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生防菌株YM3-3的鑒定和抑菌能力測定及發酵條件優化

2025-06-06 00:00:00王春明王春明1郭成郭成1周天旺周天旺1洪流洪流1徐生海徐生海2許永鋒許永鋒3
甘肅農業科技 2025年4期

中圖分類號:Q939.9;S513 文獻標志碼:A 文章編號:2097-2172(2025)04-0365-08

doi:10.3969/j.issn.2097-2172.2025.04.014

Identification, Antagonistic AbilityEvaluation, and Fermentation Optimization ofBiocontrol Strain YM3-3

WANG Chunming1, GUO Cheng1, ZHOU Tianwang1, HONG Liu’, XU Shenghai , XU Yongfeng (1.Institute of Plant Protection,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou Gansu 73oo7o, China; 2.Wuwei Agricultural Technology Extension Centre,Wuwei Gansu 733Ooo, China; 3. Zhangye Plant Protection Station, Zhangye Gansu 734Ooo, China)

Abstract:To providebiocontrol strainresources for high-eficiencyandsafe microbial pesticides,theendophytic Bacilus subtilisY3-3,strainithidaliocontrolotentialsolatefromaizlaveasdentifidndtermentationondisee optimized.Thisstudyprovidedtechnicalparametersandatheoreticalbasisoncontrolmaizediseasesasbiocontrolagents.The inhibitionfstoicEoe melonis,V andFusariumoxysporumf.sp.vesinfectum.)wasmeasuredbytheduralculture methodTheresultsshowed that ithadgood antagonistic effect,and the inhibition rate against 1O pathogenic fungi was (53.19±3.78) % to (81.94±1.54) % ,showing good biocontrol potential.Acdigtooicalndeealys,sdntfdilustiId optimizethefermentationconditions,theoptimizationexperimentofcultureconditions wascariedout.Theresultsshowedthatthe optimalulturete,mpeature,atioalspeed,p,ndlqdvomeer3d27C,5Orin7nd9Oespectielye optimal combination of fermentation medium was15 g/L mannitol, 2 . 5 g / L peptone,7.5 g/L potassium nitrate,and 5 . 0 g / L calcium carbonate.

KeyWords:Bacilussubtilis;YM3-3;Antagonisticability;Fermentationcondition; Orthogonal test; Culturecondition; )ptimization

自前,我國農作物病蟲害防治主要以化學農藥為主[1-2]。但是,長期大量的應用化學農藥,對土壤、大氣和水體等環境造成嚴重污染,對人、畜健康造成危害[2]。同時,大量使用化學農藥還導致病蟲抗藥性上升,化學農藥防治效果逐步降低,防治難度不斷增加。利用微生物或者微生物制劑防治病蟲害和清除農藥殘留是現今微生物學研究的一個熱點[3-4]。芽孢桿菌(Bacillus spp.)作為目前生物防治中研究較多的一類細菌[5],由于其生長快、營養簡單、極易分離培養、能產生抗逆性強的芽孢這一典型特征,更有利于作為生防菌劑進行劑型加工、生產和在環境中存活與定殖[6-10]。有研究發現,芽孢桿菌生防菌劑在穩定性和與化學農藥相容性等方面明顯優于其他生防菌「]。尤其枯草芽孢桿菌在防病、促生、提高產量等方面展現了優越的應用前景,是理想的生防菌篩選對象,已引起了植保工作者的極大關注[2]。楊興有等[13]發現,1株枯草芽孢桿菌(Bacillus.subtilis)菌株TBWR1,對煙草青枯病的防效可達 7 1 . 1 0 % ,與對照相比,TBWR1能顯著提高煙草株高、葉長、根長和莖粗。胡金雪等[14]研究發現,枯草芽孢桿菌對馬鈴薯瘡痂病的防效可達 4 9 . 3 5 % ,與空白對照相比可增產 1 4 . 5 1 % 。對于生防菌的開發和應用,不管是利用菌株的代謝產物還是菌株本身,都必須對其發酵工藝進行優化,這將為其進一步應用提供基礎數據「15]。有效活菌數是枯草芽孢桿菌在工業發酵中的重要指標[16-17],通過優化發酵培養基及其發酵條件能有效提高活菌數[17-18]。因此,本研究從玉米葉片內分離得到1株對多種病原真菌具有良好抑制效果的拮抗菌株YM3-3,通過形態學及16SrDNA和gyrB序列分析明確其分類地位,以有效活菌數為指標,采用單因素試驗和正交設計對其發酵條件進行優化,以期為開發安全、環保的微生物農藥提供菌種資源,為玉米病害的防治和生防菌劑的開發和利用提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試培養基NA培養基、PDA培養基的具體成分參考方中達[9的方法并制作。

1.1.2發酵基礎培養基試驗共涉及以下8種基礎培養基,具體成分見表1。

1.1.3供試菌株供試菌株分別為YM3-3(分離自玉米葉片)、玉米穗腐病病原菌(擬輪枝鐮孢菌Fusariumverticillioides)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、西瓜蔓枯病菌(Mycosphaerellamelonis)、蘋果腐爛病菌(Valsamali)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、茄子菌核病菌(Sclero-tiniasclerotiorum)、馬鈴薯立枯絲核病菌(Rhizocto-niasolani)、番瓜綿腐病菌(Pythiunaphaniderma-tum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vesinfectum),以上供試菌株均由甘肅省農業科學院植物保護研究所提供。

1.2試驗方法

1.2.1菌株YM3-3鑒定參考東秀珠等[20]的方法,進行形態學觀察,結合16SrDNA和gyrB序列分析對其進行鑒定,具體參考王春明等[21的方法。1.2.2生防菌株YM3-3抑菌能力測定參考蔣晶晶等[8]的方法,采用平板對峙法進行抑菌能力測定。

1.2.3菌株YM3-3發酵條件優化種子液制備參考蔣晶晶等[8]和臧超群等[22]的方法進行,將保存的菌株YM3-3接入NA平板活化, 下培養24h。后將活化好的菌株接入NA培養液中,150 條件下振蕩培養 4 8 h ,備用。發酵液濃度計算采用稀釋涂布平板法進行[8],每個稀釋濃度均重復3次,于 恒溫倒置培養 3 d ,統計菌落數(即活菌數)。不同培養基對YM3-3菌株生長量影響分別向裝有 的A、B、C、D、E、F、G、H培養液的三角瓶中加入 1 m L 種子液,每處理重復3次。 、 1 5 0 r / m i n 條件下振蕩培養3 d ,測定各處理活菌數。不同培養條件對菌株YM3-3生長量的影響參考蔣晶晶等[8]的方法略做修改,分別進行不同培養時間(1、2、3、4、5、6 、 7 、 8 、 9 、 1 0 d) 、溫度 ( 2 0 、 2 5 、 2 7 、 3 0 、 3 5 、 )、轉速(90、120、150、180、 2 1 0 r / m i n )、起始 Δ p H (3、4、5、6、7、8、9、10)、裝液量(30、50、70、90、110、 1 3 0 m L 、碳源(蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇)、氮源(尿素、硝酸銨、硝酸鉀、磷酸二氫銨、氯化銨)和無機鹽(碳酸鈣、硫酸鈣、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鎂)對菌株YM3-3生長量的影響篩選試驗。培養時間、溫度、轉速、起始 、碳源、氮源和無機鹽等各試驗中的每處理裝液量均為 1 0 0 m L ,接種量均為 1 m L 種子液;裝液量試驗則按裝液量 1 % 接入種子液;以上各試驗的每處理重復3次。在 (溫度試驗除外)1 5 0 r / m i n (轉速試驗除外)條件下振蕩培養3d(培養時間除外),測定各處理的活菌數。

表1不同基礎培養基具體成分

1.2.4發酵培養基最佳組合正交試驗依據上述單因素試驗結果,在單因素篩選出的最佳發酵條件下,選取了碳源(甘露醇)、有機氮(蛋白陳)無機氮(硝酸鉀)和無機鹽(碳酸鈣)4個因素的3個水平(表2),設計 正交試驗,對發酵培養基成分進行優化。

表2發酵培養基正交試驗因子水平①

① 表中A因子的 0 . 5 0 % 、 1 . 0 0 % 和 1 . 5 0 % 分別指每100m L 培養液中含甘露醇的量,單位為 g ;B、C、D因子的0 . 2 5 % 、 0 . 5 0 % 、 0 . 7 5 % 分別指每 培養液中含蛋白胺、硝酸鉀、碳酸鈣的量,單位均為

1.3數據統計分析

采用 E x c e l2 0 1 0 和SPSS20.0軟件對試驗數據進行整理分析。

2 結果與分析

2.1菌株YM3-3鑒定結果

菌株YM3-3菌落在NA培養基上顯示乳白色、表面有褶皺,邊緣不規則(圖1A),菌體桿狀、中生芽孢, (圖1B)。用 軟件構建基于16SrDNA和 g y rB 的系統發育樹(圖2),YM3-3與枯草芽孢桿菌(QH-668、QH-664、NN11、DY3)聚在一個分支,故將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

(A為NA培養基上的菌落形態,B為革蘭氏染色后的菌落形態)圖1菌株YM3-3培養特性圖2基于16SrDNA和gyrB建立的菌株YM3-3系統發育樹

100BacillussubtilisQH-668 77]Bacillus subtilis QH-664 65Bacillus subtilis NH11 100 Bacillus subtilis DY3 100 BacillusvelezensisLBUM288 -BacillusvelezensisBCRC17467 100 100 79-BacillusamyloliquefaciensWZS01 93-Bacillusamyloliquefaciens T23 60fBacilluspumilusNMTD17 BacilluspumilusBP-hd-1 100Bacilluspumilus ATCC27142 91Bacillus pumilus 17 91Bacillus pumilusBKS1-108 -PriestiamegateriumNRCB001 -BacilluscereusXWH120710-1 100 BacilluscereusYB50 0.020

2.2 YM3-3抑菌能力測定結果

由試驗結果可知,菌株YM3-3對玉米大斑病菌、玉米穗腐病病原菌(擬輪枝鐮孢菌)等10種植物病原真菌均有一定的抑制效果(表3、圖3),抑制率為 ( 5 3 . 1 9 ± 3 . 7 8 ) % ~ ( 8 1 . 9 4 ± 1 . 5 4 ) % ,抑菌帶寬度為 ( 4 . 0 ± 0 . 5 )~( 8 . 8 ± 0 . 7 ) m m 。尤其對玉米大斑病菌的抑制效果最好,平均抑制率達 8 1 . 9 4 % :其次對玉米穗腐病病原菌 (擬輪枝鐮孢菌)、西瓜蔓枯病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果腐爛病菌和茄子菌核病菌也具有較強的抑制效果,平均抑制率均在6 0 . 0 0 % 之上,平均抑菌帶寬度也均在 6 . 0 m m 之上。綜合抑制率和抑菌帶寬度可知,菌株YM3-3對玉米大斑病菌、玉米穗腐病病原菌(擬輪枝鐮孢菌)茄子菌核病菌和西瓜蔓枯病菌的抑制效果較好。

2.3發酵基礎培養基篩選結果

如圖4所示,菌株YM3-3在8種培養液中均可生長,在相同培養條件下培養液A中活菌數最多,其常用對數值為8.94,顯著高于其他各處理0 ( Plt;0 . 0 5 ) ;其次是培養液C、H,活菌數常用對數值分別為8.22、7.94;G培養液中活菌數最少,活菌數常用對數值僅為7.03。因此,培養液A可作為后續發酵基礎培養基。

圖4不同培養基對菌株YM3-3生長量的影響

2.4不同培養條件對菌株YM3-3生長量的影響2.4.1培養時間對菌株YM3-3生長量的影響菌株YM3-3在培養 內均能生長(圖5A),最

表3菌株YM3-3對10種植物病原真菌的抑菌作用
圖3菌株YM3-3對10種植物病原真菌的拮抗譜

[-1為處理,-2為對照;A為玉米穗腐病病原菌(擬輪枝鐮孢菌),B為玉米大斑病菌,C為西瓜蔓枯病菌,D為蘋果輪紋病,E為斗果腐爛病菌,F為茄子菌核病菌,G為馬鈴薯立枯絲核病菌,H為番瓜綿腐病,I為辣椒疫霉病菌,J為棉花枯萎病菌]。

2.4.2培養溫度對菌株YM3-3生長量的影響菌株YM3-3在供試的不同溫度下均能正常生長(圖5B),最佳培養溫度為 ,活菌數常用對數值為8.94,其與 3 0 % 條件下活菌數(常用對數值為8.86)差異不顯著( Pgt;0 . 0 5 ),但與其他各處理差異顯著( Plt;0 . 0 5 )。

2.4.3轉速對菌株YM3-3生長量的影響菌株YM3-3在供試的不同轉速下均能生長(圖5C),最佳轉速為 1 5 0 r / m i n ,活菌數常用對數值達為8.57,與 1 2 0 r / m i n 條件下活菌數(常用對數值為8.38)差異不顯著( P gt; 0 . 0 5 ),但與90、180、 條件下各處理均差異顯著( Plt;0 . 0 5 )。

2.4.4起始 Δ p H 對菌株YM3-3生長量的影響 Δ p H 為3\~10時,菌株YM3-3均能生長(圖5D),最佳 為7,活菌數常用對數值達8.94; Δ p H 為3時,活菌數最低(常用對數值為7.47),與其他處理差異顯著( Plt;0 . 0 5 ;但 為6、7、8時,活菌數差異不顯著( Pgt;0 . 0 5 )。進一步分析可知, 為8、9、10時活菌數顯著高于 為3、4、5時活菌數( Plt;0 . 0 5 ,說明該菌株能適應偏堿環境。

2.4.5裝液量對菌株YM3-3生長量的影響裝液量的多少在發酵過程中起著很大的作用,此次試驗中裝液量為30、50、70、90、110、 1 3 0 m L 時,菌株均能很好的生長(圖5E);裝液量為 9 0 m L 時活菌數常用對數值最高,為9.62,顯著高于其他各處理( Plt;0 . 0 5 )。

2.4.6碳源對菌株YM3-3生長量的影響菌株YM3-3在供試的7種碳源中均能生長(圖5F),最佳碳源為甘露醇,活菌數常用對數值為8.60;其次為甘油,活菌數常用對數值為8.53;可溶性淀粉居第3,活菌數常用對數值為8.52,三者活菌數差異均不顯著( Pgt;0 . 0 5 )。

2.4.7氮源對菌株YM3-3生長量的影響菌株YM3-3在供試的6種氮源中均能生長(圖5G),最佳氮源為硝酸鉀,活菌數常用對數值為8.57,與蛋白肺作為氮源時活菌數差異不顯著 Pgt;0 . 0 5 )。硝酸銨作為氮源時,活菌數最少(常用對數值為6.89),與其他處理均差異顯著( Plt;0 . 0 5 )。

2.4.8無機鹽對菌株YM3-3生長量的影響無機鹽對菌株生長具有一定的影響,當培養液中含有一定濃度時,有利于其繁殖,本次試驗中加入無機鹽碳酸鈣 0 . 5 0 % 時,菌液中的活菌數最多(常用對數值為8.82),與其他各處理差異顯著( Plt;0 . 0 5 )(圖5H)。

綜合考慮各試驗條件下活菌數及成本等因素,菌株YM3-3的最佳培養時間為 3 d ,最佳培養溫度為 ,最佳轉速為 1 5 0 r / m i n ,最佳 為7,最佳裝液量為 9 0 m L ;最佳碳源、氮源和無機鹽分別為甘露醇、硝酸鉀/蛋白脈、碳酸鈣。由于有機氮和無機氮在菌株發酵過程中對菌株的生長和代謝作用不同,故后續發酵培養基成分優化中對有機氮(蛋白肺)和無機氮(硝酸鉀)進行一定配比優化。

2.5培養基成分最佳組合正交試驗結果

由試驗結果(表4)可知,9個組合中第7個組合中活菌數量最高,菌落數量常用對數值達10.91以上。利用SPSS軟件對正交試驗數據進行分析發現,培養基最佳組合中極差R依次排列為 ,說明各因素在該菌株發酵過程中產生活菌數量影響大小順序依次為蛋白陳、甘露醇、碳酸鈣、硝酸鉀。從表5方差分析可知,甘露醇、蛋白陳及碳酸鈣對該菌株發酵過程中活菌數量的影響極顯著( Plt;0 . 0 1 ),硝酸鉀對其影響較為顯著0 ? Plt;0 . 0 5 ? 。且根據表4中,A列 值最大,B列 值最大,C列 值最大,D列 值最大,故得出最佳發酵組合為 ,與正交試驗中組合7對應。綜合分析可看出,發酵培養基的最優組合為 1 . 5 0 % 甘露醇、 0 . 2 5 % 蛋白陳、 0 . 7 5 % 硝酸鉀和0 . 5 0 % 碳酸鈣,即 1 5 . 0 g / L 甘露醇、 蛋白肺、 硝酸鉀、 5 . 0 g / L 碳酸鈣。

表4培養基成分最佳組合正交試驗結果
表5培養基成分正交試驗方差分析
”表示差異顯著( P lt; 0 . 0 5 , ,“**”表示差異極顯著( P lt; 0.01)。

3討論與結論

生防細菌抗菌譜的寬窄直接決定著生防菌的應用前景,許多分離得到的生防菌由于其抗菌譜太窄在實際生產應用中受到很大的限制,因此篩選廣譜性的生防菌已成為植物病害生物防治的關鍵所在[23]。本研究篩選出的菌株YM3-3抑菌譜較廣,對供試的涉及9個屬10個種的植物病原真菌均有不同程度的抑制作用,是一株具有良好生防潛能的內生細菌,根據形態學觀察及16SrDNA和gyrB序列分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis)。

對于不同的微生物,其生長代謝都有自己所適宜的條件,營養物質的種類及其濃度,培養時間、溫度、通氣量等因素均影響微生物的生長代謝[15]。這些因素不僅相互促進,也相互制約。如宋卡魏等[24]研究表明,枯草芽孢桿菌(菌株B68)發酵最佳碳源為葡萄糖,添加一定量的氯化鈉和碳酸鈣能促進芽孢的產生;蔣晶晶等[8]研究表明,貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezenis)(菌株X1-6-1)發酵最佳碳源為可溶性淀粉,最佳氮源為牛肉膏,最佳無機鹽為氯化鎂;劉曉霞等[25]研究表明,枯草芽孢桿菌(菌株ATCC6051)發酵最佳碳源為蛋白脈 2 . 5 % ),最佳碳源為檸檬酸 2 . 0 % ),最佳無機鹽為硫酸鉀 ( 2 . 4 % ;郭世杰等[8]研究表明,枯草芽孢桿菌(菌株EBS03)發酵最佳碳源為甘露醇0 1 . 8 % ,最佳氮源為蛋白陳( 2 . 1 % ),最佳無機鹽為硫酸鎂! ( 1 . 9 % ) 。由此可知,不僅不同種類的生防細菌發酵最適培養基與培養條件等差異較大,而且同種生防細菌的發酵最適培養基和培養條件也存在差異[8]。因此,本研究對枯草芽孢桿菌YM3-3菌株進行了發酵基礎培養基、培養條件篩選和培養基組分優化試驗,結果表明,最佳培養條件為培養時間 3 d 、培養溫度為 、轉速為1 5 0 r / m i n 、 為7、裝液量為 9 0 m L ;發酵培養基的最優組合為: 1 . 5 0 % 甘露醇、 0 . 2 5 % 蛋白陳、0 . 7 5 % 硝酸鉀和 0 . 5 0 % 碳酸鈣,即 甘露醇、2 . 5 g / L 蛋白肺、 7 . 5 g / L 硝酸鉀、 5 . 0 g / L 碳酸鈣,這與郭世杰等[18]對最佳碳源和最佳氮源的研究研究結果一致,但與其含量和最佳培養條件有差異。

綜上所述,菌株YM3-3具有廣譜的抗菌活性,是1株具有優良生防潛能的枯草芽孢桿菌。通過優化發酵條件,可以顯著提高其活菌數和生防效果,為開發安全、高效的微生物農藥提供了有力支持。未來的研究將進一步探討其生防機制,為其在實際生產中的廣泛應用提供更多的科學依據。生防細菌主要通過競爭、產生抗菌物質、促生、誘導等方式直接或間接對作物起到防病或促生作用[26-31]。在本次研究中并未對其產生的抑菌物質種類及發酵過程中活菌數與抑菌物質積累量、抑菌活性的相關性等進行研究,因此在后續試驗中還需對其進一步進行研究。

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