抗蟲轉基因玉米對草地貪夜蛾的室內抗性水平鑒定

中圖分類號：S435.132 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）03-0061-0

引用格式：，等.抗蟲轉基因玉米對草地貪夜蛾的室內抗性水平鑒定[J].湖南農業科學，2025（3）：61-66

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.003.011

Evaluation ofResistance ofInsect-Resistant Transgenic Maize to Spodoptera frugiperda inLaboratory

XIONG Mei， SONG Jun，WEI Chao，LI Hui， YANG Qiang，DAI Xiao-hang，LIU Wen-juan （InstituteofQualittandardndTestingTechnologyResearch，ichuanAcademyofAgricuturalSciences，Chengdu06

Abstract：With the transgenic maize carrying C r y I A b and thatcarrying Vip3Aa20 asdonors， Cry1Ab and Vip3Aa20 were introduced intothemaizecutivarXianda90l'byrossbreeding.Theesistanceofinsect-resistantransgenicmaizetoSodopterafrgiperdwas evaluatedbyinvitrotisseboassayandthecontentofexogenousproteiswasdeteredbyee-linkedimmunosobntaay Theresultsofbioassayandproteidetectionconfirmedeachother.Theresultsshowedthattransgenic'Xianda90l'stablyexpreed exogenousproteinsCryAbandVip3Aa2OathighlevelsinalltssuesatallstagesandhadstronglethaleffectonS.frugiperda， demonstratingapromising commercial application prospect.

Keywords：insect-resistanttrasgenicmaize;Spodopterafrugiperda;evaluationofresistanceinlaboratory;CryAb;ViAa

隨著生物育種技術的迭代升級，轉基因作物已在全球范圍內迅速推廣并投入應用。1996年轉基因作物商業化種植，2023年全球轉基因作物種植面積達2.063億 。從種植面積來看，轉基因玉米和大豆憑借抗蟲、耐除草劑及其復合性狀的技術優勢，持續占據主導地位[1]。我國于2021年正式啟動轉基因玉米大豆產業化試點；2023年將試點范圍擴展至河北、內蒙古、吉林、四川和云南5個省區的20個縣，同步在甘肅安排制種；至2024年，在原有試點省區基礎上，新增甘肅、廣西和遼寧3省區，形成覆蓋8省區的示范種植網絡。2023年12月7日，我國農業農村部發布第732號公告，發布首批37個轉基因玉米品種和14個轉基因大豆品種，經第五屆國家農作物品種審定委員會第四次會議審定通過。為落實2024年中央一號文件“推動生物育種產業化擴面提速”的要求，2024年10月8日農業農村部第830號公告，再度批準27個轉基因玉米品種和3個轉基因大豆品種（第五屆審定委員會第六次會議通過），轉基因作物在我國的發展勢不可擋。當前我國轉基因產業仍處于示范階段，在審慎推進示范種植的同時有序擴大產業化應用范圍。

草地貪夜蛾（Spodopterafrugiperda）屬于鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬，又稱秋粘蟲，是一種雜食性昆蟲，取食范圍廣，可取食46科202種作物，包括玉米、水稻、小麥、高梁、大豆、棉花、花生、煙草、甘蔗和甜菜等[-4]。2019 年1月，草地貪夜蛾從緬甸經云南入侵我國，并在國內迅速傳播擴散[2-3]。截至2023年，僅黑龍江、吉林、遼寧、新疆和青海5省區未監測到草地貪夜蛾蹤跡[5]。草地貪夜蛾具有極強的遷飛能力和適應性，持續威脅玉米等主糧作物，造成巨大的經濟損失，甚至威脅糧食安全[3]。我國現存草地貪夜蛾以危害玉米的“玉米型”為主，但基因組測序顯示其攜帶水稻適應性基因標記，存在向“水稻型”演變的潛在風險[5-6]。

利用轉基因技術培育抗蟲新品種是一種防治草地貪夜蛾的重要方法。目前全球主要通過種植轉 C r y 基因和Vp基因的玉米來防治草地貪夜蛾，但在大規模持續種植的選擇壓力下，草地貪夜蛾很快演化出對Bt基因的抗性[]。在美國發現了抗CrylA.105、CrylF的草地貪夜蛾品系；在波多黎各發現了抗CrylAb、Cry1Ac和CrylF的草地貪夜蛾品系；在巴西發現了抗CrylAa、CrylA.105、CrylAb、CrylAc、Cry2Ab2和Cry1F的草地貪夜蛾品系；在阿根廷發現了抗CrylA.105、Cry2Ab2和CrylF的草地貪夜蛾品系[8-17]。Bermardi等[18]在巴西草地貪夜蛾種群中，檢測到了Vip3Aa20的抗性等位基因，雖然這個等位基因在巴西草地貪夜蛾種群中的發生頻率非常低，但依然有演化出抗性的風險。入侵我國的草地貪夜蛾對Cry蛋白不敏感，對Vip蛋白敏感。在我國通過品種審定的64個轉基因玉米品種中，有33個品種的轉化體為DBN9936，12個品種的轉化體為瑞豐125，12個品種的轉化體為ND207，3個品種的轉化體為DBN3601T，2個品種的轉化體為 B t l1 × GA21，1個品種的轉化體為DBN9858，1個品種的轉化體為 B t 1 1 × M I R 1 6 2 × G A2 1 。這些轉化體轉入的均是抗鱗翅目昆蟲／耐除草劑基因，大多只轉入了 C r y 基因，只有2個轉化體轉入了 基因。轉基因玉米能否穩定高劑量的表達外源蛋白是防治靶標害蟲的關鍵，同時高劑量/庇護所策略也是應對和延緩靶標害蟲抗性演化的重要措施[14]。當前，隨著草地貪夜蛾對多種抗蟲蛋白抗性的擴散，迫切需要科學、準確、合理地評價抗蟲轉基因玉米對草地貪夜蛾的抗性水平，以期為抗蟲品種的選育提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括轉 C r y I A b 和Vip3Aa20基因玉米先達901（簡稱轉基因玉米先達901），對應的非轉基因對照玉米，均由先正達生物科技（中國）有限公司提供；感蟲對照（中玉335），由仲衍種業股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1樣 種植采用隨機區組設計，3次重復，小區面積為 （ ），行距 6 0 c m ，株距2 5 c m 。土壤水肥雜草管理與常規栽培管理相同，全生育期不噴施殺蟲劑。

1.2.2室內生物測定（1）試驗蟲源。草地貪夜蛾卵由中國農業科學院油料作物研究所（武漢）提供。草地貪夜蛾卵放置在 、光周期 相對濕度 70 %～8 0 % 的培養箱內孵化，卵孵化出的初孵幼蟲（孵化后不超過 2 4 h 的幼蟲）用于生物測定試驗。

（2）樣品采集。心葉期（小喇叭口期），即玉米植株發育至8＼～10葉，采集幼嫩心葉帶回室內；吐絲期，采集新抽絲未授粉的整顆雌穗帶回室內，取花絲試驗；灌漿期，采集整顆雌穗帶回室內，取籽粒試驗。采用5點取樣法，每點選取4株長勢相同的玉米植株，在不同時期采集相應的玉米樣品

（3）生物測定。心葉抗性測定時，用濕毛巾輕輕擦拭幼嫩心葉表面的污濁物，然后將其放人養蟲盒內。每個養蟲盒放入1片心葉，接入5頭草地貪夜蛾初孵幼蟲，1盒為1個重復，每個生物學平行重復20次。每天觀察葉片情況，如有發霉或者干枯的則需更換相同來源的新鮮葉片組織。花絲抗性測定時，剝開玉米雌穗，輕取花絲（花絲不宜過多）放入養蟲盒內，每盒接入5頭草地貪夜蛾初孵幼蟲，1盒為1個重復，每個平行重復20次。籽粒抗性測定時，用12孔板養蟲盒，每孔放入1粒籽粒（籽粒不能有損傷，否則易發霉），接入1頭草地貪夜蛾初孵幼蟲，1孔為1個重復，每個平行重復100次。每天觀察籽粒情況，如有發霉或者干癟的則需更換相同來源的新鮮組織。草地貪夜蛾均放置在溫度 、光周期 C L： D ）、相對濕度 70 %～8 0 % 的人工氣候環境中培養。

（4）數據統計。心葉、花絲和籽粒均在第6天記錄幼蟲存活數，并按照公式（1）計算幼蟲死亡率或者校正死亡率。用SPSS20.0對死亡率進行方差分析和LSD多重比較。

式中， x 為死亡率； n 為存活數，頭； N 為接蟲數，頭。

草地貪夜蛾對轉基因玉米的抗性評定標準參照轉基因植物及其產品環境安全檢測（農業部1943號公告-3-2013），結合實驗室多年對草地貪夜蛾生物測定數據，制定了草地貪夜蛾對轉基因玉米的抗性評定標準，按幼蟲死亡率分5級，分別為高抗（ y ≥ 9 0 % ）抗（ 9 0 % gt; y ? 8 0 % ）、中抗（ 8 0 % gt; y ≥ 5 5 % ）感（ 5 5 % gt; y ? 4 0 % ）和高感（ 4 0 % gt; y ）。1.2.3 外源蛋白表達量檢測小喇叭口期（8＼～10葉期）采集心葉，吐絲期采集花絲，灌漿期采集籽粒，方法同室內生測。新鮮玉米葉片、花絲和籽粒樣品用液氮冷凍研磨儀（SPEX6875）研磨成粉末，稱取

0 . 1 g （精確到 ）試樣粉末于 的離心管中，按質量體積比 1 ： 1 0 加入提取緩沖液，震蕩混勻后置于搖床中提取 1 0～1 5 m i n 。從搖床中取出樣品， 離心 5 m i n ，取上清液備用。

選用上海佑隆生物科技有限公司的Cry1Ab/Ac酶聯免疫定量檢測試劑盒和Vip3A酶聯免疫定量檢測試劑盒，分別測定Cry1Ab蛋白和Vip3Aa20蛋白含量。按照試劑盒說明書檢測外源蛋白含量并繪制標準曲線，用酶標儀（TECANSPARK）在 波長下讀取吸光度值。根據公式（2）計算試樣中的外源蛋白含量。

ω = （ a + b × X ） × N

式中， ω 為蛋白濃度（ n g / g 鮮重）； a 為截距；b 為斜率； X 為光密度值； N 為稀釋倍數。

用SPSS20.0對蛋白含量進行T-test檢驗，取顯著水平 P lt; 0 . 0 5 判斷差異是否顯著。

2 結果與分析

2.1 室內生物測定結果

室內生物測定結果顯示（表1），取食轉基因玉來先達901心葉的草地貪夜蛾幼蟲全部死亡，取食轉基因玉米先達901花絲和籽粒的幼蟲有個別存活，但死亡率均大于 9 5 % ，取食非轉基因對照和感蟲對照相應部位的幼蟲死亡率均小于 40 % 。轉基因玉米先達901的心葉、花絲和籽粒對草地貪夜蛾的抗性等級均為高抗。轉因玉米先達901的幼蟲平均死亡率為 9 9 . 2 6 % ，非轉基因對照的幼蟲平均死亡率為1 0 . 1 2 % ，感蟲對照的幼蟲平均死亡率為 1 3 . 0 9 % ，轉基因玉米先達901的幼蟲死亡率與非轉基因對照和感蟲對照的幼蟲死亡率均差異顯著。綜合心葉、花絲和籽粒的抗性表現，轉基因玉米先達901對草地貪夜蛾的抗性等級評定為高抗。草地貪夜蛾取食對照玉米和轉基因玉米先達901不同部位后的抗性特征見圖1。

2.2 Bt蛋白檢測結果

試驗研究了心葉期（8＼～10葉）吐絲期（新抽絲未授粉）和灌漿期轉基因玉米先達901中外源抗蟲蛋白CrylAb和Vip3Aa20在心葉、花絲和籽粒中的表達量。由表2可知，研究結果表明心葉中CrylAb蛋白的表達量為（ 1 5 7 6 5 . 6 5 ± 1 0 0 9 . 4 3 ） n g / g 鮮重，與非轉基因對照差異顯著；花絲中CrylAb蛋白的表達量為（ 6 4 7 . 2 3 ± 2 4 . 9 5 ） n g / g 鮮重，與非轉基因對照差異顯著；期籽粒中Cry1Ab蛋白的表達量為（ ） n g / g 鮮重，與非轉基因對照差異顯著。玉米外源抗蟲蛋白Cry1Ab在心葉中的表達量最高，在籽粒中的表達量其次，在花絲中的表達量最低。心葉中 V i p 3 A a 2 0 蛋白的表達量為（ 1 3 3 2 4 . 1 7 ± 3809.89） 鮮重，與非轉基因對照差異顯著；花絲中 V i p3 A a2 0 蛋白的表達量為（ 1 0 1 0 8 . 9 8 ± 1 9 4 2 . 4 5 ） n g / g 鮮重，與非轉基因對照差異顯著；籽粒中 V i p3 A a2 0 蛋白的表達量為（ 2 7 4 4 5 . 9 0 ± 2 0 0 2 . 8 1 ） n g / g 鮮重，與非轉基因對照差異顯著。玉米外源抗蟲蛋白 V i p3 A a2 0 在籽粒中的表達量最高、在心葉中的表達量其次，在花絲中的表達量最低。

研究結果表明， C r y I A b 和Vip3Aa20在轉基因玉米先達901的心葉中均高劑量表達，Vip3Aa20在花絲和籽粒中也高劑量表達，但 C r y I A b 在花絲和籽粒中的表達量相對于其在心葉中的表達量而言明顯偏低。雖然 C r y I A b 在花絲和籽粒中的表達量偏低，但是Cry1Ab蛋白和Vip3Aa20蛋白有協同增效作用，轉 C r y I A b 和Vip3Aa20基因玉米先達901依然能殺死幾乎所有的草地貪夜蛾個體，對草地貪夜蛾表現出高抗。蛋白檢測結果與生測結果相互印證。結合庇護所策略，轉 C r y I A b 和Vip3Aa20基因玉米先達901將能有效應對草地貪夜蛾的為害，具有較好的商業化應用前景。

在非轉基因對照玉米的心葉期（8＼～10葉）葉片、吐絲期花絲（新抽絲未授粉）中的均沒有檢測到外源抗蟲蛋白CrylAb和 V i p3 A a2 0 ，灌漿期籽粒中小于 的數值可能是由于基因漂移引起的，含量非常低，對草地貪夜蛾的存活幾乎沒有影響。

3 討論與結論

當前的研究通常采用5級法、Williams9級法和Davis9級法來評價草地貪夜蛾對玉米植株的為害程度[19-21]。例如：Toepfer等[19]提出了葉片5級法和整體植株5級法來評價草地貪夜蛾對玉米植株的為害程度；黃建榮等[2分別評估了5級法（葉片5級法和整體植株5級法）與Williams9級法和Davis9級法評價草地貪夜蛾對玉米植株為害程度評價結果的相關性，結果表明5級法的評價結果與Williams9級法和Davis9級法的評價結果均存在極顯著的線性關系，但5級法操作性最佳；丁蝶等[22]制定了草地貪夜蛾對玉米為害的六級分級標準。田間分級標準可以為蟲情測報和害蟲防治提供依據，但在抗蟲轉基因作物抗性水平評價方面的應用有一定的局限性。因為環境因素不穩定，例如惡劣天氣、天敵、非靶標害蟲等均會干擾田間接蟲效果，從而影響轉基因抗蟲玉米對靶標害蟲的抗性評級。

室內條件相對穩定，可以為昆蟲創造理想的生存條件，干擾試驗結果的因素相對少，從而可以建立相對客觀、全面、穩定的評價體系。但試驗材料的品質會影響生物測定試驗的效果。例如：損傷易引起試驗材料發霉、腐爛，從而影響試驗效果；濕度過高也易引起試驗材料變質，濕度過低易引起試驗材料干癟。因此，試驗材料如何保鮮，也是生物測定試驗需要解決的問題。試驗中采用的心葉、花絲和籽粒都在最大程度上保證了試驗材料的完整性，溫度和濕度均控制在合適的范圍內，第6天統計數據時，基本能保證試驗材料的新鮮度。營養期Vip3Aa蛋白對鱗翅目昆蟲具有高度的殺蟲活性，常和Cry蛋白一起應用于轉基因作物中，用來治理靶標害蟲對Cry蛋白的抗性或增加殺蟲圖譜數等[23]，但這要求其基因在各時期各部位穩定高劑量的表達，才能達到治理靶標害蟲的目的。外源抗蟲蛋白在不同時期不同部位的表達量差異較大[24-25]，因此在評價玉米材料對草地貪夜蛾抗性時，需要分時期分部位進行評價。

抗蟲轉基因作物中外源殺蟲蛋白的表達量對靶標害蟲防治至關重要。研究抗蟲轉基因作物不同時期不同部位的外源蛋白表達量，一方面可以為抗蟲轉基因作物的商業化推廣應用提供數據支撐，另一方面也可以與生物測定結果相互印證。李國平等[2]將Bt蛋白添加到飼料表面，生物測定結果表明，Vip3A對草地貪夜蛾的致死作用最強，Cry1Ab對草地貪夜蛾的生長發育抑制作用最強。張丹丹等[27]采用室內生物測定方法研究抗蟲玉米對草地貪夜蛾的毒殺作用，結果表明Bt-CrylAb玉米和Bt-（CrylAb+Vip3Aa）玉米對草地貪夜蛾均有毒殺作用，1齡幼蟲的校正死亡率分別為 5 9 . 2 3 %～6 5 . 4 1 % 和 100 % 。目前，我國的抗蟲轉基因玉米大多是轉 C r y 基因，少數轉入了 基因。只轉入了 C r y 基因的抗蟲轉基因玉米對草地貪夜蛾的防治效果不佳，同時轉入了C r y 基因和 基因的抗蟲轉基因玉米對草地貪夜蛾的防治效果也要依賴其在玉米各時期各部位是否穩定高劑量表達。同時，穩定高劑量地表達外源殺蟲蛋白也有利于延緩靶標害蟲抗性的產生。

試驗采用了生物測定的方法對轉基因玉米先達901在心葉期、吐絲期和灌漿期對草地貪夜蛾的抗性表現進行了評價，同時，分析了外源殺蟲蛋白CrylAb和Vip3Aa在各時期各部位中的表達量，與生測結果互相印證。結果表明，轉基因玉米先達901對草地貪夜蛾的抗性高，具有較好的商業化應用前景。同時，本文的評價方法也可應用于其他抗蟲轉基因玉米品種對抗草地貪夜蛾的抗性評價。

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（責任編輯：肖彥資）