RNA殺菌劑研究進展

中圖分類號：S482.2 文獻標志碼：A 文章編號：1002-2910（2025）02-0043-05

Research progress on RNA fungicides

CHEN Min1， ZHANG Wei1，LI Lili2， LIU Weiyun3， LI Ning4，LIU Baoyou1*

（1.Yantai Academy of Agricultural Sciences， Yantai，Shandong 2655oo， China; 2.Shandong Academy of Agricultural Sciences，JinanShandong 250131， China; 3.Shandong InstituteofPomology，Tai'an，Shandong 271000， China; 4.Qingdao Kangqiao Biotechnology Co. Ltd， Qingdao，Shandong ， China）

Abstract： RNA fungicides use RNA interference technology to inhibit or kill crop pathogenic bacteria by suppressing the expression of important functional genes. These fungicides have strong targeting and environmentally friendly characteristics， which are beneficial for green and precise prevention and control of crop diseases. The mechanism of RNA interference， dsRNA synthesis technology， research and development of RNA fungicides and their application in disease prevention and control were summarized. And the existing problems of RNA fungicides were analyzed， prospect for their future development trends was presented.

Key words： RNA fungicides; RNA interference; crop diseases; research progress

作物病害的發生給農業生產造成嚴重的經濟損失，目前對農作物病害的防控主要是采取化學農藥防控，但化學農藥過量使用導致病害抗藥性增強、農藥殘留超標、生物多樣性降低和環境污染等負面問題[1]，導致防治成本提高，還嚴重影響農產品品質和人體健康。據統計，“十三五”期間全國種植業農藥使用量年均27.03萬t，比“十二五”期間降低了 ，農藥品種的持續優化和新型高效環保農藥的研發使用，為持續降低農藥使用量發揮了重要作用。生物農藥是推進作物病蟲害綠色防控的重要農業投入品，目前常用的生物農藥主要有植物源農藥（如苦參堿、蛇床子素、印楝素等）、動物源農藥（如黃蜂毒素、沙蠶毒素等）、微生物源農藥（如蘇云金桿菌、枯草芽孢桿菌等）。隨著分子生物學研究的不斷深人和RNA十擾前沿技術的發展，RNA生物農藥有望成為作物病害防控領域的重要工具。RNA生物農藥是“第三次農藥革命”的重要產品，其具有較高的特異性和環境安全性，在防治農作物病害中有巨大潛力[。筆者對RNA殺菌劑的研究進展進行綜述，旨在加深農藥研究者、生產者和使用者對RNA殺菌劑的認識，為RNA殺菌劑新產品的研發和農作物病害的綠色防控提供參考。

1 RNA干擾的作用機制

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是指在生物進化過程中高度保守的，由雙鏈RNA（Double-strandedRNA，dsRNA）誘發的，導致信使RNA（MessengerRNA，mRNA）功能喪失的現象，根據抑制的類型不同，分為轉錄水平上的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）和轉錄后的基因沉默（Post-trans-criptional gene silencing，PTGS），兩種類型分別通過抑制轉錄前水平或轉錄后水平的基因表達，而誘導表型的缺失或者導致生物體死亡[4]。RNA殺菌劑是一種可以特異性結合靶標病菌中的同源mRNA，沉默相應基因的表達，從而干擾靶標生物的正常生長，導致病原菌死亡[5]，實現對作物病害的綠色防控。

2 dsRNA合成技術

目前用于dsRNA合成的方法主要有3種，分別為化學合成法、RNA聚合酶體外合成法和微生物發酵擴繁dsRNA法[。化學合成法是通過組裝核糖核苷酸合成兩條互補的單鏈RNA，并使這些互補的單鏈RNA退火形成dsRNA，然而這種方法存在合成周期長，dsRNA長度受限，合成成本高等問題[7]，主要適用于實驗室小規模的基因功能研究；RNA聚合酶體外合成法利用RNA聚合酶和cDNA反轉錄技術，在體外合成并純化獲得dsRNA，所得dsRNA具有穩定性強，純度高等優點[8]，但也存在合成過程復雜和成本高的問題，不適合大規模、低成本的工業化生產；微生物發酵擴繁dsRNA法是構建微生物工廠，利用微生物體內轉錄機制合成dsRNA，并借助微生物的快速發酵能力實現dsRNA的大規模生產。這種方法具有操作簡便、成本低、穩定性好等優勢，是目前dsRNA大規模生產最有效的方法之一[9]。因此，為實現dsRNA在生產實踐和農業領域應用，利用微生物發酵獲得dsRNA已成為研究熱點。Timmons等發現一種RNAⅢ型酶缺陷型的大腸桿菌變異株HT115，由于該菌株缺乏RNAⅢ型酶，dsRNA在其中能夠穩定存在而不易被降解，通過構建帶有目的基因片段的dsRNA載體，利用IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）誘導大腸桿菌表達dsRNA，實現dsRNA的低成本簡便化大規模生產[10]。在此基礎上，馬中正等進一步開發了一種基于BL21工程菌的高效合成dsRNA的方法，他們通過基因編輯敲除RNAⅢ編碼基因，從而實現dsRNA穩定表達，且表達效率顯著高于HT115菌株[11]。Park 等對蘇云金芽孢桿菌進行改造，使其合成具有抑制囊狀幼蟲病毒（Sacbroodvirus，SBV）活性的dsRNA，通過飼喂的方式，這種dsRNA能夠抑制鱗翅目昆蟲體內囊狀幼蟲病毒的復制[12]。Leonard 等對蜜蜂腸細菌（Snodgrassellaalvi）進行改造，使其能夠在蜜蜂腸道中穩定定殖并產生dsRNA，提高蜜蜂對病毒的抵抗力[13]。簡便、低成本dsRNA合成技術的成功研發和應用，加快了RNA農藥的發展速度。

3RNA殺菌劑的研發及防治作物病害

3.1 可噴灑型dsRNA

可噴灑型dsRNA是通過外源噴施靶向病原菌基因dsRNA，使病原菌相關基因沉默，達到防治植物病害的自的。直接噴灑具有使用簡便、易于推廣等優點。噴施在植物表面的dsRNA通過兩種方式進入致病菌體內，一種是植物細胞吸收dsRNA，再運輸到致病菌體內；另一種是致病菌直接吸收dsRNA。Koch等在植物表面噴灑含有熒光標記的dsRNA，在植物的木質部和韌皮部及篩管部細胞中檢測到dsRNA，證明植物細胞可以吸收外源的dsRNA[14]。在植物表面噴施dsRNA后，dsRNA分子能夠通過氣孔或者傷口進入植物體內，并且可以在植物體內傳導[15]，這為可噴灑型dsRNA進入植物體內來抵御有害生物的危害奠定了基礎。據研究報道，不同致病菌對dsRNA的吸收率不同，灰霉病菌、核盤菌、立枯絲核菌、黑曲霉菌和大麗輪枝菌能夠有效吸收dsRNA，致病疫霉、有益真菌綠木霉菌吸收dsRNA的效率較低，膠孢炭疽菌不能吸收dsRNA[16]。如何提高植物及致病菌對dsRNA的吸收率，提高抑菌效果，是當前研究的熱點。Wang等制備了可靶向疫霉菌羧酸酰胺類（CAAs）殺菌劑靶標蛋白纖維素合酶3（CesA3）和氟噻唑吡乙酮的靶標氧化固醇結合蛋白1（OSBP1）關鍵區域的CesA3－/OSBP1-dsRNAs，將其直接噴施于離體葉片或辣椒幼苗根莖部，能有效防治辣椒疫病[17]。Mcrae等研發出防治葡萄白粉病的可噴灑型dsRNA，合成的靶向基因dsRNA使病菌孢子產量降低了 5 3 % ～ 6 4 % ，并且顯著抑制葡萄白粉病的發生[18]。Ding等創制了一種智能響應酸性釋放的納米核酸抗病毒藥物，能夠有效降低HSP70基因的表達水平，有效抑制煙草花葉病毒（TMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）的發生[9]。由于dsRNA在環境中的穩定性相對低，dsRNA直接噴灑后可能因環境中的RNA酶、紫外線輻射等發生變性或降解，存在RNA干擾持效期較短、效果不穩定等問題，因此需要借助助劑提高dsRNA對病害的防治效果。此外，植物及植物病原菌對dsRNA的吸收效率也是影響RNA殺菌劑效果的重要原因之一。

3.2 納米材料遞送dsRNA

納米材料與dsRNA結合，不僅能保護dsRNA免受降解，還能增強dsRNA的傳遞能力，通過納米材料載體遞送dsRNA防治作物病害能夠顯著提高RNA殺菌劑的防治效果，為新型RNA殺菌劑的研發應用提供了新的突破口。由疫霉菌引起的晚疫病，對馬鈴薯生產造成了毀滅性的危害，Wang等利用納米材料星型陽離子聚合物SPc，研發出了一種基于dsRNA和植物免疫誘抗劑的自組裝多元納米新型生物制劑，通過納米材料載體SPc高效結合和遞送dsRNA，可實現對馬鈴薯晚疫病的防治[20]。Mitter等研發出一種有效防治黃瓜花葉病毒病的RNA農藥，其通過納米材料層狀雙氫氧化物LHD，通過靜電作用結合dsRNA，實現dsRNA的緩慢釋放和對黃瓜花葉病毒病的有效防控[21]。Ouyang等同時以PpAE1、PpAE2和 P p A E 3 為靶標，合成了防治大豆銹病菌的dsRNA，使用納米材料殼聚糖進行裝載遞送，顯著抑制了大豆銹病的發生[22]。Qiao等使用納米囊泡（AVs）包裹和遞送dsRNA，形成AV-dsRNA復合體，AV-dsRNA通過增加dsRNA的穩定性和持久性，AV-dsRNA處理可延長對番茄、葡萄和葡萄葉片的抗灰霉菌的水平，并且延長了dsRNA對作物果實和葉片的保護期[23]。Hao等將沉默玉米感病基因ZmFd3的dsRNA負載到CLPs和ALPs兩種脂質體中，降低了因外界環境因素等引起的dsRNA降解，dsRNA-CLPs/ALPs復合體可通過葉片和根部進入玉米體內，抑制玉米褪綠斑駁病毒和甘蔗花葉病毒對玉米的侵染[24]。Sharma等使用納米粘土作為馬鈴薯晚疫病靶向基因dsRNA的載體，通過生物活性測定、離葉測定和葉面噴霧法進行抑菌效果評估，結果顯示疫霉菌的生長、孢子形成和發病癥狀顯著降低，與dsRNA單用噴霧相比，以納米粘土作為載體的dsRNA噴霧處理后，抑菌效果顯著增加[25]。通過納米材料載體遞送dsRNA 顯著提高了dsRNA的穩定性和對dsRNA的轉運效率，若將納米材料作為RNA殺菌劑的助劑使用，會極大提高dsRNA對致病菌的干擾效率，提升RNA殺菌劑的防治效果和持效期。

3.3在作物中表達靶向病原菌dsRNA

通過轉基因技術，研究人員能夠在寄主作物中表達靶向病原菌dsRNA，從而啟動RNA干擾機制，有效殺死或抑制病原菌生長繁殖，提高作物對病害的抗性。Zhang等在棉花中表達了靶向大麗輪枝菌VdHI基因的dsRNA，獲得了抗黃萎病棉花株系35S-VdHli，提高了植株對棉花黃萎病的抗性[2。通過干擾SsGlcP基因的表達可有效降低甘蔗鞭黑粉菌的致病力，降低甘蔗黑穗病的發生，Wu等基于農桿菌介導的甘蔗遺傳轉化體系，以甘蔗ROC22品種為底盤，成功構建了以SsGlcP基因為靶標的宿主誘導的基因沉默轉基因甘蔗，在轉基因株系中成功干擾SsGlcP基因，使黑穗病發生率明顯下降，與對照相比，轉基因株系中黑粉菌的生物量顯著下降[27]。Zhu等構建了以合成MAP激酶基因PsFUZ7為靶標基因dsRNA的轉基因小麥品系，該品系通過穩定表達dsRNA，降解PsFUZ7基因轉錄物，從而對小麥條銹病產生良好的抗病性，來抵御小麥條銹病的危害[28]。Nowara等將表達靶向白粉病菌Blumeriagraminis葡聚糖轉移酶基因Avral0的dsRNA轉入大麥中，構建了轉基因大麥品系，顯著增強了大麥對白粉病的抗性，有利于白粉病的綠色防控[29]。Wang等在番茄中利用RNA干擾沉默灰葡萄孢Botrytiscinerea的DCL基因，降低了灰葡萄孢的致病性[30]。這些研究充分表明，在作物中表達針對病原菌的dsRNA是一種有效的病害防控策略。然而，轉基因作物的研發周期長、成本高及民眾接受度差等問題仍然不容忽視，與殺菌劑的研發相比，轉基因作物的開發周期通常更長。因此，從商業化應用的可行性和社會接受度等角度考慮，高效殺菌劑的研發是更高效、經濟的病害防控方案。

4小結與展望

隨著化學農藥長期使用產生的病蟲抗藥性、農藥殘留和環境污染等問題，急需研發新型生物農藥來部分替代化學農藥，以在保護環境的基礎上，實現對病蟲害的有效防控。RNA農藥是一類可以特異性結合靶標生物中特定基因，沉默靶標生物體內相應基因的表達[31.32]，從而干擾靶標生物的正常生長及其對寄主植物的危害，具有靶標專一性和環境友好性等特點。隨著納米技術、生物信息技術和現代農業技術的交叉融合，為dsRNA的合成、可噴灑型RNA殺菌劑的研發應用提供了載體[33.34]，有利于新型RNA殺菌劑的開發。

篩選合成能夠高效沉默作物病原菌靶向基因的dsRNA是RNA殺菌劑研發的基本條件。由于RNA配對有一定的“容錯率”[35]，RNA殺菌劑dsRNA不僅能與靶向基因的信使RNA結合，也存在與序列相似但不完全相同的其他信使RNA結合的可能性，導致其它基因發生沉默，從而降低了對靶向基因的沉默效率。因此，為了防止dsRNA的“脫靶效應”，確保dsRNA的特異性，必須篩選合成高效的作物病原菌靶向基因的dsRNA。

RNA殺菌劑和其他化學農藥、生物農藥一樣，存在其特有的優勢，但也存在著特有的弊端，最明顯的就是不易維持其環境穩定性[3。dsRNA作為雙鏈核糖核酸分子，農田環境中的高溫、紫外線、風雨吹刷等和生物體內的核酸酶均能破壞其穩定性。如何使用納米材料等包裹和遞送dsRNA提高其環境穩定性，是今后研究的重點方向。此外，不同作物、不同病原菌對dsRNA的吸收效率也不同，如何提高dsRNA進人植物和病原菌體內的效率，是實現商業化大規模生產RNA殺菌劑的關鍵。

《“十四五”全國農藥產業發展規劃》中指出優先發展RNA及小肽類生物農藥，為RNA農藥的發展提供了政策保障。但RNA殺菌劑目前還處于室內研究階段，尚缺少上市的RNA殺菌劑產品和在田間大面積應用防治作物病害的報道，迫切需要加大對RNA農藥的研發力度，突破技術壁壘，加快商品化進程。

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