蘭州百合種內自然雜交 F₁ 群體的遺傳變異

蘭州百合（Liliumdavidiivar.unicolor）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）野生川百合（L.dauidii）的變種，是中國唯一的食用甜百合，其風味獨特，且有保健功效，是甘肅省地理標志產品。由于長期無性繁殖，在自然選擇和人為選擇的共同作用下，蘭州百合遺傳基礎逐漸狹窄，一些稀有基因資源正在面臨丟失[1-2]。

目前，蘭州百合育種尚處于起步階段，僅有的3個品種（‘蘭百1號蘭百2號'和‘中百1號）均是從栽培群體中選擇自然變異單株選育而成。作為野生百合資源之一，蘭州百合由于食用性好、花形優美，且抗旱、耐寒、高抗鐮刀菌[3]，在百合雜交育種中常用作親本創制賞食兼用百合新種質或品種[4-5]。已報道蘭州百合與卷瓣組內的大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowiczii Bak-er）[6]、山丹（Lilium pumilum Redoute）[7]、垂花百合（Lilium cernuum Kom.）[8]、卷丹（LiliumlancifoliumThunb.）9雜交親和，與百合組的岷江百合（Lilium regale Wilson）[1o]、麝香百合（Lilium longiflorum Thunb.）[11-12]和龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）[i3-14]，以及輪葉組的青島百合（LiliumtsingtauenseGilg.）[8和亞洲百合雜種系內的大多數品種[5，15-16]遠緣雜交親和。

已有研究發現，蘭州百合作為親本對雜種后代的花色、品質有影響：蘭州百合與亞洲百合雜交F₁ 群體花色、花朵數量、葉片寬等表型性狀變異廣泛，表現出明顯的雜種優勢和趨中變異[5，15]，而且可溶性糖含量和淀粉含量明顯優于親本亞洲百合[5]；龍牙百合與蘭州百合雜交 F₁ 代幼苗氣孔密度、葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白質含量和淀粉含量與親本存在較大差異，其中可溶性糖含量顯著高于龍牙百合，表現出顯著的雜交優勢[14]。

蘭州百合自交不親和，群體內異株異花授粉可結實[8，17-19]。據筆者統計，蘭州百合自然雜交坐果率僅為 7.15% ，單個蒴果平均自然結種數為211.6粒，其中有胚種子平均為95.3粒，占45.03% 。作為食藥同源植物，從維系其道地性和遺傳資源的純正性出發，開展種內雜交可以在保持其道地性的基礎上豐富遺傳基礎、進行種質復壯和創新，為種質資源的恢復和保護提供技術保障，亦可為其他百合野生資源的保護提供理論依據和方法借鑒。蘭州百合種內雜交后代的遺傳分化方面鮮有報道。

ISSR標記無需事先了解生物體的基因組序列，是一種可以在不同物種間通用、穩定、多態性高的顯性標記，在基因組巨大且還未完成全基因組測序的百合多樣性研究中應用廣泛[20-23]。為了深入了解蘭州百合種內雜交 F₁ 群體的遺傳分化特點，本研究開展DNA水平的遺傳多樣性分析，以期評估利用種內雜交育種技術進行蘭州百合新品種選育和種質創新的有效性，同時為蘭州百合種內雜交子代性狀預測及育種策略提供理論依據。

1材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗田位于蘭州市西固區金溝鄉馬家山村（東經 103^°40^′ ，北緯 36^°01^′ ，海拔 2 179m ；2021年蘭州百合種植田中進行自然雜交坐果率統計，并采集自然雜交蒴果，以蒴果為單位統計雜交群體。

1.2 F₁ 代實生苗無菌培養

收集膨大蒴果，挑選有胚種子進行消毒處理：流水沖洗 30min，70%（V/V） 乙醇浸泡 45s，2% （V/V）NaClO 溶液浸泡 （期間不斷晃動），無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干水分，接種到1/2MS培養基上進行暗培養 （23^°C～25^°C ），待胚萌發時轉移至光照培養（光照強度： 100μmol?m^-2 （20·s^-1 ，培養溫度為 25^°C±1^°C ，光周期為 ^16h 光/ ^′₈h 暗）。

1.3 引物合成及基因組DNA提取

ISSR引物合成：利用加拿大哥倫比亞大學（UniversityofBritishColumbia，UBC）設計的引物[24]，選取實驗室前期篩選的在蘭州百合中有穩定擴增產物的20條ISSR引物[25]，由上海生工合成。以C6群體中12個單株基因組DNA為模版共篩選出9條在 F₁ 群體中有多態性的ISSR引物（表1）。

基因組DNA的提取與檢測：采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，Cat.No.DP305）提取葉片總DNA，使用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計分別檢測其質量和濃度，并稀釋至 ，備用。

1.4ISSR體系優化及擴增反應

取6個在同一試驗田采集的自然雜交蒴果，以蒴果為單位分別進行種子無菌培養，同一蒴果內種子無菌培養獲得的 F₁ 代實生苗為同一自然雜交群體，編號分別為 C1～C6 ；以C6母本的鱗片為外植體進行組織培養，獲得的再生苗群體作為對照，編號為C7。 C1～C7 群體分別隨機取12個單株提取基因組DNA，并作為模板，以合成的ISSR引物進行PCR擴增。PCR反應體系：總體積 20μL ，含 50ng DNA，2.0 mmol·L^-1 MgCl₂ ，0.4 mmol· ，1 U TakaraTaq^TM，0.5μmol?L^-1 ISSR primer。梯度 PCR擴增程序為 95°C 預變性 變性 45s 退火 45s，72^°C 延伸 1min，35 個循環。

PCR產物在 2.0% 的瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview染色，凝膠成像系統觀察照相。

1.5 數據分析

凝膠上的帶型，以列為株系，行為擴增片段，每個條帶代表一個基因位點，統計清晰可辨、可重復的條帶。在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為O，建立ISSR數據矩陣。

按NTsys2.10e軟件格式要求輸入賦值，采用NTsys 2.10e 軟件中進行遺傳一致度和遺傳距離計算，并用UPGMA程序構建聚類圖。利用PopGene32軟件分析不同蘭州百合種內自然雜交 F₁ 群體多態性位點百分率、觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei's指數（H）和Shannon's指數（I）分析。

2 結果與分析

2.1 F₁ 群體內部的遺傳變異

9條引物在72份樣品中擴增的條帶大小介于 200～1200bp ，電泳圖中各列之間擴增條帶遷移位置分布的不同代表不同的電泳譜帶類型，同一群體中12個單株電泳譜帶類型的數量反映了該群體遺傳多樣性程度。

6個實生苗群體中C5群體平均譜帶類型數量最多，為7.8，C2群體最少，為6.0，6個群體平均為6.75，顯著大于組織培養群體C7的平均值1.7（表2，圖1），說明種內雜交 F₁ 代群體內部在DNA水平上具有較高的遺傳多樣性，即蘭州百合自然雜交 F₁ 代群體內個體間在DNA水平上存在較高的遺傳分離。

利用POPGENE32軟件從多態位點百分率、觀測等位基因數、有效等位基因數、Nei’s多樣性指數和Shannon's指數5個指標綜合分析各種內雜交 F₁ 群體內部遺傳多樣性：C5群體內部多態位點百分率最高，為 84.91% ，C2和C4群體最低，為 69.81% ，平均 75.79% ，是組培苗群體C7（30.19%） 的2.5倍。群體內有效等位基因數、Nei's指數和Shannon's指數同樣以C5群體最高，C2最低，均高于C7（表3）。以上從等位基因數、基因多樣性和豐富度方面說明各種內雜交F₁ 群體內部具有較高的遺傳多樣性，與譜帶類型數量分析結果相一致。

表2各群體擴增的電泳譜帶類型數量

2.2 F₁ 群體之間的遺傳多樣性

從表4可以看出，6個 F₁ 群體之間遺傳一致度為 0.8051～0.9336 ，其中C1與C2、C3與C4、C4與C5之間的遺傳一致度均高于0.9000，C4與C6之間的遺傳一致度最低，亦高達0.8051，說明不同 F₁ 群體之間遺傳相似性高，多樣性低。

2.3不同 F₁ 群體的聚類分析

利用NTSYS2.1O軟件，計算群體的遺傳相似系數，根據遺傳相似系數值按以不加權成對群算術平均法（UPGMA）構建6個 F₁ 群體的72個單株的親緣關系聚類圖（圖2）。當遺傳相似系數為0.672時，6個 F₁ 群體的72個單株被分為6個類群：C6群體的63（類群I）和61（類群ⅡI）、C3群體的28和29（類群Ⅱ）、C5群體的56（類群V、C6群體的64和66（類群V）、剩余均屬于類群V。類群VI包含C1、C2和C4群體的全部單株，以及C3、C5和C6群體 83.3%.91.7% 和66.7% 的單株。表明不同雜交組合的 F₁ 群體的大多數單株間遺傳相似性高，具有很近的親緣關系，個別單株產生了遺傳重組，具有明顯的遺傳分化。聚類圖中，C1、C2和C4群體的全部單株都在同一類群，C3和C5群體被分為2個類群，C6被分為4個類群，說明C6群體內比其他群體有更高的遺傳分化。

對6個 F₁ 群體的72株實生苗進行主成分分析（圖3），主成分1、2的貢獻率分別為 10.41% 和7.20% 。從6個組的單株在主成分坐標圖的分布位置來看，C1和C2群體大部分單株主要分布在散點圖的第2象限，C3主要分布在第4象限，C4和C5的主要分布在第3象限，C6主要分布在第1象限。從圖中可以看出，C1與C2、C4與C5、C2與C4和C5、C3與C4和C5分布區域有重疊，表明這幾個 F₁ 群體的后代之間遺傳相似性高，C6與其他組重疊最少，表明其與其他組的親緣關系相對較遠，與聚類分析的結果基本一致。

3討論

本研究發現，蘭州百合種內雜交 F₁ 代群體內具有較高的遺傳多樣性（相對多態位點百分率平均為 75.79% ，Shannon’s指數為 0. 3978～ 0.5118），而 F₁ 群體間遺傳多樣性低（遺傳一致度為 0.8051～0.9336） ，與李謀強等26報道的蘭州百合栽培群體遺傳變異主要存在于栽培居群內，各栽培居群間的變異小的結論一致，多樣性略低于喇叭百合自交群體（相對多態性位點百分率為 88.46% ，Shannon's指數為 0.62±0.08^[19]） 這與蘭州百合的繁殖方式和繁育系統相關。蘭州百合繁育系統屬于專性異交、部分自交親和、需要傳粉者[18，27]。雖然花粉和柱頭都具有活力，但自交不親和，異交親和性很低[18，27]，自然坐果率僅為 7.15% （筆者統計）。長期無性繁殖，加之在生長期實行“掐花\"管理，一方面導致栽培居群內個體基因型高度雜合，個體間無基因交流現象，另一方面導致栽培居群遺傳組成由若干個無性系組成，群體中存在基因型完全一致的個體，因而產生種內雜交 F_i 代群體內遺傳多樣性高、而群體間遺傳多樣性低的特點。

李斐斐分別對2個不同居群的山丹與蘭州百合雜交后代進行聚類分析時，當遺傳相似系數分別為0.53和0.614時雜交后代對應可分為4大類群和7大類群，本研究中蘭州百合種內雜交后代當遺傳相似系數為0.614時可分為2大類群，0.672時可分為6大類群，說明蘭州百合與山丹組內雜交后代群體的遺傳多樣性大于蘭州百合種內自然雜交后代群體，這是由于蘭州百合與山丹組間遺傳距離大于蘭州百合種內產生的。

蘭州百合是食藥同源植物，種內雜交不僅可以保持其道地性，而且可以拓寬遺傳基礎，有利于群體的提純復壯，在道地藥材種質資源保護和恢復方面具有重要意義。種質資源多樣性研究是育種工作的基礎，目前蘭州百合育種工作因遺傳基礎狹窄已進入瓶頸，從長遠角度來講，如果不改變這種局面，種質資源中一些稀有基因資源將面臨丟失[1-2]。種內雜交，一方面可以通過挑選優良單株進行系統育種，培育高產、優質蘭州百合新品種；另一方面可以培育純合自交系，用于雜種優勢利用和遺傳規律研究。本研究結果表明，在蘭州百合育種中，在 F₁"群體中進行優良單株選擇是有效的，但由于不同 F₁"群體間遺傳相似性高，該群體在拓寬蘭州百合遺傳基礎、進行遺傳改良和新品種選育方面的作用是有限的，在后續通過種內雜交進行純系和新品系培育中，為了節約資源，雜交群體和單株選擇數量都不宜過多。

Fig. 2 UPGMAclusteringgraphof72seedlingsderived from populationsofL.davidiivar.unicol

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Genetic Variation in F₁ Hybrid Population of Lilium davidii var.unicolor

LI Shujie，CHEN Chen，GAO Hongjuan，ZHANG Minmin， WANG Liguang，HOU Yiqing and PEI Huaidi （Institute of Biotechnology，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 73oo7o，China）

AbstractThis study used the F₁ progeny seedlings from the intraspecific natural hybridization of L dauidii var. unicolor as the experimental material to reveal the genetic variation characteristics through genetic diversity at the DNA level. ISSR analysis showed that the number of electrophoresis profile types in the 6F₁ populations ranged from 6.O to 7.8，with the percentage of polymorphic loci and Shannon's index ranging from 69.81% to 84.91% and from 0.397 8 to 0.511 8，respectively. The genetic consistency among populations ranged from 0.805 1 to 0.933 6，indicating high internal genetic diversity within the populations and high consistency among them；cluster analysis showed that allindividuals from 3F₁ populations and 66.7%-91.7% of the individuals from the other 3F₁ populations clustered into the same group，indicating close genetic relationships and high genetic similarity among the F₁ populations; the PCA scatter plot further confirmed the results of the cluster analysis.

Key words L.davidii var.unicolor；Natural hybridization; F₁ progeny seedlings;Genetic diversity

Received2024-05-30 Returned 2024-07-25

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China （No.3196o599）；Research and Development Program of Gansu Province （No.23YFNAOo23）； Project of China Modern Agriculture Industry Technology System（No. CARS-21）； Science and Technology Innovation Project of Gansu Academy of Agricultural Sciences （No. 2022GAAS02）.

First authorLI Shujie，female，Ph.D，associate research felow.Research area：lily genetics and breeding. E-mail： sjli2005@gsagr. ac.cn

Corresponding authorPEI Huaidi，female，master，associate research fellow.Research area： seedling rapid propagation and culture.E-mail： phdfeixiang@163.com

（責任編輯：潘學燕 Responsible editor：PAN Xueyan）