蒺藜莖葉中呋甾型蒺藜皂苷提取方法研究

蒺藜隸屬于蒺藜科植物，根據(jù)2015年版《中國藥典》的記載，蒺藜科植物干燥、成熟的果實被認(rèn)定為藥用蒺藜的法定來源。目前，人們已從蒺藜中提取出多種化學(xué)成分，包括黃酮、生物堿、有機酸、多糖及甾體皂昔等。隨著蒺藜應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，對其研究的日益深入，蒺藜皂昔作為關(guān)鍵的化學(xué)活性成分，其作用備受關(guān)注。研究顯示，蒺藜皂昔能夠促進(jìn)人體中性激素水平的提升，特別是對雄激素的增加具有顯著效果。由于含有蒺藜皂苷的藥品已在臨床實踐中證明了其安全性和有效性，該成分具有成為高品質(zhì)運動營養(yǎng)產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用的潛力，故對蒺藜皂苷提取與測試技術(shù)的研究其有重要的現(xiàn)實意義。

1提取方法

1.1傳統(tǒng)溶劑提取法

溶劑提取法是依據(jù)不同物質(zhì)間的親和作用進(jìn)行提取。通過選擇合適的溶劑，將原材料中指定的化學(xué)成分提取出來，例如皂苷類物質(zhì)。此類物質(zhì)在水、甲醇和稀乙醇溶液中容易溶解，在加熱后的水、甲醇或乙醇環(huán)境下溶解性會更加明顯，對于乙醚、氯仿和苯這些溶劑幾乎不溶。在分離蒺藜之中的總皂苷物質(zhì)時，水和乙醇兩種液體通常會被用作溶媒。皂昔分離方式有很多種，包括浸漬、熬煮和循環(huán)溶出等方法，而較頻繁采用的是水提取后乙醇沉淀的流程，此流程以水為溶解媒介，沖煉沸騰得到提取液，繼而濾凈并濃縮以獲得所需提取物。向提取液注入各種質(zhì)量分?jǐn)?shù)等級的乙醇，一般這些質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于 40%～80% ，有效除去如淀粉、多糖、膠質(zhì)、氨基酸、植酸和蛋白等不純物質(zhì)，同時過濾留下的溶液中依然含有皂昔成分。此外，采用醇提上柱法，使用 70% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行萃取，連續(xù)3次，每次持續(xù)2h，經(jīng)過大孔徑樹脂吸附處理后通過濃縮和干燥步驟制得最終產(chǎn)品。實驗數(shù)據(jù)顯示，從蒺藜中提煉出的干狀濃縮物含有 43.23% 的皂苷，提取成功率為 80.31%^[1] 。運用乙醇法將蒺藜皂苷濃縮并借助正交實驗確定最佳提取工藝，采用 75% 的乙醇溶液進(jìn)行3輪連續(xù)回流，每輪維持1h可實現(xiàn)效果最佳，其提取成果的總皂苷含量為 52.19% 。兩項技術(shù)在提取上都顯示出了相對高效的能力，但通常會帶來較多的雜質(zhì)，適宜于工業(yè)化的批量生產(chǎn)。傳統(tǒng)的溶劑提取法由于其簡便性和低成本的特點而被廣泛應(yīng)用于蒺藜皂苷的分離純化工作，但此技術(shù)耗時較長并且其安全性還有進(jìn)一步提升的空間。

1.2 微波提取法

微波提取法借助微波能實現(xiàn)物質(zhì)的高效分離。在此過程中微波穿過細(xì)胞壁，對細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行照射。極性溶液以及細(xì)胞內(nèi)液體吸收微波產(chǎn)生熱能，引起內(nèi)外細(xì)胞溫度上升，氣壓增大。當(dāng)氣壓超過細(xì)胞壁的極限，細(xì)胞壁破裂，促使細(xì)胞中成分釋出并溶解于溶劑。通過正交實驗法精細(xì)調(diào)控提取刺梨皂昔的過程，優(yōu)化得出的最佳操作參數(shù)為：樣品粒徑介于 0.18～1.15mm 之間，提取時間為 5min ，微波輻射功率設(shè)定為 5 0 0W ，固體與溶劑的質(zhì)量體積比為 1：20g/mL 。測試結(jié)果顯示，所得皂苷含量達(dá)到 91.3% 。因此，與傳統(tǒng)提取方法相比，微波提取技術(shù)在速度和效能方面具有顯著優(yōu)勢，同時具備均衡加熱、減少溶劑使用、流程簡化和廣泛應(yīng)用等優(yōu)點，但此技術(shù)在理論研究和實際應(yīng)用方面仍存在一些局限性[2]。

1.3 超聲提取法

近年來，超聲提取法在提取天然植物化學(xué)成分方面得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。在分離皂昔的過程中，超聲提取技術(shù)能夠確保昔元結(jié)構(gòu)的完整性，相較于傳統(tǒng)提取技術(shù)，超聲提取在縮短操作時間及提升提取效率方面具有優(yōu)勢。通過超聲提取法測定刺蒺藜全植物中的皂昔總量，使用稀釋后的乙醇作為萃取溶劑，經(jīng) 30min 的超聲波技術(shù)處理后，用大孔徑樹脂進(jìn)行吸附純化。研究表明，第一組樣本中蒺藜皂苷的含量高達(dá) 2.8% ，該方法減少了提取時間，提升了提取效率，同時在超聲波萃取過程中有效保持了活性物質(zhì)的構(gòu)造穩(wěn)定性。經(jīng)過對3類提取技術(shù)進(jìn)行全面的對照和分析，明確各自優(yōu)點與局限性，對于蒺藜中總皂昔的高效提取過程具有重要的參考意義，見表1。

2 測試方法

2.1紫外-可見分光光度法

在眾多用于測試蒺藜總皂昔含量的方法中，紫外-可見分光光度法不僅適用于有色組分的定量分析，還能對含有共軛體系的無色化合物進(jìn)行檢測。利用從蒺藜中提取的純凈皂苷作為參照物，在 520nm 的檢測波長下，應(yīng)用E染色劑和含乙醇的硫酸混合物作顯色反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)樣本在 0.06～0.20mg 的濃度區(qū)間內(nèi)，其吸光度測定值顯示出良好的線性關(guān)系。對不同地區(qū)蒺藜進(jìn)行質(zhì)量測試，使用紫外可見分光光譜儀測試莖葉中總皂苷濃度，將薯蕷皂苷元定為對照標(biāo)準(zhǔn)，在顯色反應(yīng)時使用的是 5% 氯酸與香草醛的混合液（比例為4：1），通過在波長為 594nm 處檢測吸收值。研究顯示，在 7.52～150.40μg 的質(zhì)量區(qū)間內(nèi)，薯皂昔元展現(xiàn)了良好的線性關(guān)系和較高的提取效率。為了精確判斷各個時段收獲的蒺藜果實和莖葉中總皂昔含量的差異，采用紫外-可見分光光度法，在此過程中以菝葜皂昔為參照物，測試光譜波長設(shè)定為 310nm ，使用高氯酸作為顯色劑。研究發(fā)現(xiàn)，與果實相比蒺藜的葉莖部分含有更豐富的總皂苷，特別是在7月份，含量達(dá)到峰值3。與其他光譜測定技術(shù)相比，紫外光譜測光技術(shù)因其操作簡便、設(shè)備簡易、成本經(jīng)濟、測試快速及高靈敏度等顯著優(yōu)勢，常被用于皂昔成分的測試。

2.2高效液相色譜法

高效液相色譜技術(shù)以液態(tài)流動相為載體，在高壓作用下通過輸液泵推送純?nèi)軇┗蚧旌暇彌_液，使樣本中的不同成分移動并實現(xiàn)分離。高靈敏度探測器將分離的成分轉(zhuǎn)換為信號，完成對樣品的定性與定量分析。在選擇測試器時，需考慮實驗室環(huán)境及皂昔的固有特性。針對那些不具備紫外線吸收屬性從而無法借由紫外線檢測儀進(jìn)行鑒定的皂苷（如同薯皂昔），運用蒸發(fā)光散射檢測技術(shù)進(jìn)行測試是一種高效方法。通過高效液相色譜技術(shù)與比色分析法相結(jié)合，對鶴虱草藥成分進(jìn)行質(zhì)量測試。選用WelchUltimateLP—C18規(guī)格的色譜分析柱，流動介質(zhì)則采取甲醇與水按8：2體積比例混合制成的溶劑。采用蒺藜皂昔元作為評估標(biāo)準(zhǔn)，開展對蒺藜總皂苷含量的量化分析研究。研究結(jié)果表明，在高效液相色譜和比色分析中，蒺藜皂苷原在 0.820～ 7.380μg 以及 24.600～86.100μg 的質(zhì)量區(qū)間內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)秀的線性表現(xiàn)，平均測得回收率依次為99.3% 與 99.5% 。由于此方法操作上的便捷性、快速的分析效率、出色的分離性能以及高度的靈敏與準(zhǔn)確性，非常適合于蒺藜含量測試。

2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳技術(shù)以高電壓作為驅(qū)動力，通過微細(xì)管道作為離子或帶電微粒的分離介質(zhì)，基于樣本成分間的流動性和分配特性差異，實現(xiàn)對液體成分的分析。毛細(xì)管電泳法具有高效的分析能力、較低的樣品需求量、簡易的操作程序、成本經(jīng)濟和強對抗污染能力等特點，尤其在提取和定量分析天然植物藥的活性成分方面。但目前運用此技術(shù)測試蒺藜屬植物總皂甙含量的實例研究報道相對較少，今后應(yīng)重點加強在此領(lǐng)域的科學(xué)研討和探索。

2.4 紙芯片測定法

目前，主流的紙芯片技術(shù)是在濾紙上利用疏水性物質(zhì)構(gòu)建路徑，即在紙面上繪制疏水與親水的圖案，形成微觀尺度的毛細(xì)作用通道，使溶液能夠借助毛細(xì)作用自行流向預(yù)定區(qū)域，從而無需額外設(shè)備。在測試領(lǐng)域，主要技術(shù)手段包括分光光度測定、熒光測試技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光測試和電化學(xué)分析法，其中分光光度測定因其直觀性而成為最廣泛采用的技術(shù)[4]。例如，通過紙芯片對鳳丹皮中的鳳皮酚進(jìn)行的含量測試，取得很好的成效。為了應(yīng)對檢驗過程中色變反應(yīng)時間的不一致性，研究人員采用微流控紙芯片對茶多酚含量進(jìn)行快速鑒定，在顯色反應(yīng)開始 3min 內(nèi)迅速分析不同稀釋后的茶湯樣品，并且獲得的測試數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)測試手段相比顯示出高度一致性。眾多文獻(xiàn)表明，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，紙基微流控分析技術(shù)在時間上大幅縮短，還擺脫了對專業(yè)實驗設(shè)備的依賴，適合實時現(xiàn)場測試，因此紙質(zhì)芯片在中草藥的快速分析鑒定中具有潛在的廣泛應(yīng)用價值。

3結(jié)論

通過對三種蒺藜總皂苷提取技術(shù)的分析和對比，研究人員能夠根據(jù)實際需求科學(xué)選擇提取方法。紫外光譜測試技術(shù)與液相色譜測定，由于具有操作便捷性等優(yōu)點在分析蒺藜總皂昔方面獲得了廣泛應(yīng)用。毛細(xì)管電泳與微流控芯片技術(shù)在未來具有巨大的應(yīng)用潛力，尤其是毛細(xì)管電泳技術(shù)在天然藥物研究領(lǐng)域已展現(xiàn)出卓越的分析效果。而紙基微流控芯片因其快速和易用的特性，在眾多研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，提取和測試方法將持續(xù)得到優(yōu)化和升級，為天然藥品和傳統(tǒng)中藥學(xué)的科學(xué)研究提供進(jìn)一步的支持。

參考文獻(xiàn)：

［1］姚甜，安超娜，郝夢超，等.蒺藜皂苷提取工藝及其藥理活性研究進(jìn)展[J].河北師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2024，48（4） ：381-387.

[2］李海亮，李耀磊，張子安，等.HPLC-CAD法與ELSD法用于測定蒺藜皂苷提取物中蒺藜皂苷K的對比研究[J].中國藥事，2023，37（6）：680-686.

[3］曹珍艷，魏冰，李彬.醇提濃縮法提取蒺藜皂苷的實驗研究[J].生物化工，2015，1（1）：26-28.

[4］張劍，譚健聰，楊鈺蓉，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化蒺藜中黃酮和皂苷的提取工藝[J].化工科技，2020，28（6）：6-12.