塔賓曲霉的鑒定及基因編輯方法對(duì)其同源重組效率的影響

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0864（2025）06-0083-10

Identification of Aspergillus tubingensis and the Effect ofGene Editing Methods on Its Homologous Recombination Efficiency

LIANG Licun1，YU Huimin1，GUAN Xiaochen2，HUANG Huoqing1，YAO Bin1，YANG Haomengl* （1.InstituteofAnimalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSienes，BeijingO193，China；2.GannanCountyQualityn Technical Supervision Inspection and Testing Center，Heilongjiang Qiqihar 162199，China）

Abstract：Aspergilustubingensisisafilamentousfungus withbroadapplicationprospectsinfeed，food，biological control，environmentalrestorationand soon.Combining morphologicalobservation withmoleculardetection，Ehrlich reagentstaining，a strain of Aspergillus tubingensis was succefullyidentifiedand was named asF316.Inorder to explore asuitable gene editing method for F316 and facilitate genetic enginering modification，CRISPR/Cas9 was applied to insert hygromycin resistance genes into the spore pigment synthesis related gene funA.Through spore color statisticsandresistance genePCRverification，theeffctsof different delivery methodsof Cas9andgRNAon homologous recombination eficiency were compared.Theresults showed that，for F316 strain，the homologous recombination eficiencyof expression cassettemethod，self-replicating plasmid method and ribonucleoprotein complex（RNP）method were 70.14% ，66.67%and 25.70% ，respectively.Inaddition，the length of homologous arms in donor DNA also affcted the homologous recombination eficiency.Whenthe length of homologous arms was 2000bp ，the recombination efficiency was the best.

Key Words：Aspergillus tubingensis；strain identification；gene editing；homologous recombination

塔賓曲霉（Aspergillustubingensis）是子囊菌綱、曲霉屬真菌，在食品發(fā)酵、生物防治、環(huán)境污染治理等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。該真菌由科學(xué)家在德國(guó)塔賓發(fā)現(xiàn)，因而命名為塔賓曲霉菌。

塔賓曲霉生物活性多樣，既能作為“細(xì)胞工廠\"生產(chǎn)各種酶蛋白[2-4，也能產(chǎn)生許多生物活性化合物，如吲哚二萜、環(huán)五肽、萘并吡喃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物5。這些化合物具有一定的抗病毒、抑菌、抑制雜草生長(zhǎng)等功能。研究表明，塔賓曲霉對(duì)重金屬 Pb²⁺ 的最大吸收能力約為828.8mg?L^-1[8] ，是生物防治的理想菌種;塔賓曲霉新種能顯著降解聚氨酯，在垃圾處理、環(huán)境修復(fù)、現(xiàn)代種植業(yè)中也有廣闊的應(yīng)用前景。

塔賓曲霉在分類學(xué)上屬于曲霉屬（Aspergillus）中的黑色曲霉，常被誤認(rèn)為是黑曲霉（Aspergillusniger），二者都能產(chǎn)生黑色孢子，分類地位較近，比較容易混淆0，因此，對(duì)塔賓曲霉的鑒定必需采用多種方法。目前，真菌鑒定的方法包括形態(tài)學(xué)鑒定、分子鑒定、質(zhì)譜鑒定等]。其中，分子鑒定法快速高效，如核糖體rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribedspacer，ITS）序列分析技術(shù)，被公認(rèn)為菌種鑒定的“二維碼”；鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）、β-微管蛋白（ β -tubulin，BenA）、RNA聚合酶Ⅱ第二大亞基（RNApolymeraseIIsecondlargestsubunit，RPB2）等基因也可作為序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析的依據(jù)，用于曲霉菌的二級(jí)鑒定[2；另外，通過(guò)Ehrlich試劑染色法也能有效區(qū)分黑曲霉與塔賓曲霉[10]

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯方法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種絲狀真菌的基因改造[13]，并成功實(shí)現(xiàn)基因的敲除、插人、單堿基編輯、表達(dá)調(diào)控等操作，為工業(yè)用絲狀真菌的菌種迭代進(jìn)化與遺傳改造提供了有力的工具。在絲狀真菌的基因編輯方法研究中，最常用的基因編輯元件遞送方式有以下3種：第1種是Cas9蛋白和gRNA的表達(dá)元件以線性雙鏈DNA的形式通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入細(xì)胞；第2種是將Cas9蛋白和gRNA的表達(dá)元件以質(zhì)粒的形式導(dǎo)人細(xì)胞，這2種方法都是在體內(nèi)完成表達(dá)和組裝，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的剪切；第3種是將Cas9蛋白進(jìn)行異源表達(dá)、純化，并對(duì)gRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，最后將有活性的Cas9蛋白與體外轉(zhuǎn)錄的gRNA在體外進(jìn)行組裝，形成核糖核蛋白復(fù)合體（ribonucleoprotein complex，RNP），RNP通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的編輯。第1種方法簡(jiǎn)稱表達(dá)盒法，具有簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)，但Cas9蛋白和gRNA的表達(dá)元件有可能整合進(jìn)基因組使Cas9蛋白持續(xù)表達(dá)，也有可能造成脫靶效應(yīng)；第2種方法簡(jiǎn)稱自主復(fù)制質(zhì)粒法，是將Cas9蛋白和gRNA的表達(dá)元件連接在AMA1自主復(fù)制質(zhì)粒上，將其以質(zhì)粒的形式進(jìn)行遞送，該方法比表達(dá)盒法稍復(fù)雜，但質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后能進(jìn)行自主復(fù)制，Cas9和gRNA表達(dá)盒位于同一載體，也保證了它們同時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，且Cas9蛋白和gRNA的表達(dá)元件沒(méi)有整合進(jìn)基因組的風(fēng)險(xiǎn)，生物安全性較好，適用于食品、藥品領(lǐng)域的工業(yè)菌種的改造；第3種方法簡(jiǎn)稱RNP法，與前2種方法相比更復(fù)雜，但RNP復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)為瞬時(shí)表達(dá)，無(wú)基因編輯元件整合進(jìn)基因組的風(fēng)險(xiǎn)，可以減小Cas9蛋白毒性、降低脫靶率[14-15]。上述3種方法各有利弊，使用哪種方法往往取決于菌株的特性以及對(duì)基因編輯效率的要求。

本研究首先通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，結(jié)合Ehrlich染色法對(duì)1株絲狀真菌F316進(jìn)行鑒定，欲建立一套簡(jiǎn)單高效地區(qū)分塔賓曲霉和黑色曲霉的方法。通過(guò)帶有不同長(zhǎng)度同源臂的供體DNA（donorDNA），將潮霉素抗性基因定點(diǎn)整合進(jìn)該絲狀真菌fwnA基因的內(nèi)部，分析比較同源重組效率；進(jìn)一步探索適合的基因編輯方法，使用表達(dá)盒法、自主復(fù)制質(zhì)粒法和RNP法對(duì)funA基因進(jìn)行敲除，篩選適用于塔賓曲霉的基因編輯方法，為塔賓曲霉的菌種改造奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株與試劑F316菌株購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC-3.316），Ehrlich試劑檢測(cè)用黑曲霉菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；4-二甲氨基-苯甲醛（4-dimethylamino-benzalde-hyde）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；商品化Cas9蛋白購(gòu)自GenScript公司；硫酸卡那霉素和氨芐青霉素購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；重組酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；DNA高保真聚合酶購(gòu)自北京全式金生化科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；T7轉(zhuǎn)錄試劑盒MEGAscriptT7HighYield Transcription Kit購(gòu)自invitrogen公司；RNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；DNA提取液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

Ehrlich試劑： 2g4. -二甲氨基-苯甲醛溶于85mL 無(wú)水乙醇中，添加 15mL10mol?L^-1HCl ，充分混合。基因提取緩沖液：將EDT 1-2Na?2H₂O 501.4612g.NaCl0.5844g.SDS1g.Tris0.6057g 溶于蒸餾水中，定容至 100mL，pH8.5 。STC溶液：山梨醇 ，Tris 0.61g，CaCl₂ 0.55g ，定容至100mL ， pH7.5～8.0 ，過(guò)濾滅菌。PEG溶液：PEG4000 50g ，Tris .61g，CaCl₂ 0.55g ，定容至100mL，pH 7.5～8.0 ，高溫高壓滅菌。酶解液：溶壁酶溶于 0.6mol?L^-1NaCl ，過(guò)濾滅菌。

1.1.2培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（ 1000mL ）：5g酵母提取物、 δ.10gNaCl，10g 蛋白陳。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 20g 瓊脂粉。YPD液體培養(yǎng)基 （1000mL ）： 20g 葡萄糖 20g 蛋白陳 .5g 酵母提取物。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)培養(yǎng)基： 1mol?L^-1 山梨醇、 10g 葡萄糖、 20g 瓊脂粉。PDA（potato dextroseagar）固體培養(yǎng)基（ 1000mL ：24gPDA，20g 瓊脂粉。CYA（Czapek yeast agar）固體培養(yǎng)基（ 100mL ）： 1mL 查氏濃縮液 （ FeSO₄?7H₂0 、0.001 g ZnSO₄?7H₂O 、0.000 5 gCuSO₄?5H₂O ） .0.5gK₂HPO₄.0.5g 酵母提取物 蔗糖、 .1.5g 瓊脂粉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌種形態(tài)觀察及Ehrlich染色試驗(yàn) ① 菌株培養(yǎng)：采用“點(diǎn)植法\"將菌株接種于查氏培養(yǎng)基上， 恒溫培養(yǎng)獲得菌落，7d后測(cè)量菌落直徑，記錄初生菌絲顏色、菌落正反面顏色變化、表面特征、有無(wú)滲出物、色素產(chǎn)生等。 ② 制片及鏡檢：在滅菌載玻片上鋪1層察氏固體培養(yǎng)基，接種孢子，蓋上滅菌蓋玻片，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，加 3mL 20% 的滅菌甘油水溶液，待孢子產(chǎn)生時(shí)進(jìn)行顯微鏡觀察，記錄菌絲特征、孢子和產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)等，用OLYMPUS（IX71S8F-3）顯微攝影，并用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量菌絲直徑、孢子大小、分生孢子囊直徑、頂囊直徑和頂囊上分生孢子柄的長(zhǎng)度，共觀察10個(gè)視野，所有數(shù)據(jù)取平均值。

采用Ehrlich染色法鑒定黑曲霉與塔賓曲霉：將在CYA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1周的黑曲霉與F316菌落切下 1cm×1cm 的瓊脂塊，放置于含有Ehrlich試劑的EP管中浸泡大約 10min 后，觀察Ehrlich試劑的顏色變化。

1.2.2菌株分子鑒定將F316菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～5d ，制成孢子懸液接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于 32^°C?200r?min^-1 培養(yǎng)1d后收集菌體。基因組DNA提取采用真菌DNA快速提取試劑盒（OMEGA公司）。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增 ITS，BenA，CaM 基因，引物如表1所示。PCR體系為： 2×Taq PCR MasterMix25μL ，引物各 1.0μL ，DNA模板 1.0μL ddH₂O 補(bǔ)足至 50μL 。PCR程序： ： 95^°C 個(gè)循環(huán)； 72^°C 5min ; 4°C 保溫。用 1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。將檢測(cè)后的PCR產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司純化并測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行BLAST比對(duì)，使用ClustalX按照最大同源性的原則進(jìn)行排序，最后通過(guò)MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，以確定其種屬地位。

表1本研究所用引物

1.2.3表達(dá)原件的準(zhǔn)備donorDNA的構(gòu)建以F316的基因組DNA為模板，采用fwn-up-500/1k/2k/4k-F與fwn-up-R分別擴(kuò)增獲得500、1000、2000.4000bp 長(zhǎng)度的上游同源臂序列。采用fwn-dw-500/1k/2k/4k-R與fwn-dw-F分別擴(kuò)增獲得500，1000，2000，4000bp 長(zhǎng)度的下游同源臂序列；以40-fwn-hph-F和40-fwn-hph-R為上下游引物，擴(kuò)增獲得具有 40bp 同源臂的潮霉素抗性基因表達(dá)框。先將上游同源臂和潮霉素表達(dá)框做融合PCR，再將得到的融合片段與下游同源臂進(jìn)行第2輪融合PCR，得到不同同源臂長(zhǎng)度的含有抗性標(biāo)簽的donor DNA。

Cas9表達(dá)盒包含來(lái)自構(gòu)巢曲霉的terf1啟動(dòng)子、Cas9蛋白的完整編碼序列以及terf1的終止子，由Cas9-F/R引物對(duì)擴(kuò)增，質(zhì)粒模板為pFC332質(zhì)粒（Addgene公司，#87842）；5spro-gRNA-fwn表達(dá)盒包含黑曲霉來(lái)源5sRNA的啟動(dòng)子、 20nt 的fwnA基因特異識(shí)別序列及gRNA的非特異識(shí)別序列（表2），由5sRNA-F/gRNA-R引物從質(zhì)粒Bluntsimple-5sRNA-fwn（實(shí)驗(yàn)室制備并保存）中擴(kuò)增，Cas9表達(dá)盒與gRNA表達(dá)盒的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后進(jìn)行純化，用于F316菌株的轉(zhuǎn)化。

pFC332質(zhì)粒經(jīng)過(guò)BglI酶切將其線性化，5s-BglII-F/R擴(kuò)增gRNA表達(dá)盒，之后將 pFC332 質(zhì)粒與gRNA表達(dá)盒進(jìn)行重組，測(cè)序正確后的pFC332-gRNA-fwn質(zhì)粒用于F316菌株轉(zhuǎn)化。

1.2.4核糖核蛋白復(fù)合體的制備funA基因序列參考 NCBI 網(wǎng)站（NCBI Reference Sequence：NW_023336289.1）; gRNA 的體外轉(zhuǎn)錄模板見(jiàn)表2，gRNA-fwn為fwnA的gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板，其中20nt 陰影序列為特異識(shí)別序列；通過(guò)DNA合成后作為模板，使用MEGAscriptT7轉(zhuǎn)錄試劑盒，體外轉(zhuǎn)錄gRNA。 gRNA 與金斯瑞生產(chǎn)的Cas9蛋白在體外孵育形成RNP，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。

1.2.5原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化將F316菌絲接種于YPD液體培養(yǎng)基， 搖床振蕩培養(yǎng) 12～18h ，獲得菌體。菌體在酶解液中酶解 ^2h 后獲得原生質(zhì)體，通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)盒或RNP分別與donorDNA一起遞送進(jìn)原生質(zhì)體，具體方法參考文獻(xiàn)[18]。試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中加入潮霉素，陽(yáng)性對(duì)照不加潮霉素。倒平板后置于 32^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2d

如圖1所示，研究同源臂長(zhǎng)度對(duì)基因編輯效率影響時(shí)，使用RNP法，不同試驗(yàn)組donorDNA的長(zhǎng)度不同，每個(gè)試驗(yàn)組加入相同摩爾質(zhì)量的donorDNA（以 500bp 同源臂的donorDNA使用10μg 為標(biāo)準(zhǔn)），RNP由 4μg Cas9蛋白和 10μg gRNA孵育而成。比較表達(dá)盒法、自主復(fù)制質(zhì)粒法和RNP法的基因編輯效率時(shí)， 500bp 同源臂的donorDNA用量均為 10μg ，其中表達(dá)盒法中，gRNA和 Cas9 的表達(dá)盒用量均為 10μg ；自主復(fù)制質(zhì)粒法，donorDNA添加量為 10μg ，質(zhì)粒pFC332-gRNA-fwn添加量為 5μg ;RNP法中將 1μg Cas9蛋白和 20μggRNA 在 37°C 水浴鍋中孵育 30min 得到RNP復(fù)合體。

1.2.6轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，將各種表達(dá)原件導(dǎo)入F316細(xì)胞內(nèi)，在SGA培養(yǎng)基上 32^°C 培養(yǎng)2d，將得到的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子接種至含PDA的24孔板繼續(xù)培養(yǎng)3＼～4d，統(tǒng)計(jì)白孢和雜孢數(shù)量，初步篩選出基因敲除菌株。同時(shí)提取白孢和雜孢的基因組DNA，驗(yàn)證其同源重組效率。在研究遞送方式對(duì)同源重組效率的影響時(shí)，使用500-fwn-F和HPH-150-R引物，驗(yàn)證插入位點(diǎn)是否正確；研究同源臂長(zhǎng)度對(duì)同源重組效率影響時(shí)，不同長(zhǎng)度同源臂分別用500/1k/2k/4k-fwn-F和HPH-150-R引物，檢測(cè)上游插入位點(diǎn)；使用HPH-150-F和500/1k/2k/4k-fwn-R引物檢測(cè)下游插入位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證。

使用Cas9-YZ-F/R引物以及fwngRNA-YZ-F/R引物，隨機(jī)對(duì)22個(gè)白孢和雜孢轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，檢測(cè)Cas9蛋白和gRNA的表達(dá)盒是否整合進(jìn)轉(zhuǎn)化子的基因組中。

2 結(jié)果與分析

2.1 F316菌種鑒定

2.1.1菌種形態(tài)觀察及Ehrlich染色試驗(yàn)F316菌株在CYA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，其菌落呈同心圓狀，初期為白色，后期菌落中間產(chǎn)生黑褐色孢子，外環(huán)有白色營(yíng)養(yǎng)菌絲，菌落直徑 6.40～6.50cm ，菌落質(zhì)地呈絲絨狀（圖2A-1和2），背面有放射狀溝紋，顏色為淡黃褐色（圖2A-3），無(wú)滲出液，孢梗柄直徑 10～12μm （圖2A-4），分生孢子頭球形，直徑70～120μm （圖2A-5）；分生孢子球形，直徑 4～5μm 分生孢子表面稍粗糙（圖2A-6）。由此表明，F(xiàn)316菌株的形態(tài)特征和塔賓曲霉的相關(guān)特征吻合[19]。

Ehrlich染色試驗(yàn)（圖2B）表明，在酸性條件下，F(xiàn)316菌株為無(wú)色，即反應(yīng)呈陰性；而黑曲霉菌株的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色（黃色），即反應(yīng)呈陽(yáng)性。2.1.2ITS、BenA、CaM序列比較與進(jìn)化樹(shù)分析基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2C）表明，F(xiàn)316菌株的ITS序列與黑曲霉的ITS序列具有較高的同源性，其中與菌株AspergillusnigerF285的親緣關(guān)系最近；基于BenA和CaM序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2D和E）顯示，F(xiàn)316菌株分別與Aspergillus tubingensis CBS115656 和 AspergillustubingensisQF05的親緣關(guān)系最近。

綜上，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，將F316菌株鑒定為塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis），菌株命名為AspergillustubingensisF316。

2.2表達(dá)原件的擴(kuò)增與構(gòu)建

以F316菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)融合PCR，將上游同源臂、潮霉素抗性基因表達(dá)框、下游同源臂依次連接，成功獲得長(zhǎng)度分別為1.6、2.6、3.6、5.6和 9.6kb 的donorDNA;以PFC332質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得了 5.5kb 的Cas9表達(dá)盒；以質(zhì)粒Bluntsimple-5sRNA-fun為模板，擴(kuò)增獲得了gRNA表達(dá)盒（圖3A）。

2.3 轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

F316菌株進(jìn)行PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，2d后篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出抗潮霉素的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子挑至24孔板，待長(zhǎng)出孢子后，根據(jù)孢子顏色可分為白孢、雜孢、黑孢（圖3B和C）。隨機(jī)選擇22個(gè)白孢及雜孢轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，檢測(cè) Cas9 蛋白和gRNA的表達(dá)盒整合進(jìn)轉(zhuǎn)化子基因組中的概率為 100% （圖3D和E）。

2.4同源臂長(zhǎng)度對(duì)同源重組效率的影響

構(gòu)建 40，500，1000，2000，4000bp 同源臂長(zhǎng)度的donorDNA，通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。由圖4可知，所有白孢和雜孢的donorDNA片段均正確插入到目標(biāo)位點(diǎn)。這一結(jié)果表明，在后續(xù)試驗(yàn)中可以根據(jù)孢子顏色統(tǒng)計(jì)基因敲除效率，且該效率等于同源重組效率。其中 40bp 同源臂的同源重組效率最低;500與 1000.2000 與 4000bp 同源臂的重組效率差別較小。 40，500，1 000 、2000…4000bp 同源臂的同源重組效率分別為22.78%.25.70%.25.23%.56.94%.50.00% ；同源臂長(zhǎng)度為 2 000bp 時(shí)的同源重組效率達(dá) 56.94% ，較其他組分別高 34.16，31.24，31.71，6.94 個(gè)百分點(diǎn)。

2.5不同遞送方式對(duì)同源重組效率的影響

比較3種遞送方式的基因編輯效率，結(jié)果（圖6表明，表達(dá)盒法、自主復(fù)制質(zhì)粒法和RNP法3種遞送方式的同源重組效率分別為 70.14%.66.67% 、25.70% ，其中表達(dá)盒法和自主復(fù)制質(zhì)粒法的同源重組效率顯著高于RNP法。與RNP法相比，表達(dá)盒法的同源重組效率提高44.44個(gè)百分點(diǎn)；自主復(fù)制質(zhì)粒法提高40.97個(gè)百分點(diǎn)。自主復(fù)制質(zhì)粒法與表達(dá)盒法的同源重組效率差異較小。

3討論

曲霉屬真菌由于形態(tài)結(jié)構(gòu)相似度較高，很難用經(jīng)典的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)區(qū)分，因此必需結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育研究等其他手段，才能有效地鑒定[20]。ITS序列分析被廣泛應(yīng)用于菌種的鑒定，但真菌由于進(jìn)化順序、變異等原因，在ITS間隔區(qū)上表現(xiàn)出的差異也較小，不適合于屬內(nèi)種及種群的鑒定，還需要二次識(shí)別標(biāo)記[2]。因此在曲霉屬菌株鑒定過(guò)程中，可以根據(jù)菌株形態(tài)進(jìn)行初步鑒定，之后通過(guò)

注：不同小寫(xiě)字母表示在 Plt;0.05 水平差異顯著。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference at Plt;0.05 level.

ITS、BenA、CaM等序列進(jìn)行分子鑒定，以提高鑒定的準(zhǔn)確度。本研究對(duì)F316菌株的ITS序列進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，同源性最高的序列大多來(lái)源于黑曲霉；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)316與AspergillusnigerF285在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚為同一簇群；但F316的fwnA基因與黑曲霉來(lái)源的fwnA基因在序列上存在明顯差異，進(jìn)一步對(duì)F316進(jìn)行 CaM，BenA 基因進(jìn)行鑒定，同時(shí)結(jié)合染色試驗(yàn)，最終將F316菌株鑒定為塔賓曲霉，即CGMCC-3.316為塔賓曲霉，這一結(jié)果在Flipphi等2的研究中也得到進(jìn)一步驗(yàn)證。菌種鑒定看似簡(jiǎn)單，但卻是微生物研究的基礎(chǔ)，如果菌株被錯(cuò)誤鑒定，一定會(huì)對(duì)后續(xù)試驗(yàn)造成影響，甚至導(dǎo)致不可挽回的損失，例如，一些受到管制的曲霉屬菌種如果鑒定失誤，菌株所產(chǎn)生的真菌毒素如赭曲霉毒素或黃曲霉毒素，可能會(huì)對(duì)食品安全和人類健康造成威脅[10]。

基于CRISPR/Cas9的基因編輯元件包括Cas9蛋白、 gRNA 和donorDNA，其中，donorDNA用于同源重組，往往包含篩選標(biāo)記基因，如潮霉素基因等，donorDNA的同源臂長(zhǎng)度也會(huì)對(duì)基因編輯效率產(chǎn)生影響。對(duì)于不同物種而言，同源臂的長(zhǎng)度要求也不同。例如，釀酒酵母只需要 50bp 同源臂，同源重組效率可以達(dá)到 100% ；Baker等[22]研究表明，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在小鼠干細(xì)胞中的基因編輯效率隨著同源臂長(zhǎng)度的增加而提高，當(dāng)同源臂長(zhǎng)度為 20kb 時(shí)編輯效率提升約10倍。因此，本研究在對(duì)F316菌株進(jìn)行基因編輯研究時(shí)，將同源臂長(zhǎng)度分別設(shè)置為 40，500，1000，2000，4000bp 用潮霉素作為篩選標(biāo)記，構(gòu)建donorDNA，結(jié)果表明，同源臂長(zhǎng)度為 2000bp 時(shí)，同源重組效率達(dá)到56.94% ；同源臂長(zhǎng)度為 4000bp 時(shí)，同源重組效率為 50% ；同源臂長(zhǎng)度為500和 1000bp 時(shí)的同源重組效率差異較小，同源臂長(zhǎng)度為 40bp 的同源重組效率最低。一般而言，加長(zhǎng)同源臂能在一定程度上提高同源重組效率，但同源臂并不是越長(zhǎng)越好。本研究發(fā)現(xiàn)，同源臂長(zhǎng)度為2000和4000 bp時(shí)的同源重組效率相近。此外，當(dāng)同源臂太長(zhǎng)時(shí)，donorDNA進(jìn)人細(xì)胞核的難度會(huì)增加，載體構(gòu)建也有一定困難。因此，可根據(jù)插入片段的長(zhǎng)度選擇合適的同源臂。

為了尋找適合F316菌株的基因編輯方法，本研究對(duì)表達(dá)盒法、自主復(fù)制質(zhì)粒法和RNP法進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，對(duì)于F316菌株，表達(dá)盒法和自主復(fù)制質(zhì)粒法的同源重組效率高于RNP法，其原因可能有以下幾個(gè)方面： ① RNP法中Cas9蛋白和gRNA因?yàn)槭窃隗w外表達(dá)、純化和合成的，其活性和穩(wěn)定性可能不如在體內(nèi)直接表達(dá)的好；② RNP復(fù)合體的體積相對(duì)較大，對(duì)原生質(zhì)體的遞送效率可能較線性DNA差； ③ 由于絲狀真菌自身的多核性特點(diǎn)，很難對(duì)原生質(zhì)體中的所有細(xì)胞核都進(jìn)行基因編輯，這也是產(chǎn)生雜孢轉(zhuǎn)化子的原因，RNP法中獲得雜孢轉(zhuǎn)化子的比例更高，說(shuō)明RNP法對(duì)多核真菌的編輯效率較低； ④ 表達(dá)盒法的基因編輯元件易于整合進(jìn)菌株的基因組中，表達(dá)時(shí)間持續(xù)較長(zhǎng)，表達(dá)量可能更多，而RNP復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)是短暫作用，隨后會(huì)被體內(nèi)的酶類降解，沒(méi)有時(shí)間效應(yīng)的加持； ⑤ 自主復(fù)制質(zhì)粒法的Cas9和gRNA表達(dá)盒位于同一載體，保證了它們同時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，且自主復(fù)制質(zhì)粒在沒(méi)有篩選壓力的情況下易于丟失，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)選擇標(biāo)記的基因編輯。

以上結(jié)果表明，對(duì)于同一菌種，采用不同的基因編輯元件遞送方式及donorDNA的不同同源臂長(zhǎng)度設(shè)計(jì)都會(huì)影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率，因此，在試驗(yàn)前期摸索適宜的基因編輯方法是很必要的，有利于提高菌種的改造效率，為后續(xù)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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