淫羊藿素骨靶向脂質體的制備及表征研究

中圖分類號：R944.2 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8751（2025）03-0187-07

Preparation and Characterization of Bone Targeting Icaritin Liposomes

Lai Jin-mei1， Zhang Shuang-qing2，LiuLi-han3 （1 ShenzhenLuohu Maternity and Child HealthcareHospital， Shenzhen 518000; 2 National Institute forNutritionand Health，Chinese Center for DiseaseControland Prevention，Beijing100050; 3 School of Pharmaceutical Sciences， Southern Medical University， Guangzhou 510515）

Abstract： ObjectiveTo prepare icaritin （ICT）-loading bone targeting liposomes and characterize in vitro properties.MethodsThe bone targeting peptide CSDsSD was synthesized by solid-phase peptide synthesis，and covalently linked to DSPE-PEG2000-MAL to obtain DSPE-PEG2000-CSDSSD.ICT liposomes were synthesized by membrane dispersionusing egg yolk lecithin，cholesterol，DSPE-PEG2oo-CSDsSD，and the ICT.The particle size and potential of ICT liposomes were measured using a Malvem instrument. The drug loading and encapsulation efficiency of ICT liposomes were analyzed using UV-Vis absorbance spectroscopy.ResultsThe ICT liposome had a hydrodynamic particle size of 225.3±1.8nm and a Zeta potential of -20.8±0.5mV. The transmission electron microscope image showed that ICT liposomes were uniformly sized spherical particles with a dry particle size of below 30nm . ICT liposomes did not significantly alter in hydrodynamic particle size or polydispersity over the course of a week， maintaining a particle size of about 225nm and a polydispersity index of less than O.26. The drug loading of ICT in ICT liposomes was 9.87% ，and the encapsulation efficiency was 68.90% .ConclusionWe have successfully prepared bone targeting liposomes with good stability， drug loading and encapsulation efficiency.

Key words： icaritin; liposomes； bone targeting; preparation; characterization

淫羊藿素（Icaritin，ICT）是小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿的活性成分淫羊藿苷的酶降解產物和淫羊藿黃酮類化合物的腸道代謝物[1]。據文獻報道，ICT具有廣泛的藥理作用，可用于抗骨質疏松、抗炎[]、心血管保護治療、抗腫瘤治療[4]和免疫治療[5]等。

ICT能有效下調炎癥因子表達，維持成骨細胞和破骨細胞之間的平衡，通過促進骨形成和抑制骨吸收，顯著恢復骨小梁量、骨小梁結構和骨的生物力學性能，從而顯示出良好的抗骨質疏松治療效果，因此在抗骨質疏松治療受到廣泛關注和深入研究。目前，ICT應用于抗骨質疏松治療已經進入I期臨床試驗。同時因ICT具有骨吸收、抑制脂肪生成和促進骨形成的藥理作用，其在類固醇相關骨壞死的預防治療方面也具有良好潛力[7]。

然而ICT水溶性較差，進入體內后半衰期較短，代謝快，生物利用度較低限制其臨床應用[8-9]。同時由于無骨靶向性，ICT很難被輸送到骨組織和骨細胞[o]。為了提高ICT對骨質疏松治療效果，維持有效血藥濃度，提高藥物遞送效率，增強對骨表面的靶向性是關鍵。基于此，設計了一種負載ICT的骨靶向脂質體，提高ICT到達骨組織的藥物濃度，充分發揮ICT的抗骨質疏松的治療效果。具體地，通過多肽固相合成法合成骨靶向多肽CSDSSD[]，并將CSDSSD通過共價連接在兩親性共聚物DSPE-PEG2000上得到DSPE-PEG2000-CSDSSD。然后我們將蛋黃卵磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000-CSDSSD通過薄膜分散法合成脂質體，并負載ICT，最終成功獲得一種具有較高載藥量的骨靶向脂質體（ICT-Liposome，圖1）。

1材料和方法

1.1材料

2-氯-三苯甲基氯樹脂（ 100～200 目，負載：0.625mmol/g） ，N-芴基-9-甲氧基基（Fmoc）保護的L-氨基酸[Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc-Ser（Tbu）-OH，Fmoc-Cys（Trt）-OH]；N，N'-1-羥基苯并三氮唑（HOBt）和縮合劑苯并三氮唑-NNN'N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）購于上海吉爾生化有限公司。二異丙基乙胺（DIEA）、乙二硫醇（EDT）、三氟乙酸（TFA）和2，6-二甲基吡啶購于上海阿拉丁試劑有限公司。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和磷脂-聚乙二醇-馬來酰亞胺（DSPE-PEG2000-MAL）購買于西安瑞禧生物科技有限公司。二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、二氯甲烷（DCM）、鹽酸、乙醚和乙酸酐購自廣州化學試劑廠。哌啶購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）。

1.2實驗儀器

精密天平（SQP＼QUINTIX65-1CN，賽多利斯，德國），渦旋混合儀（SCILOGEX＼SCI-VS，賽洛捷克，美國），高功率數控超聲清洗器（KQ-400KDB，昆山舒美，中國），全自動在線樣品純化-三重四極液質聯用儀（LC-MS/MS，美國），基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（BrukerAutoflexSpeed TOF/TOF，Bruker，德國），透射電子顯微鏡（TecnaiG2F20S-Twin，FEI美國），冷凍干燥機（ModulyoD-230，ThermoFisher，美國），Zetasizer納米粒度電位儀（ZetasizerNanoZS，Malvern，英國），紫外可見分光光度計（UV-2600，島津公司，日本），純水儀（MasterTouch-Q15，上海和泰，中國），恒溫磁力攪拌器（MS7-H550-PRO，北京大龍公司，中國）。

1.3骨靶向肽HS-CSDSSD的制備

如圖2，利用多肽固相合成法[12]制備靶向肽HS-CSDSSD：將 200mg RinkAmide-AM樹脂（0.625mmol/g） 置于多肽合成柱中，用蒸餾過的DMF溶脹30min；加入 20% 哌啶（DMF配制）通 N₂ 反應 10min×2 次以脫除樹脂的Fmoc保護基團，抽濾，DMF洗滌。稱取Fmoc-Asp（OtBu）-OH（ 153.3mg ）、HBTU（170.7mg）、HOBt（ 60.8mg ，加入DMF（1mL）和DIEA（152.8μL 溶解，將溶液加入合成柱中，通 N₂ 反應 2.5h ，抽濾，DMF洗滌。配制封端溶液（醋酸酐、DMF和DIEA分別為 150μL ， 2.67mL 和 269μL 加入合成柱中，與樹脂上多余的氨基反應 30min （簡稱封端），抽濾，DMF洗滌4次。同法用 20% 哌啶脫去Fmoc保護基團。稱取Fmoc-Ser（Tbu）-OH（145.8 mg）、HBTU（170.7mg）和HOBt（60.8 mg），加入DMF（1 mL）和DIEA（152.8μL 溶解，將溶液加入合成柱中，通 N₂ 反應 ³h ，抽濾，DMF洗滌。同法繼續依次接上Fmoc-Ser（Tbu）-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（Tbu）-OH和Fmoc-Cys（Trt）-OH。同法用 20% 哌啶脫去Fmoc保護基團和醋酸封端。最后分別DMF、甲醇和DCM洗滌，加入 95% TFA 1.5mL （TFA、EDT和超純水分別為 1425μL ， 37.5μL 和 37.5μL ），通N反應 120min ，將產物從樹脂上剪切下來。抽濾，用DCM洗滌，轉移濾液至 50mL 圓底燒瓶中進行旋蒸，除去大部分有機溶劑，直至余下 2mL 濾液后逐滴滴入大量冰乙醚中充分沉淀， 8000r/min 離心 10min ，棄去上清，再次用冰乙醚沉淀、離心，重復2次，除盡乙醚以外的其他有機溶劑。將沉淀物放入真空干燥箱干燥，獲得干燥后產品H，CCO-Cys-Ser-Asp-Ser-Ser-Asp-NH₂ （縮寫為HS-CSDSSD），通過電噴霧質譜（ESI-MS）Rink amide-am resin 樹脂1）.脫Fmoc保護基團2）.Fmoc-Asp（OtBu）-OH， HBTU， HOBt，EA√3）封端（醋酸酐：DMF：DIEA）4）.脫Fmoc保護基團5）.Fmoc-Ser（Tbu）-OH，HBTU，HOBt，DIEA6）.脫Fmoc 保護基團7）.Fmoc-Ser（Tbu）-OH，HBTU，HOBt，DIEA8）.脫Fmoc 保護基團9）.Fmoc-Asp（OtBu）-0H，HBTU，HOBt， DIEA10）.脫Fmoc保護基團11）.Fmoc-Ser（Tbu）- OH，HBU，HOBt，IEA12）.脫Fmoc 保護基團13）.Fmoc-Cys（Trt）-OH，HBTU，HOBt，IEAnos-Cys（Trt）-Ser（Tbu）-Asp（OtBu）-Ser（Tbu）-Ser（Tbu）-Asp（OtBu）-resin14）. Remove Fmoc protecting group15）.封端（醋酸酐：DMF：DIEA）V16）.TFAH2O/Thioanisole O= 95 ：2.5 ：2.5Cys-Ser-Asp-Ser-Ser-Asp（縮寫：CSDSSD）進行質譜結構確證。

1.4 DSPE-PEG2000-CSDSSD的合成

DSPE-PEG2000-MAL與HS-CSDSSD以摩爾量比1：3投料，溶于添加少量堿（10摩爾等比的DIEA）的DMF（需要提前除氧），在氮氣保護條件下進行邁克爾加成反應合成DSPE-PEG2000-CSDSSD[13]，將反應后溶液轉移到截留分子量為1000的纖維素透析袋中，再在純水中（先在DMF中）透析除去剩余游離多肽，凍干獲得DSPE-PEG2000-CSDSSD。使用傅里葉紅外光譜檢測儀和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF）進行結構確證。

1.5ICT-Liposome的合成和表征

以膽固醇、蛋黃卵磷脂、DSPE-PEG2000-CSDSSD、DSPE-PEG2000和ICT質量比為1.15：6.47：0.69：0.46：1投料，完全溶于乙醇，加入氯仿混合均勻，然后37 ^°C 旋蒸形成薄膜，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS， pH6.8 ， 10mmol/L 超聲水化 10min ，通過透析 除去游離藥物，最后通過離心超濾方法濃縮（ 100kDa ， 3500r/min） 。利用馬爾文電位粒徑儀測定其粒徑和電位，并測定材料在水溶液中的7d穩定性。同時利用透射電鏡觀察ICT-Liposome的形狀和大小。

1.6紫外光譜分析ICT-Liposome載藥量和包封率

分別以 95% DMSO為溶劑，用配制好的理論濃度為 100μg/mL 的ICT母液各配制一組理論濃度為2μg/mL 、 3.125μg/mL 、 6.25μg/mL 、 10μg/mL 和12.5μg/mL 的待測液，掃描其紫外吸收曲線 （250～800 nm）。分析其紫外可見分光光譜，獲得ICT的最大吸收波長，并擬合制作標準曲線。取透析前一定量的脂質體，以 14000r/min 轉速超速離心 30min ，取5μL沉淀，用純 950μL DMSO溶解，并用 95% DMSO稀釋，在最大吸收波長測定吸光度值。同時一定量的制備好的脂質體冷凍干燥，稱量約 0.5mg 的凍干樣品，95%DMSO溶解并稀釋，在最大吸收波長測定吸光度值。按照下列計算公式得到脂質體的載藥 （LE）和包封率（Qw）：

包封于納米粒內的藥物質量

LE（%）= ×100% 載藥納米粒的總質量包封在納米粒內的藥物質量

Qw（%）= ×100% 藥物投料總質量

2結果與討論

2.1骨靶向肽HS-CSDSSD的合成和表征

首先通過多肽固相合成法合成多肽HS-CSDSSD，其精確分子量為653.20，在ESI-MS負離子模式下，理論上出現 [M-H⁺] 的準分子離子峰，質荷比為652.20。所合成的產物的質譜結果如圖3，質譜圖出現質荷比為652.13的準分子離子峰，符合多肽HS-CSDSSD的分子量大小，可確證多肽的結構。

2.2 DSPE-PEG2000-CSDSSD的合成和表征

參考文獻的方法合成DSPE-PEG2000-CSDSSD[13]，多肽HS-CSDSSD上的巰基-SH可通過邁克爾加成反應與DSPE-PEG2000-MAL上的馬來酰亞胺共價連接。使用傅里葉紅外光譜檢測儀對獲得的產物進行結構確證。理論上多肽HS-CSDSSD的游離巰基在 2500～2600nm 有小波峰，與其他化合物共價連接后小波峰消失。如圖4所示，HS-CSDSSD的紅外光譜圖上在 2590～2530nm 上有波峰，與DSPE-PEG2000-MAL上的馬來酰亞胺共價連接后，波峰消失，可證明DSPE-PEG2000-CSDSSD已成功合成。同時通過觀察時間飛行質譜MALDI-TOF（圖5），DSPE-PEG2000-CSDSSD的分子量范圍 3000～4200 ，相當于DSPE-PEG2000-MAL（ 2400～3600 增加了大約600的分子量，與HS-CSDSSD的分子量相符，進一步確證了DSPE-PEG2000-CSDSSD的合成。

2.3ICT-Liposome的合成和體外性能表征

采用簡單的薄膜分散法制備了骨靶向脂質體ICT-Liposome。隨后，對ICT-Liposome的粒徑和形貌進行了表征。采用馬爾文粒徑電位測量儀測定

ICT-Liposome在水溶液中的流體動力學直徑和Zeta電勢，測得ICT-Liposome的DLS粒徑為 225.3±1.8 nm[ 多分散指數（PDI）：0.216]，Zeta電位為- .20.8±0.5 mV（圖6A和B）。根據透射電子顯微鏡（TEM）結果（圖6C）顯示，ICT-Liposome為大小均一的球形顆粒，粒徑為 30nm 以下。以上結果表明ICT-Liposome具有理想的粒徑和負電性，有利于實現體內被動靶向骨組織給藥。同時，我們對ICT-Liposome的粒徑穩定性和多分散性進行了監測。如圖6D所示，ICT-Liposome在一周內粒徑維持在 225nm 左右，PDI保持在0.26以下，粒徑和分散度沒有明顯變化，表明ICT-Liposome具有良好的粒徑穩定性。

2.4ICT-Liposome的紫外-可見吸收光譜分析、載藥率和包封率的測定

首先通過紫外-可見分光光度計獲得ICT的紫外-可見光譜圖（圖7），發現ICT的紫外最佳吸收波長為274nm 。利用紫外分光光度計測定不同的濃度的ICT在 274nm 處的吸光度，繪制標準曲線，擬合曲線公：DSPE-PEG200-CSDSSD的MALDI-TOF圖；B：DSPE-PEG200-MAL和DSPE-PEG2000-CSDSSD的MALDI-TOI式為 C=0.06945A-0.00613（R^z=0.998） ，代入標準曲線中根據載藥量計算公式計算得ICT-Liposome中ICT的載藥率為 9.87% ，包封率為 68.90% 。

3結論

通過多肽固相合成法成功制備了骨靶向肽CSDSSD，并通過邁克爾加成反應將多肽CSDSSD連接在DSPE-PEG2000上合成DSPE-PEG2000-CSDSSD 。利用蛋黃卵磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000-CSDSSD三種原料通過薄膜分散法制備脂質體，并負載ICT，最終獲得ICT-Liposome。ICT-Liposome具有理想的粒徑和電位，大小均一，粒徑穩定性良好，同時載藥量和包封率高。本研究設計合成的ICT-Liposome為實現ICT高效靶向骨組織，提高ICT到達骨組織的藥物濃度，充分發揮ICT的抗骨質疏松的治療效果提供一種新策略。

參考文獻

[1]Tai K，He X，Yuan X，et al.A comparison of physicochemical and functional properties of icaritin-loaded liposomesbasedondifferent surfactants[J].ColloidsSurfA Physicochem EngAsp，2017，518：218-231.

[2] 張軍，任躍明，張雙慶.淫羊藿素抗骨質疏松作用及其給 藥系統研究進展[J].中國藥學雜志，2021，56（10）：781- 784.

[3] 高麗芳，張雙慶.淫羊藿素抗炎作用的研究進展[J].國外 醫藥（抗生素分冊），2023，44（01）：26-32.

[4] Yu Z，Guo J，HuM， et al.Icaritin exacerbates mitophagy and synergizes with doxorubicin to induce immunogenic cell death in hepatocellular carcinoma[J].ACS Nano，2020， 14（4）： 4816-4828.

[5]Xue P， Chang Z， Chen H， et al. Macrophage membrane （MMs） camouflaged near-infrared （NIR） responsive bone defect area targetingnanocarrier delivery system （BTNDS） for rapid repair： promoting osteogenesis via phototherapy and modulating immunity[J]. JNanobiotechnology，2024， 22（1）： 87.

[6] GaoL，Zhang SQ.Antiosteoporosis effects， pharmacokinetics，and drug delivery systems of icaritin： advancesand prospects[J].Pharmaceuticals（Basel），2022， 15（4），397.

[7]Chen S， Zheng L， Zhang J，et al. A novel bone targeting delivery system carrying phytomolecule icaritin for prevention of steroid-associated osteonecrosis in rats[J]. Bone，2018，106：52-60.

[8] ZhangSQ，ZhangSZ.Oral absorption，distribution， metabolism，andexcretionof icaritininratsbyQ-TOFand UHPLC-MS/MS[J]. Drug Test Anal， 2017，9（10）：1604- 1610.

[9] HuangZW，YangYX，HuangLH，etal.Pharmacokinetics and metabolism of icaritin in rats by UPLC-MS/MS[J]. Food Sci Nutr，2019，7（12）：4001-4006.

[10]賈征，張彥，陳智仙，等.淫羊藿素主動骨靶向納米粒在 大鼠體內的藥代動力學[J].衛生研究，2019，48（05）：847- 849.

[11]Katsumi H，Yamashita S，Morishita M，etal.Bone-targeted drug delivery systemsand strategiesfor treatment of bone metastasis[J].ChemPharmBull（Tokyo），2020，68（7）：560- 566.

[12]王宇航，陳學明，劉俗生，等.一種多肽固相合成方法與純 化策略研究[J].中國生物工程雜志，2023，43（01）：35-41.

[13]Liu XY，RuanL M，Mao WW， et al.Preparation of RGDmodified long circulating liposome loadingmatrine，and its invitro anti-cancer effects[J].IntJMedSci，2010，7（4）：197- 208.