB的轉錄活性形式磷酸化NF-κB p65（phospho-NF-κB p65，p-NF-κB p65）［12］購于美國Cell Signaling Technology公司，NF-κB p65（蛋白免疫印跡法）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）購于英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京博奧森生物技術有限公司，NF-κB p65（免疫熒光法）、CD80/B7-1抗體、CD86抗體均購于美國Proteintech公司。

1.2 細胞培養

將小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）置于10%胎牛血清的 DMEM 培養液中傳代，在含5%CO2、37 °C的細胞培養箱中孵育。

1.3 RAW264.7細胞存活率的測定

采用CCK-8法：取傳代RAW264.7細胞以每孔1×104個細胞的密度接種到96孔細胞培養板中，并在37℃、5% CO2條件下的細胞培養箱中培養24 h。

然后棄培養液，向每孔中加入100 μL含有不同質量濃度Tβ4（0～1 000 μg/L）的細胞培養基，每個質量濃度設置3個重復孔（后續相同），繼續培養24 h。之后，向每孔中加入10 μL的增強型CCK-8溶液培養1 h。最后，在450 nm波長處測量吸光度。細胞存活率為給藥組細胞OD值與對照組細胞OD值的百分比。

1.4 一氧化氮濃度的測定

采用Griess法：取一個無菌的24孔細胞培養板，每孔中加入1 000 μL的細胞懸浮液（每毫升3×105個細胞）。培養24 h后，倒去培養液。然后，向每個孔中分別加入含有LPS（1 ng/L）和不同質量濃度Tβ4（0、50、100、200、500 μg/L）的細胞培養液500 μL，繼續培養24 h。培養結束后，收集每孔中的上清液，使用NO檢測試劑盒檢測含量。

1.5 腫瘤壞死因子-α和白介素-6質量濃度的測定

按“1.4”項的方法處理細胞。培養24 h后，棄上清液。Tβ4組添加含50 μg/L Tβ4和1 ng/L LPS的培養基，另設僅含1 μg/mL LPS的LPS組和使用空白培養基的空白組，培養24 h后，取細胞上清液，使用酶聯免疫吸附法測定培養上清液中TNF-α及IL-6的含量。

1.6 RAW264.7細胞中細胞因子mRNA表達水平的測定

按“1.4”項的方法處理細胞，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測NF-κB、COX-2、TNF-α、IL-6的mRNA表達水平。收集細胞，提取總RNA。將RNA逆轉錄為模板DNA。各基因引物序列如表1所示。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt法計算樣品中基因的相對含量。

1.7 蛋白表達水平的測定

采用蛋白免疫印跡法分析：按“1.4”項的方法處理細胞，收集細胞，每孔加入RIPA充分裂解后，提取細胞蛋白并檢測蛋白含量。蛋白煮沸5 min后，電泳分離蛋白并轉膜。室溫下，使用快速封閉液封閉30 min后，4℃一抗過夜孵育，清洗后加入相應二抗孵育2 h。最后加入ECL發光。以GAPDH為內參，使用ImageJ分析蛋白條帶灰度值，并計算各蛋白的相對表達量。

1.8 免疫熒光檢測

巨噬細胞可以極化成為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞［13］。在LPS的刺激下，巨噬細胞可發生M1型極化，促進炎癥反應，是炎癥性疾病的基礎［14］。CD80是M1型巨噬細胞的表面標記物［15］，通過免疫熒光標記法檢測CD80的表達可觀察巨噬細胞向M1型極化的程度，從而反映巨噬細胞的炎癥反應狀態。CD80表達降低則說明巨噬細胞向M1型極化的效應減輕，炎癥反應得到抑制。細胞中NF-κB 二聚體的核轉移是調節基因表達程序和生物反應的基礎［16］，核轉移減少可說明NF-κB通路得到抑制，炎癥反應減輕。按“1.4”項的方法處理細胞，收集細胞，用4%的多聚甲醛固定，封閉液處理30 min，4 ℃一抗孵育過夜（NF-κB稀釋比例為1∶100，CD80稀釋比例為1∶200，CD86

稀釋比例為1∶100）。次日清洗后加入相應熒光二抗（稀釋比例為1∶500），濕盒中37 ℃孵育

1 h，清洗后滴加DAPI避光孵育5 min染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。在細胞核轉移分析中，獲取圖像后，用ImageJ軟件分析，統計出每個視野的DAPI數量和NF-κB入核數量（核轉移率為入核細胞數量與DAPI數量的百分比）。針對CD80表達的檢測，獲取圖像后，用ImageJ軟件分析，平均熒光強度等于所求區域熒光強度總和與區域面積熒光強度的比值。

1.9 統計學方法

數據采用 GraphPad Prism 9.4.0進行分析與繪圖。所有數據均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett檢驗、Tukey

檢驗。雙側P lt; 0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 胸腺素β4對RAW264.7細胞存活率的影響

CCK-8法檢測Tβ4對RAW264.7細胞存活率的結果顯示，與對照組相比，當RAW264.7細胞分別經50、100、200、500 μg/L的Tβ4處理24 h后，各處理組的細胞存活率比較差異無統計學意義（均P gt; 0.05）。1 000 μg/L的胸腺素β4作用于RAW264.7細胞24 h后，細胞存活率為90.2%，與空白對照組比較差異有統計學意義（P lt; 0.05）。見表2。

2.2 胸腺素β4降低脂多糖誘導的RAW264.7細胞中一氧化氮的生成

各質量濃度的Tβ4均可有效抑制NO的產生（均P lt; 0.000 1）。見表3。

2.3 胸腺素β4減少脂多糖誘導的RAW264.7細胞中細胞因子的分泌及表達

RAW264.7細胞經LPS處理24 h后，培養上清液中的TNF-α、IL-6質量濃度相較于空白組增加（均P lt; 0.000 1）。與LPS處理組相比，50 μg/L的Tβ4處理降低了RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6的分泌（均P lt; 0.01）。RT-qPCR測定RAW264.7細胞中COX-2、IL-6、TNF-α、NF-κB的表達水平結果顯示，Tβ4處理降低了LPS誘導的 RAW264.7 細胞COX-2、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA表達水平（均P lt; 0.01）。見圖1。

2.4 脂多糖誘導的RAW264. 7細胞炎癥相關蛋白及核因子-κB 通路相關蛋白表達變化

與Control組相比，LPS組p-IκB-α、iNOS、p-NF-κB p65的蛋白表達水平較高（均P lt; 0.001）。與LPS組相比，Tβ4組p-IκB-α、iNOS、p-NF-κB p65的表達水平低于LPS組（均P lt; 0.01）。見圖2。

2.5 胸腺素β4對脂多糖誘導的 RAW264. 7細胞核因子-κB活化及M1極化的影響

與Control組相比，LPS組NF-κB核轉移增多；與LPS組相比，Tβ4組NF-κB核轉移減少（均P lt; 0.001），見圖3。與Control組相比，LPS組CD80表達升高；與LPS組相比，Tβ4組CD80表達降低（均P lt; 0.01），見圖4。

3 討 論

膿毒癥是包括外傷在內的嚴重感染、燒傷及術后常見并發癥，主要表現為機體炎癥細胞的大量活化，構成炎癥因子風暴，引起多器官功能衰竭而致死［17］。炎癥是機體組織受損（如各種炎癥因子）時發生的一系列保護性反應［18］。炎癥反應對于抵抗細菌和病毒感染至關重要，但如果炎癥反應持續或過度，可能會引發一系列病理生理變化，從而增加多種疾病如糖尿病、支氣管哮喘、類風濕關節炎等的發生風險。在極端情況下，過度的炎癥反應甚至可能導致多器官功能障礙綜合征，這是一種可能危及生命的嚴重狀況［19］。因此，開發安全、有效的抗炎藥物是一項長期且重要的科研任務。

巨噬細胞是一類關鍵的免疫細胞，它們在維持組織穩態、炎癥反應和疾病進展中扮演著至關重要的角色［20］。炎癥的啟動和消退受到巨噬細胞調控。巨噬細胞可極化成為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。當巨噬細胞極化成M1型時可促進炎癥反應，而M2型極化可以抑制機體過度炎癥反應。M1型巨噬細胞是促炎細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α 的主要來源［21］，是導致多數炎癥性疾病的基礎［22］。巨噬細胞在炎癥反應中發揮重要作用，能夠識別病原體相關的分子模式，如LPS。LPS通過細胞表面表達的toll 樣受體（toll-like receptor， TLR）激活巨噬細胞［23］。TLR4作為一種廣泛存在于多種組織細胞（包括單核細胞和巨噬細胞）中的受體，能夠直接識別LPS，并通過NF-κB信號通路激活細胞內的信號傳導過程［24］。NF-κB在調控促炎細胞因子的產生中起著至關重要的作用。在靜息狀態下，NF-κB是一種重要的轉錄因子，它在細胞內與抑制因子IκB-α結合，以非活化狀態存在于胞質中。當細胞受到炎癥刺激時，IκB激酶（inhibitor of κB kinase，IκK）被激活，特別是IκKβ的活化，導致IκB-α的N端調節區的Ser32/36位點磷酸化。這一磷酸化過程觸發IκB-α的泛素化和隨后的降解，從而釋放NF-κB p65亞基。釋放的NF-κB p65亞基隨后進入細胞核，與靶基因的κB序列結合，促進炎癥相關基因的轉錄，包括TNF-α、IL-6以及誘導型NO合酶，后者產生NO；這些基因的激活和表達在炎癥反應中起著關鍵作用，促進炎癥介質的產生和炎癥過程的進展［25］。RAW264. 7細胞是一種常用于炎癥研究的巨噬細胞模型。受炎癥刺激時，RAW264.7細胞能夠分化為促炎性的M1型，并分泌大量促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6等［26］。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分之一，可以活化巨噬細胞。在LPS的刺激下，巨噬細胞會極化為M1型并分泌炎癥因子形成強烈的炎癥級聯反應，其生物標志物主要有TNF-α、IL-6、COX-2、NO、iNOS等［27］。NO作為一種重要的炎癥信使，其過度生成并與超氧自由基反應形成過氧亞硝酸鹽，與炎癥性疾病的進展密不可分［28］。TNF-α是一種關鍵的炎癥介質，它能夠激發其他免疫因子的產生，并促進NO的合成，在炎癥反應中扮演著重要角色。IL-6作為一種典型的炎癥介質，它在感染、組織損傷和炎癥過程中被產生和釋放，參與調節多種炎癥反應，包括發熱、疼痛、紅腫以及局部白細胞的遷移。此外，IL-6有時與NF-κB信號通路相關聯，其信號傳導能夠激活NF-κB通路［25］。TNF-α和IL-6的釋放水平可以作為衡量炎癥水平的間接指標。CD80作為M1型巨噬細胞的標志物，通過免疫熒光技術檢測其表達水平可以評估巨噬細胞向M1型分化的程度，從而反映炎癥狀態。NF-κB二聚體向細胞核的轉移對于調控基因表達程序和生物反應至關重要，核內轉移的減少表明NF-κB信號通路受到抑制，炎癥反應得到減輕。

Tβ4具有減輕炎癥損傷的功能，本研究旨在探究其抗炎機制：首先，采用不同質量濃度Tβ4刺激 RAW264. 7細胞，發現當Tβ4質量濃度在50～

500 μg/L時，對RAW264.7細胞存活率無明顯影響；質量濃度達到1 000 μg/L后，細胞活力下降，提示其安全劑量范圍應小于500 μg/L。NO參與多種生理和病理過程。過量的NO會促進炎性疾病的發生和發展，而細胞中TNF-α、IL-6作為炎癥因子，其分泌量可間接反映炎癥程度［29］。本研究使用Griess法檢測細胞培養上清液中NO的分泌情況。當LPS刺激RAW264.7細胞后，與對照組相比，NO分泌量明顯升高；而與LPS組相比，各質量濃度Tβ4均有效抑制NO的產生。在炎癥因子的表達方面，酶聯免疫吸附法結果顯示，LPS誘導的RAW264.7細胞分泌的IL-6和TNF-α明顯增多，這與劉芬等［30］的研究結果相符，他們發現LPS能夠顯著增加炎癥因子的表達；而Tβ4的干預則降低了促炎因子的水平，提示經過Tβ4處理后，細胞模型的炎癥程度減輕［31］。同時，本研究還顯示Tβ4抑制了LPS誘導的RAW264.7細胞中p-NF-κB和pIκB-α、INOS蛋白水平的表達，表明Tβ4可通過抑制IκB-α和NF-κB P65的磷酸化來調控 NF-κB 通路起到抑制炎癥的作用。此外，本研究還觀察到Tβ4降低了TNF-α、NF-κB、COX-2、TNF-α和IL-6等炎癥基因的mRNA表達水平，這進一步證實了Tβ4的抗炎作用。此外，本研究還通過免疫熒光雙標法檢測了巨噬細胞極化狀態及NF-κB核轉移，并觀察了LPS刺激和Tβ4處理對這些過程的影響。實驗發現LPS顯著促進了NF-κB的核轉移及M1型巨噬細胞標志物CD80的表達，這與Liu等［32］、李夢等［33］的研究結果一致，前者發現LPS能夠誘導巨噬細胞向M1型極化，后者發現巨噬細胞標志物CD80的表達增加。Tβ4處理降低了CD80的表達，并減少了NF-κB的核轉移。免疫熒光結果表明，在Tβ4的作用下，巨噬細胞向M1型極化得到了抑制，炎癥反應得以減輕；同時，Tβ4可以減少巨噬細胞NF-κB的核轉移，抑制了NF-κB信號通路的效應。上述結果提示Tβ4具有抑制炎癥反應的作用，其機制可能與抑制NF-κB信號通路有關，同時與其抑制巨噬細胞的M1極化有關。

綜上所述，Tβ4顯示出對炎癥損傷的一定治療潛力，其作用機制可能涉及抑制NF-κB信號通路以及巨噬細胞的極化，從而發揮抗炎效果。這一發現對于開發新的抗炎藥物具有重要意義，特別是在治療由巨噬細胞極化失衡引起的膿毒癥方面。然而，Tβ4與NF-κB之間的直接相互作用及其在巨噬細胞極化中的具體機制仍需進一步研究來闡明。

利益沖突聲明：本研究未受到企業、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

參 考 文 獻

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（責任編輯：林燕薇）