干旱脅迫下小粒咖啡SNP位點與可變剪接分析

圖分類號：S571.2 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）06-0072-11

Analysisof SNPLoci and Alternative Splicing Events in Coffea arabicaL.UnderDrought Stress

YU Haohao ^1，2 ，DONG Xiangshu1，ZHAO Hao1，LI Zhongxian2，HU Faguang2，LI Yanan ² LOUYuqiang2，HE Feifeil* （1.SchoolofAgriculture，YunnanUniversity，Kunming65o5o，China；2.IstituteofTropicalandSubtropicalCashCros Yunnan Academy of Agriculture Science，Yunnan Baoshan 678ooo，China）

Abstract：To enrich the information on single nucleotide polymorphism（SNP）lociand elucidate theroleof alternative splicing（AS） events inresponse to drought stressin Coffea arabicaL.，C.arabica cultivar‘Catimor’was employed as the experimental material for drought stresstreatment for7and14d，respectively.RNA-seq technology combinedwith bioinformatics methodswasutilizedtostatisticallyanalyzethedrought-resistant SNPlociandAS events in C .arabica.Theresults showed thata total of 265O47 SNP loci were identified inallthe samples，with a transition rate of 60.72% and a transversion rate of 39.28% ，distributed on11 chromosomes，with the most SNPs on Chr.2.The numbers of SNPloci located inexons and intronsof thegene were 110582and100 936，respectively. Sequence anotation revealed thatthe SNPloci were mainly enriched inaminoacid synthesis，transport and carbon metabolism.TheresultsofASeventanalysis showedthat3809and4142diferentASevents were identified inthe comparison groups of2 drought stages （O dof drought vs7dof drought；7 dof droughtvs14dof drought）， respectively.Among them，SE was found to bethe most prevalent splicing mode.The genes responsible for these AS events showed significant assciations with spliceosome and mRNA surveillance pathway.Through comparative analysis between differential expression genes and AS genes，4 splicing factors （LOC113699257，LOC113712703， LOC113741326 and LOC113730764）consistently demonstrated significant up-regulation under drought stress conditions.These drought-induced splicing factorsmight playcrucialroles inregulatingcofeeresponse todrought stress orroot development.Above results laid a foundation for further revealing the molecular mechanism of C arabica in response to drought stress.

Key Words：Coffea arabica L.;drought stress；SNP loci; alternative splicing

小粒咖啡（CoffeaarabicaL.）是茜草科咖啡屬常綠灌木或小喬木，具有喜溫涼、喜潮濕、不耐旱的特點，是繼石油之后排名世界第二的原料型產品，在全球熱帶亞熱帶地區廣泛種植-2]。云南省作為中國最大的咖啡產區，其種植面積和產量均占據全國的 98% 以上，當地生產的小粒咖啡以“濃而不苦，香而不烈，略帶果酸”的風味特點聞名于世。在云南干熱區，農田生態環境脆弱，土壤瘠薄、酸性強、保水能力差，退化和水土流失較嚴重。伴隨全球氣候變化，季節性干旱頻發、并發，焚風效應明顯，云南小粒咖啡在1個生長季中有長達半年多的時間處在干旱少雨的環境下4，使其品質與產量難以保證。抗旱分子機制研究將是未來探明小粒咖啡耐旱性與遺傳育種研究的主要發展方向。

目前，咖啡的基因組圖譜已測序完成，但其在轉錄水平的調控是復雜的過程，包括單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）變異和可變剪接（alternativesplicing，AS）等。SNP主要是指由單個核昔酸的變異而引起的基因組水平上的DNA序列多態性，包括單堿基的缺失、插入、轉換及顛換等[5]，是研究基因組多樣性、推斷種群或個體間關系以及研究標記-性狀關聯的有力工具。目前，SNP分子標記技術已廣泛應用于咖啡生豆鑒別、種質資源、化學品質等方面。在生豆鑒別方面，Zhang等基于SNP分子標記技術，利用多變量分析和分配測試實現了小粒種咖啡和中粒種咖啡間的明確區分；在種質資源方面，MerotL'Anthoene等8從咖啡基因組數據庫中篩選出8580個獨特且信息豐富的SNP，其中 40% 的SNP位于注釋基因中，該矩陣包含149個與多個控制重要農藝性狀的關鍵基因相關聯的SNP標記；Mekbib等通過對小粒咖啡進行全基因組重測序，共檢測到1108萬個遺傳變異，其中 87.9% 為SNP，高質量的基因組數據為深入研究咖啡種質遺傳進化及性狀形成的分子機制打下了基礎；在化學品質方面，José-Luis等基于SNP分子標記和超高效液相色譜-串聯質譜（ultraperformanceliguidchromatography-massspectrometry，UPLC-MS/MS）關聯分析的研究方法鑒定出8個與咖啡豆化學成分顯著相關的SNP標記，其中1個與咖啡因含量顯著相關，5個與三角堿含量顯著相關，2個與綠原酸含量顯著相關，這些位點均可應用于精品咖啡的育種計劃。然而，目前還未有關于咖啡干旱相關SNP位點的研究。

AS是普遍存在于高等真核生物中的轉錄后調控機制，有助于增加真核生物基因表達的復雜程度和蛋白質功能的多樣性，從而增加生物的適應性。真核基因在最初的轉錄過程中，先轉錄為前信使RNA（pre-mRNA），pre-mRNA可經多種剪接方式，產生不同的成熟mRNA，進而翻譯成具有不同功能的蛋白質發揮作用。這種pre-mRNA經不同剪接方式形成成熟mRNA的過程稱為AS2。AS事件廣泛存在于逆境脅迫下的植物中，對于增強植物的脅迫耐受性十分重要。當植物遭受外界非生物脅迫時，大量剪接因子的表達模式會發生改變，通過形成剪接復合物改變基因的剪接模式從而影響植物的抗逆性[13]。例如，在擬南芥中，miRNA162通過選擇性剪接增加功能性pre-miRNA162a，并優先結合poly-A位點，從而增強植物對干旱和鹽分的耐受性[14]。Seok等[15]研究證明，ANNAT4、MAGL6、TRM19和CAD9等剪接體在擬南芥根系中差異表達，表明AS是根系響應缺水脅迫的重要調節機制。Sanyal等通過對CIPK3的3個剪接體進行表達譜分析表明，CIPK剪接體的差異表達和下游靶點的選擇可能是 Ca²⁺ 介導脫落酸（abscisicacid，ABA）和干旱信號的優先調節機制之一。但AS事件在咖啡屬植物中還鮮有研究。

目前，國內外缺乏關于咖啡響應干旱脅迫的基因位點變異和結構分析的研究報道。因此，篩選和分析小粒咖啡抗旱相關SNP位點與AS事件，對豐富小粒咖啡基因序列及結構信息，對闡明小粒咖啡抗旱分子機制及深入挖掘耐旱基因資源具有重要意義。‘Catimor'在云南省廣泛種植，具有產量高、抗性強的特點，因此，本研究以該品種為研究材料，基于已獲取的高通量轉錄組數據，系統分析小粒咖啡SNP變異位點與AS事件的轉錄本結構信息，挖掘與干旱脅迫響應相關的AS基因，提供對干旱脅迫下小粒咖啡發生AS事件的全面認識，以期為后續闡明小粒咖啡抗旱性的分子機制及深入利用小粒咖啡基因資源提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

以小粒咖啡品種‘Catimor'為試驗材料。選用生長良好、長勢均一的半年齡幼苗栽種于花盆中，置于人工氣候箱中預培養30d，按最大持水量的 70% 對幼苗進行正常供水直到試驗開始。培養條件為長日照周期（ 16h 光照 /8h 黑暗）培養溫度 （晝/夜）、濕度 65% 、光照強度600μmol?m^-2?s^-1. ，之后開始干旱脅迫處理。干旱脅迫處理采用持續不澆水的處理方式，取樣時測定其土壤含水率。分別于干旱O（CK，土壤含水率70% ）、7（D，土壤含水率 46% ）和14d（HD，土壤含水率 28% ）進行破壞性取樣。取幼苗根系組織為試驗樣品，擦凈后迅速用鋁箔紙包裹嚴實，置于液氮中速凍，然后置于 -80^°C 超低溫冰箱備用。每個處理設置4次重復。

1.2 SNP鑒定與分析

為探究正常生長狀態和干旱脅迫后小粒咖啡的遺傳差異位點，利用課題組前期開展的小粒咖啡干旱脅迫轉錄組數據（未發表），以GCF_003713225.1_Cara_1.0_genomic.fna為參考基因組進行比對。根據cleanreads在參考基因組上的比對結果，使用Varscan程序獲取SNP位點，過濾標準為：SNP位點堿基 Qgt;20 ；覆蓋該位點的reads數目 ^gt;8 ；支持突變位點的reads數目 gt;2 ;SNP位點的P 值 lt;0.01 。之后使用snpEff軟件進行功能注釋，探究SNP所在基因的生物學功能，進行GO（geneontology database）和 KEGG（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes）注釋。

1.3 AS事件分析

為探究不同干旱脅迫階段下小粒咖啡的AS事件及其表達量的差異，利用rMATS軟件對轉錄組數據進行差異AS分析。分析同一AS事件在2個樣本中是否存在差異，使用BenjaminiHochberg法對2個樣品中的 P 值采用FDR（1discoveryrate）法進行多重假設檢驗，將FDR lt;0.05 的AS事件認為具有差異顯著性。選用KEGG富集分析注釋差異AS基因的功能。

1.4 數據分析

使用Excel2019軟件進行數據整理和分析。利用PrismGraphpad軟件（版本8.0.2）制作柱形圖，利用Omicshare生信分析平臺（https：//www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft）進行Venn分析、GO富集分析和KEGG通路分析與作圖，以FDR lt;0.05 為篩選標準。

2 結果與分析

2.1干旱脅迫下SNP變異位點鑒定

從小粒咖啡品種‘Catimor'的12個樣品中共鑒定出265047個SNP位點，突變類型可分為A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T共6種，其中A/G、C/T的突變數量最多；其次為 A/T?C/G，A/C?G/T 的突變數量最少（圖1A）。SNP突變在基因區和基因間區的數量分別為161007和104153個，經計算SNP轉換率和顛換率分別為 60.72% 和 39.28% 。此外，SNP位點在2號染色體上的分布最多，為47381，占17.88% ；在3和10號染色體上分布最少，分別為16904和15235，占 6.38% 和 5.75% （圖1B）。對SNP在參考基因組功能元件的分布進行統計，結果顯示，分布在外顯子和內含子的SNP位點最多，分別為110582和100936個；分布在長鏈非編碼RNA外顯子剪接位點的SNP位點最少，僅有7個（圖1C）。編碼區SNP位點突變類型如表1所示。其中CK組（干旱0d鑒定出移碼替換1609＼～1620個，非移碼替換347＼～382個，非同義單核苷酸突變32972＼～35619個，終止密碼子增加103＼～114個，終止密碼子減少35＼～42個，同義單核苷酸突變35002＼～37284個，未知類型605＼～646個；D組（干旱7d）鑒定出移碼替換1404＼～1550個，非移碼替換282＼～306個，非同義單核苷酸突變26104＼～28819個，終止密碼子增加85＼～103個，終止密碼子減少27＼～33個，同義單核昔酸突變27954＼～30708個，未知類型533＼～600個；HD組（干旱14d）鑒定出移碼替換1404＼～1550個，非移碼替換282＼～306個，非同義單核苷酸突變26104＼～28819個，終止密碼子增加85＼～103個，終止密碼子減少27＼～33個，同義單核昔酸突變27954＼～30708個，未知類型533＼～600個。總體來說，在編碼區單核苷酸突變為數量最多的突變類型，并且隨干旱脅迫時間的延長，各類型的SNP位點數量逐漸下降。

A：SNP突變類型統計；B：SNP在染色體上的分布情況；C：SNP在參考基因組功能元件上的分布

A：StatisticsofSNPmutationtypes；B：DistributionofallSNPonchromosomes；C：DistributionofSNPonfunctionalelementsof the

reference genome

2.2干旱脅迫下SNP位點的功能注釋

SNP位點的GO功能注釋分析結果表明，在生物過程（biological process，BP）中，顯著富集于單有機體細胞過程（GO：0044763）、細胞定位（GO：0051641）小分子代謝過程（G0：0044281）、細胞內定位建立（GO：0051649）、胞內運輸（GO：0046907）等（圖2A）；在細胞組分（cellcomponent，CC）中，顯著富集于細胞內（GO：0005622）、細胞部分（GO：0044464）、細胞（GO：0005623）、細胞內部分（GO：0044424）、細胞質（GO：0005737）等（圖2B）；在分子功能中（molecularfunction，MF）中，顯著富集于酸酐水解酶活性（GO：0016817）、核苷三磷酸酶活性（G0：0017111）、含磷酸酐中酸酐水解酶活性（GO：0016818）、焦磷酸酶活性（GO：0016462）、ATP酶活性（GO：0016887）等（圖2C）。SNP位點的KEGG注釋結果如圖2D所示，與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成 （ko00400） ）、氨基酸生物合成（ko01230）、核細胞質運輸 ko03013 ）、碳代謝（ko01200）蛋白酶體 ko03050， 等通路顯著相關，其中氨基酸生物合成途徑中SNP位點數量最多，共201個。

2.3干旱脅迫下的差異AS事件分析

目前，AS方式大體上可分為外顯子跳躍（skippedexon，SE）、外顯子互斥（mutuallyexclusiveexon，MXE）、內含子保留（retainedintron，RI）、5'端可變剪接（alternative 5^° splicesite，A5SS）和3'端可變剪接（alternative3’splicesite，A3SS）5類。在本研究中，干旱脅迫7d時，與干旱0d相比，共鑒定出3809個差異AS事件。其中，包括2190個SE、211個MXE、208個RI、397個A5SS和803個A3SS（圖3A）。同一個基因可能存在多種AS方式，例如，LOC113714462（未表征的含WD重復序列的蛋白C2A9.03樣）同時發生了5種AS方式。其中SE和A3SS數量最多，包含165個基因（圖3B）。為進一步了解這些發生AS的基因在植物體的作用，對3809個顯著差異的AS事件進行基因功能富集分析，結果如圖3C所示。可以看出，發生AS事件基因的功能大多與剪接體 （ko03040） 、mRNA監控途徑（ ko03015） 、自噬 ko04136， 、嘧啶代謝（ko00240）、葉酸生物合成（ko00790）等過程顯著相關。

隨著干旱脅迫的持續進行，與干旱7d相比，干旱14d處理組共鑒定出4142個差異AS事件。其中，包括2666個SE、476個MXE、164個RI、275個A5SS和561個A3SS（圖4A）。此外，LOC113707757和LOC113699048（均為未表征蛋白）同時發生了5種AS方式，而SE和MXE間重疊的AS數量最多，包含279個基因（圖4B）。為進一步了解這些發生AS的基因在植物體的作用，對4142個顯著差異的AS事件進行基因功能富集分析，結果如圖4C所示。可以看出，發生AS事件基因的功能大多與脂肪酸降解 （ko00071 、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解中 ko00280 ）、過氧物酶體（ko04146）、剪接體L ko03040^′ 、mRNA監控途徑（ ko03015， 等過程顯著相關。

總的來說，在整個干旱脅迫處理期，SE是數量最多的AS方式，RI是數量最少的AS方式。并且，干旱后期（DvsHD）相比干旱早期（CKvsD）的差異AS事件數量更多，AS方式主要為SE和MXE。這些發生AS事件的基因主要與剪接體、mRNA監控等途徑顯著關聯。這些結果進一步表明，AS可能在調控小粒咖啡根系干旱響應方面發揮重要作用。

2.4差異表達與可變剪接基因的比較分析

KEGG富集分析表明，剪接體 是發生差異AS事件通路中數量最多的顯著富集途徑。在不同干旱處理下，共有87個剪接體相關基因發生AS事件。其中，干旱7d時（CKvsD）有27個基因發生特異性剪接；在干旱14d時（DvsHD）有20個基因發生特異性剪接；在2個時期均發生AS事件的基因共40個（圖5A）。對這87個基因進行差異表達分析表明，干旱7d時（CKvsD）有25個基因上調表達；干旱14d時（DvsHD）有9個基因上調表達，3個基因下調表達（圖5B）。總體來說，上調表達基因數量明顯多于下調表達基因，共33個剪接體相關基因對不同干旱處理的響應差異顯著。進一步分析差異表達基因的AS模式，在干旱7d時分別鑒定出23個SE、3個MXE、5個RI、6個A5SS、13個A3SS；在干旱14d時分別鑒定出12個SE、4個MXE、2個RI、4個A5SS、4個A3SS。其中，SE和A3SS占比較高，并且同一剪接體相關基因可能會出現多種剪接方式（圖5C）。

為進一步揭示轉錄本對不同干旱脅迫處理的響應，分析LOC113699257（ATP依賴性RNA解旋酶樣蛋白DB10）L0C113712703（剪接因子U2af大亞基B樣）、LOC113741326（pre-mRNA剪接因子SPF27同源物）、L0C113730764（富含甘氨酸的RNA結合蛋白RZ1C樣）4個剪接體相關基因的表達模式，結果（圖5D）表明，這4個編碼基因在2個干旱時期均發生了顯著AS事件和顯著差異表達。LOC113699257、LOC113712703、LOC113741326、LOC113730764分別位于7、10、4、2號染色體上，干旱脅迫使這4個基因的表達水平顯著提升。進一步對其AS模式進行分析發現，L0C113712703、LOC113741326、L0C113730764與SE有關，LOC113699257與A3SS有關。

3討論

如今，小粒咖啡已經成為云南省重要的高原特色農業產業，在繁榮少數民族經濟、推進邊疆地區鄉村振興中占據重要的地位。在農業生產中，小粒咖啡根系主要分布在0一 ^-30cm 土層中，獲取水分的能力較差，易遭受干旱脅迫，給穩定產量和提升品質帶來了極大的挑戰。因此，為解析SNP位點和AS事件在小粒咖啡抗旱方面的作用，本研究基于高通量轉錄組數據，首次對干旱脅迫下小粒咖啡的SNP位點和AS事件進行了鑒定分析。

本研究共篩選得到265047個SNP位點，其中A/G、C/T型較多，A/T、C/Gc次之，A/C、G/T型較少，轉換率和顛換率分別為 60.72% 和 39.28% ，與周琳開發NCBI數據庫中咖啡SNP位點得到的65.56% 與 34.44% 相近，微小差異的原因可能是NCBI數據庫中包含了中粒種咖啡和大粒種咖啡。從SNP位點在功能元件分布來看，本研究SNP位點多分布在編碼區的外顯子區域，外顯子區域與表達蛋白的氨基酸序列直接相關，此類SNP位點的堿基變異可能會引起氨基酸序列的變化[8]。此外，分布在2號染色體上SNP位點最多，其次是1、6和7號染色體，占比為 9.82%～10.45% ，其余7條染色體上分布較均勻，與Sousa等[對21211個小粒咖啡SNP位點進行分型得到的染色體分布結果一致。本研究中，265047個SNP位點位于19789個基因中，經基因功能注釋發現，這些基因主要分布在氨基酸生物合成、核細胞質運輸、碳代謝、蛋白酶體等通路中，這些通路與物質運輸、能量代謝緊密相關，表明干旱脅迫影響了小粒咖啡的物質合成與代謝進程，促使一系列復雜的分子機制發揮作用，進而引發SNP位點變異。由此表明，SNP位點變異的基因廣泛參與干旱脅迫下小粒咖啡的各種代謝反應過程，并通過物質合成與運輸的變化影響表型性狀的建成。在小粒咖啡中，不同品種的抗旱性具有明顯差異，例如紫葉變異‘卡蒂姆'的耐脫水能力與葉綠素熒光參數會明顯強于普通‘卡蒂姆'品種[20]。咖啡可能也是因為功能基因變異產生SNP的富集導致其形態的多樣性及植株耐旱性的增強[21]。

AS事件已在多種植物中進行了研究，但國內外尚未在咖啡的轉錄組水平上系統地分析和報道AS事件。在不同發育時期和不同組織中，基因都可能發生不同方式的AS事件。研究表明，RI是水稻、擬南芥、木薯中AS事件的主要類型[22-24]，而A3SS在番茄和卷心菜中是主要的AS類型[25-26]。然而，擬南芥中AS轉錄本的全面信息表明，許多RI的讀取覆蓋率相對較低，在轉錄本中代表性較差，說明基因中RI的數量可能被高估[2]。涉及AS事件調控的干旱脅迫反應，主要的AS類型也不同[28，本研究系統分析了干旱脅迫下小粒咖啡的差異AS事件，結果表明，在不同干旱脅迫程度下，SE均為最主要的AS方式，其次是A3SS、MXE、A5SS、RI，與 Yang 等[29]、Pang等[30在水稻中的研究結果相似。其原因在于干旱脅迫后AS位點的核苷酸序列以GC-AG和AT-AC為主。由于U12型剪接使用AT-AC位點，表明干旱脅迫可能會增加U12型剪接，從而增加SE的發生頻率。

在大豆根系中的研究表明，干旱脅迫下AS事件顯著富集的KEGG途徑主要包括剪接體、mRNA監控途徑等31]。本研究也發現，剪接體途徑為富集數量最多的顯著差異途徑，共鑒定出87個剪接體相關基因。剪接調控因子在植物響應非生物脅迫過程中非常重要。例如，剪接體因子SKIP可以通過調節鹽脅迫條件下剪接供體與受體間的識別模式，從而控制擬南芥的滲透耐受性；過表達富含絲氨酸/精氨酸的蛋白剪接因子PtSC27可以通過提升丙二醛含量、過氧化物酶和過氧化氫酶活性增強植物耐鹽性33；木薯中MeSCL30的過表達通過維持活性氧穩態和增加干旱響應基因的表達來增強對干旱脅迫的耐受性[4。在本研究中，干旱脅迫導致剪接體相關基因總體呈上調表達趨勢，可能是通過調節剪接體基因表達從而增強咖啡植株耐旱性。本研究經顯著差異表達基因和AS事件的共同分析，篩選出LOC113699257（ATP依賴性RNA解旋酶樣蛋白DB10）L0C113712703（剪接因子U2af大亞基B樣）、LOC113741326（pre-mRNA剪接因子SPF27同源物）、L0C113730764（富含甘氨酸的RNA結合蛋白RZ1C樣）共4個剪接體在干旱脅迫下持續顯著上調。這些干旱誘導的AS因子可能在調控咖啡響應干旱脅迫或根系發育中發揮重要作用。因此，未來有必要進一步對這些剪接調控因子進行深入的基因功能研究。

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