戊二醛和聚維酮碘對草魚后腸免疫和腸道菌群的影響

我國是水產大國，2021年全國水產總產量為6690.29萬t，全國水產品人均占有量為47.36kg^[1] 。近年來，隨著人們對水產品需求的增加，在實際生產中較多采用高密度集約化養殖模式，過量的飼料投放導致污水排放量增加，引起水體環境惡化[2]。為了確保水產動物的存活率，養殖戶往往會在飼養過程中濫用漁藥，導致水體和魚體內藥物殘留，污染水體環境，影響食品安全[3-5]。因此，探究用高效和低毒的消毒劑來代替抗生素等漁用藥物具有重要意義。

目前，水產消毒劑按照化學成分可分為以下幾類：含氯消毒劑、含溴消毒劑、含碘消毒劑、酚類消毒劑、堿類消毒劑和過氧化物類消毒劑等[5-6] 。

消毒劑具有滅菌、殺蟲、消毒等作用，因此在水產養殖中被大量使用，但其具有一定的毒性，在使用中應選擇高效、低毒的產品并控制好劑量[7]

戊二醛（glutaraldehyde）是一種新型、高效、低毒的廣譜消毒劑，能迅速殺滅革蘭氏陽性菌和陰性菌，被譽為化學低溫滅菌劑發展史上的第3個里程碑[8]。按照《漁藥使用規范》（SC/T1132—2016）的劑量使用戊二醛，至今尚未見有產生不良反應的報道9。戊二醛對海洋弧菌（Vibrio）[1o]、愛德華氏菌（Edwardsiella）[11]等病原菌引起的魚類疾病也有明顯的防治效果，是水產養殖生產過程中常用的消毒劑之一。聚維酮碘（povidoneiodine）又叫聚乙烯基吡咯烷酮碘，是高效的廣譜殺菌劑，具有刺激性小、作用時間長、無毒性等特點，也是水產養殖生產中常用的消毒劑之—[12-13]。聚維酮碘在水產動物病害防治方面的研究很多，主要有黃河鯉（Cyprinus carpio）[14]錦鯉（Cyprinus carpio）[15]、卡拉白魚（Chalcalbur-nus chalcoides aralensis）[16]、黃鱔（Monopterus al-bus）[17-18]等水產動物的急性毒性試驗，但關于對水產動物腸道微生物影響的研究較少。

草魚（Ctenopharyngodonidella）是我國的“四大家魚”之一，具有肉質鮮美、易飼養、養殖效益高等特點，是我國淡水養殖產量最高的品種之二[19]。2021年草魚養殖產量高達 575 萬t，占淡水魚類養殖總產量的 21.80%^[1] 。常規養殖情況下的草魚腸道菌群組成已被廣泛研究。有研究表明，草魚腸道微生物組成受生存環境和發育階段的影響[20]，如遺傳、性別、免疫力、水、生存環境和飲食等[21]。腸道微生物在魚類的生命周期中扮演著多種角色，參與魚類多種生理功能，包括上皮更新、營養和免疫系統的發展等[22]，在疾病預防中發揮著重要作用。因此，研究重要經濟魚類腸道微生物的區系組成具有重要的意義。

本試驗以體質量為 （64.00±0.34）g 的健康草魚為試驗對象，將其暴露在一定質量濃度的戊二醛和聚維酮碘水體中，飼養1個月后，采用微生物組學技術分析探究戊二醛和聚維酮碘對草魚后腸腸道菌群的結構組成、多樣性以及動態平衡調控的影響，以期進一步豐富消毒劑對草魚影響的相關理論，為草魚養殖生產中消毒劑的安全使用提供參考。

1 材料和方法

1. 1 試驗材料

試驗用草魚由廣東省中山市養殖基地提供運回后先暫養1周，選擇規格一致、健康無病的個體進行后續暴露試驗。試驗魚體質量為（ 64.00± 0.34）g 。

戊二醛（質量分數 50% ，CAS 號：25655-41-8）和聚維酮碘（CAS號：111-30-8）標準品購于阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗設計和飼喂管理

試驗魚分為3組，分別暴露在清水（對照組）戊二醛（質量濃度為 0.08mg/L ）和聚維酮碘（質量濃度為 0.05mg/L ）溶液中，每組設3個重復，每個重復30尾魚。戊二醛和聚維酮碘濃度根據《無公害食品 漁用藥物使用準則》（NY5071—2002）進行設定。試驗期間保持水溫在 28^°C 左右，水體溶解氧在 5mg/L 以上，自然光照。每天定時投飼2次（9：00、18：00），并在每天18：00換水時投入對應的消毒劑。試驗周期為 30d 。

1.3 免疫基因mRNA的表達分析

采用賽默飛世爾科技公司的TRIzolTM（TaKaRa）試劑提取草魚后腸的RNA。總RNA的提取按照RNAisoPlus試劑說明書進行，提取草魚后腸的總RNA后，用超微量分光光度計（Nano-Drop2000，USA）和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度及純度。其中，部分草魚免疫相關基因的特異性引物參考相關文獻[23-24]，選取actin作為內參基因（見表1）。本試驗選擇的基因有：腫瘤壞死因子 ∝ （tumor necrosis factor- α_?ααα_?αα_?αα_?αα_?αα_?αα_?αα_?αα_?αα_?αα_?αα_?αα_?α ，TNF-α）、白細胞介素 1β （interleukin- 、白細胞介素12（interleukin-12，IL-12）[25]、Toll 樣受體 4（recombi-nanttoll likereceptor4，TLR4）、核轉錄因子 κB P65（ nuclear transcription factor-kappa B-P65，NF_-KB-P65 ）[26]、表面免疫球蛋白M（surface im-munoglobulin M，sIgM ）、連接黏附分子（junctionaladhesion molecule 3，JAM3 ）、閉合小環蛋白[2種ZO 蛋白（zonula occludens， _{ZO-1，ZO-2）}. 、閉合蛋白（occludin）跨膜蛋白1（claudin-1）。以cDNA為模板，進行實時定量PCR（real-timequantitativePCR，qRT-PCR）。qRT-PCR體系（ 20μL ）：SYBR酶 10μL ，上下游引物各 0.4μL ，cDNA 模板 4μL ，水 5.2μL 。qRT-PCR反應程序： 95^°C 預變性30s;95^°C 變性 10s，60^°C 退火 30s ，共40個循環。利用 法計算基因的相對表達量。

1.4 草魚后腸氧化相關酶分析

分別從每組試驗魚中隨機選取6尾魚，取其后腸制成 10% 組織勻漿。根據南京建成生物工程研究所有限公司的谷胱甘肽過氧化物酶（gluta-thione peroxidase， GPx ）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒說明書測量數據。使用上海碧云天生物技術股份有限公司的bradford蛋白檢測試劑盒（bradfordproteinassaykit）測定最終濃度并歸一化為相應樣品的蛋白濃度。

1.5 腸道菌群高通量測序

參考相關文獻[27]，分別從每個試驗組隨機選取6尾魚，取后腸做后續基因組DNA提取、16SrRNA高通量測序以及后續的生物信息學分析。對樣本進行DNA提取，提取的DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測和分光光度法（測算在波長260nm 和 280nm 下的吸光度比值）進行質量檢測以基因組 DNA 為模板，使用HiFi hotstart readymix高保真酶進行PCR擴增細菌16SRNA基因的 V3～V4 可變區。PCR反應條件為： 98^9C 預變性 變性 30s，50°C 退火 30s，72°C 延伸 30s ，共27個循環； 72^°C 后保溫 5min 。測序及后續數據分析處理過程委托上海歐易生物科技有限公司進行。

1.6 測序數據優化處理及數據分析

使用Trimmomatic軟件對原始雙端序列進行去雜，去雜后的雙端序列利用FLASH軟件進行拼接，并使用UCHIME2.4.2軟件去除干凈序列中的嵌合體，最終得到用于可操作分類單元（opera-tionaltaxonomicunit，OTU）劃分的優質序列。測序數據預處理生成優質序列之后，采用VSEARCH軟件，按照 97% 的相似度進行OTU分類，對比Silva123數據庫比對注釋，得到每個OTU對應的物種信息，物種比對注釋使用RDPclassifier軟件，保留置信區間大于0.7的注釋結果。對測得的有效數據進行分類單元聚類、OTU豐度和 α/β 多樣性分析。生物信息學分析利用α 多樣性指數對腸道微生物的 α 多樣性進行分析。群落 β 多樣性分析采用binary-jaccard、unweighted-unifrac 和 weighted-unifrac 算 法，用QIME軟件進行主坐標分析（principalcoordinateanalysis，PCoA）。

1. 7 數據統計和處理

試驗結果以平均值 ± 標準差表示。采用SPSS26.0軟件進行統計分析，試驗組分別與對照組進行獨立樣本 χ_t 檢驗，設 Plt;0.05 為差異顯著， Plt; 0.01為差異極顯著。使用GraphPadPrism9.5.1軟件繪圖。

2 結果

2.1戊二醛和聚維酮碘對草魚腸道抗氧化酶活性的影響

2種消毒劑暴露對草魚腸道抗氧化酶活性的影響如圖1所示。相較于對照組，戊二醛組和聚維酮碘組抗氧化酶SOD和CAT的活性均無顯著性差異（ Pgt;0.05） ，但 GPx 的活性均極顯著下降（Plt;0.01） 。此外，戊二醛組MDA含量極顯著增加 （Plt;0.01 ）°

2.2 戊二醛和聚維酮碘對草魚后腸免疫相關因子的影響

2種消毒劑暴露對草魚腸道免疫相關因子表達水平的影響見圖2。與對照組相比，戊二醛組注：標有*表示試驗組與對照組差異顯著（ Plt;0.05 ），標有**表示試驗組與對照組差異極顯著（ Plt;0.01 。和聚維酮碘組的免疫因子基因""和sIgM的表達量極顯著降低（ Plt;0.01 ），2個試驗組的緊密連接蛋白基因ZO-1、ZO-2、occludin、claudin-1和JAM3的表達量也極顯著降低（ ?lt;0.01） 。

2.3草魚腸道微生物群落 ∝ 多樣性分析

如圖3-a所示，3組樣本共產生3051個OTU，其中3組樣本共有的OTU數為959個。稀釋曲線（見圖3-b）結果顯示，3組樣品在 97% 的相似性水平下趨于平坦，并達到飽和，說明測序深度足夠覆蓋樣品細菌群落的多樣性。基于Kruskal-wallis算法， ∝ 多樣性指數（香農-維納多樣性指數和辛普森指數）結果顯示（見圖3-c、圖3-d），戊二醛組與對照組之間差異不顯著（ Pgt; 0.05），但聚維酮碘組與對照組之間有顯著性差異 Plt;0.05） 。

2.4戊二醛和聚維酮碘對草魚腸道微生物群落相對豐度的影響

使用2種消毒劑后，草魚后腸菌群在門水平上的變化見圖4-a。3組草魚后腸細菌群落結構在門分類水平上具有較高的多樣性，相對豐度前15的物種主要包括梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）等。在對照組中，擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和梭桿菌門屬于優勢菌門，而在戊二醛組和聚維酮碘組中，梭桿菌門的比例明顯升高。

草魚后腸菌群在屬水平的相對豐度見圖4-b。相對豐度前15的物種主要包含鯨桿菌屬（Cetobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、弧菌屬（Vibrio）、另枝菌屬（Alistipes）、短螺旋體屬（Brevinema）等。與對照組相比，戊二醛組和聚維酮碘組中鯨桿菌屬和氣單胞菌屬的豐度顯著升高，而擬桿菌屬、弧菌屬和另枝菌屬豐度顯著降低。

挑選屬水平主要菌群進一步分析發現，戊二醛組和聚維酮碘組中有益菌鯨桿菌屬的相對豐度顯著上升（ Plt;0.05） ，而有益菌擬桿菌屬呈下降趨勢，有害菌氣單胞菌屬顯著上升（ Plt;0.05） ，希瓦氏菌屬在戊二醛組顯著上升（ Plt;0.05） ，聚維酮碘組則無顯著變化（ ，弧菌屬和短螺旋體屬呈下降趨勢（見圖5）。

2.5戊二醛和聚維酮碘對草魚腸道微生物群落β 多樣性的影響

基于binary-jaccard、unweighted-unifrac、weigh-ted-unifrac3種算法，通過PCoA對3組不同處理的菌群進行 β 多樣性分析，分析戊二醛和聚維酮碘暴露對草魚腸道菌群的影響，結果見圖6。對比不同算法，聚維酮碘組與對照組無交叉，具有顯著性差異；而對照組與戊二醛組的細菌群落有一部分重疊，差異不顯著。

3 討論

3.1戊二醛和聚維酮碘對草魚腸道抗氧化指標的影響

氧化還原反應是動物體內最為廣泛、最為重要的化學反應，細胞自身的有氧代謝過程及外源性氧化物質均能引起氧自由基的產生，氧自由基蓄積過量后會導致不同程度的氧化應激，從而導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物[28]。為了清除氧自由基，機體會自主釋放抗氧化酶中和氧自由基以降低機體氧化損傷。SOD、CAT和 GPx 等抗氧化酶是機體內主要的抗氧化劑，又是水產動物非特異性免疫的重要免疫相關因子[29]。組織中過量的氧自由基會引起脂質發生過氧化，而脂質過氧化物的最終產物是MDA，MDA含量越高，組織氧化損傷程度也就越高[30]。伍廣濤等[31]研究了高錳酸鉀對錦鯉肝臟組織的影響，結果表明，高錳酸鉀會造成錦鯉肝臟損傷，且損傷程度會隨著質量濃度和時間而增加，使其肝臟SOD、CAT和 GPx 的活性顯著下降。馬成光[32的研究表明，高質量濃度二氧化氯和三氯異氰尿酸對羅非魚（Oreochromisniloticus）的免疫相關指標有一定的激活作用，在低質量濃度條件下則呈抑制作用，隨著二氧化氯和三氯異氰尿酸使用時間的延長，SOD和CAT的活性顯著降低。本試驗結果也表明，戊二醛和聚維酮碘這2種消毒劑對 GPx 的活性具有抑制作用。

3.2戊二醛和聚維酮碘對草魚腸道非特異性免疫指標的影響

炎癥是指具有血管系統的活體組織對生物、物理、化學等損傷因子刺激所產生的防御反應，其形成和發展與免疫系統密不可分[33]。炎癥起著維持機體穩態的保護性效應，但反應過度也會損傷正常組織器官。腸道是一個消化和吸收營養物質的功能器官，在防止感染方面具有非常重要的作用，其炎癥因子和黏膜免疫因子在免疫應答中起著關鍵作用[34]。本研究結果顯示，當草魚長期暴露在2種消毒劑中，會導致腸道的促炎相關因子 和TLR4的表達量顯著下降，這表明戊二醛和聚維酮碘可能具有抗炎的作用。腸道作為一個機體與外界相通的器官，不僅是體內重要的營養物質消化、吸收、免疫和內分泌器官，還可以阻正腸腔內的毒素、細菌、抗營養因子等有害物質進入體內對機體造成損傷，具有重要的屏障功能[35]。緊密連接為多種蛋白相互作用下形成的復合結構，位于上皮頂端兩細胞間，是腸黏膜上皮細胞之間的主要連接方式，對維持細胞屏障的完整性有重要意義[36]。其中Occludin 家族、Claudin家族以及Z0家族是構成緊密連接的重要蛋白分子[37]。有研究表明，低質量濃度的聚維酮碘能提高黃羽肉雞和豬的生長速度，改善其腸道絨毛形態，提高腸道的免疫能力[38-39]。也有研究發現，使用戊二醛能緩解小鼠肝損傷、提升小鼠的體液和細胞免疫能力[4041]。本研究結果顯示，戊二醛和聚維酮碘使草魚后腸免疫相關因子 二、IL-12、TLR4、sIgM、ZO-1、ZO-2、occludin、claudin-1和JAM3的表達量顯著下降，說明遵循《無公害食品漁用藥物使用準則》（NY5071—2002）使用戊二醛和聚維酮碘可以降低草魚腸道炎癥發生的可能，同時也影響了腸道黏膜免疫系統。

3.3戊二醛和聚維酮碘對草魚腸道微生物群落的影響

已有研究表明，不同消毒劑對動物腸道菌群的多樣性有不同的影響[42-43]。黃建飛等[39]發現，聚維酮碘能使黃羽肉雞的胃、回腸、盲腸處的有益菌數量增加，同時還能殺滅大腸桿菌等有害菌。Mahgoub等44」研究表明，羅非魚暴露于高錳酸鉀會導致其腸道有害菌數量減少。本試驗結果顯示，長期使用戊二醛和聚維酮碘均會對草魚腸道內部分有益菌和有害菌的豐度造成影響，導致其上升和下降，有部分菌群則沒有顯著變化，這表明使用戊二醛和聚維酮碘可能會抑制敏感微生物和促進機會性細菌的增殖，從而改變草魚腸道菌群的豐富度。通過進一步的多樣性分析發現，暴露在聚維酮碘中的草魚，其腸道菌群的 ∝ 多樣性顯著低于對照組（ Plt;0.05） ，而戊二醛組與對照組相比無顯著性差異（ ）； β 多樣性分析也顯示，聚維酮碘組腸道菌群與對照組無交叉區域，表明聚維酮碘組和對照組腸道菌群之間共有的OTU較少，2組之間相似度較低，而戊二醛組與對照組之間無明顯差異。有研究表明，聚維酮碘暴露降低了錦鯉鰓組織中細菌的比例，但沒有改變其物種豐富度，同時聚維酮碘也導致錦鯉皮膚細菌菌群的多樣性發生變化[45]。這與本研究在腸道菌群上的結果一致，戊二醛和聚維酮碘暴露沒有改變草魚腸道菌群的物種豐度，但是使用不同的消毒劑，草魚腸道菌群的多樣性具有明顯差異。

4 結論

本研究結果表明，草魚長期暴露在戊二醛和聚維酮碘下會導致其腸道 GPx 活性降低，影響腸道黏膜系統，降低機體的非特異性免疫能力。戊二醛對草魚腸道菌群的多樣性沒有顯著影響，而暴露在聚維酮碘中的草魚，其腸道菌群的多樣性發生了明顯變化。因此，在草魚養殖生產中，使用不同消毒劑對草魚免疫和腸道菌群的影響存在一定差異，相對而言，戊二醛對草魚腸道菌群的影響較小。本研究結果可為草魚病害防控和健康養殖提供參考。

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Effects of glutaraldehyde and povidone iodine on the immunity and microflora in the hindgut of grass carp （ Ctenopharyngodon idella）

HUANG Yao1，2， ，CHEN Zhilong1，CHEN Si'en’，MA Lixin ¹ QIN Zhendong'，LIN Li ¹ ，SHI Fei'

（1. Guangdong Provincial Water Environment and Aquatic Products Security Engineering Technology Research Center， Guangzhou Key Laboratory of Aquatic Animal Diseases and Waterfoul Breeding ， College of Animal Sciences and Technology， Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China; 2. The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences，Wuhan430072，China ）

Abstract： To investigate the efects of glutaraldehydeand povidone iodineon the immunityand microflora of hind gut in grass carp（Ctenopharyngodon idella），healthy C .idellawithaveragebodyweight （ 64.00±0.34g ）were selected and exposed to clear water （control），glutaraldehyde（0.O8 mg/L）and povidone iodine （O.O5 mg/L）， respectively.After one month offeeding，theefects of glutaraldehydeand povidone iodineon theantioxidant enzyme activities， non-specific immunity and intestinal flora diversity in the hindgut of grass carp were analyzed by enzyme activity，real-time quantitative PCR and high-throughput sequencing.The results showed that glutaraldehyde and povidone iodine significantly reduced the activity of GP X （ Plt;0.01 ）. The content of MDA significantly increased in the glutaraldehyde group（ Plt;0. 01 ），while mRNA expression levels of immune-related factors （ μ 1β ，IL-12，TLR4，sIgM，ZO-1，ZO-2，occludin， JAM3 ，and claudin-1）were significantly lower than the control （ P lt;0. 05）. The results of microbiome high-throughput sequencing analysis showed that glutaraldehyde did not significantly change the diversity of the hindgut flora of grass carp （ Pgt;0.05 ），however，povidone iodine had a significant effect on the diversity of the hindgut flora of grass carp（ Plt;0， 05 ）. Both of these disinfectants affected the proportion of gut dominant flora groups abundance.In conclusion，glutaraldehyde and povidone iodine could reduce the activityof intestinal GPx enzymes，inhibit the intestinal mucosal immune system，reduce immunity，and change intestinal flora structure of C . idella，and povidone iodine had a significant effect on the diversity of intestinal microflora.

Key words：glutaraldehyde；povidone iodine；Ctenopharyngodon idell； immunity； intestinal microflora