南海羽毛藻共附生放線菌分離鑒定及其活性測定

摘""要：病原細菌是造成水產養殖業損失的主要因素，目前生物防治被認為是一種很有前途的防治策略。海藻是海洋生態系統的重要組成部分，海藻藻際有豐富多樣的微生物群落。為探究南海海藻共附生放線菌資源的多樣性及潛在的應用價值，對海南陵水羽毛藻共附生放線菌進行分離、鑒定與抗菌活性測試。采用稀釋涂布法對采集的羽毛藻進行放線菌分離，并進行16S"rRNA基因測序、序列比對及系統發育樹構建。結果表明：分離獲得鏈霉菌屬（Streptomyces）20株、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）1株以及微桿菌屬（Microbacterium）1株；采用濾紙片法以歐文斯氏弧菌（Vibrio"owensii）等9種病原細菌為靶標對菌株發酵粗提物進行抗菌活性測試，結果顯示，所有菌株至少對1種細菌表現出抑制作用；通過高效液相色譜分析菌株粗提物的化學多樣性，結果顯示，菌株HZ057具有更豐度的次級代謝產物；為了進一步研究菌株鹽脅迫耐性，進行了耐鹽性測試，結果顯示，所有菌株在0%～4%"NaCl條件下生長良好，菌株HZ054和HZ057在12%"NaCl濃度下仍有孢子生長；對菌株HZ057進行全基因組測序并通過antiSMASH預測各基因簇功能，結果顯示，其基因組含有29個次級代謝產物基因簇且結構類型多樣，有待進一步深入發掘。本研究從南海羽毛藻中分離獲得鏈霉菌屬、擬諾卡氏菌屬以及微桿菌屬菌株，并且發現它們具有一定程度的抗菌活性和較豐富的次級代謝產物產生能力，具有潛在的研究價值。本研究結果為推進羽毛藻共附生微生物的開發利用，以及為南海海藻共附生放線菌資源的研究奠定基礎。

關鍵詞：羽毛藻；共附生放線菌；分離鑒定；抗菌活性；次級代謝產物中圖分類號：R915；Q939.92""""""文獻標志碼：A

Isolation，"Identification"and"Antibacterial"Activity"of"Symbiotic"or"Epiphytic"Actinomycetes"Associated"with"Caulerpa"sertularoides"f."Longipes"in"South"China"Sea

LIU"Zheliang1，2，3，"GUO"Zhikai2，"A"BU"LAI"ZI"Ailiman2，"ZHANG"Shiqing2，"MA"Shuai2，"WANG"Rong3*，"XIONG"Zijun2*

1."Hainan"Tropical"Ocean"University，"Sanya，"Hainan"572000，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Hainan"Key"Laboratory"of"Tropical"Microbe"Resources"/"Hainan"Institute"for"Tropical"Agricultural"Resources"/"Key"Laboratory"for"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Hainan"Academy"of"Ocean"and"Fisheries"Sciences"/"Hainan"Provincial"Key"Laboratory"of"Tropical"Maricultural"Technologies，"Haikou，"Hainan"571126，"China

Abstract："Pathogenic"bacteria"are"the"primary"causative"agents"of"economic"losses"in"the"aquaculture"industry，"and"biological"control"is"currently"regarded"as"a"promising"strategy"for"prevention"and"management."Algae，"as"crucial"components"of"marine"ecosystems，"host"diverse"and"abundant"microbial"communities"within"their"phycospheres."In"order"to"explore"the"diversity"and"potential"application"value"of"algae-associated"symbiotic"or"epiphytic"actinomycetes"resources"in"South"China"Sea，"the"isolation"identification"and"antibacterial"activity"screening"of"symbiotic"or"epiphytic"actinomycetes"from"Caulerpa"sertularoides"f."Longipes，"collected"from"Lingshui，"Hainan，"were"carried"out."Actinomycetes"were"isolated"through"dilutionnbsp;coating"method"and"identified"according"to"the"16S"rRNA"gene"sequences"alignment"and"by"phylogenetic"tree"construction."The"results"revealed"that"20"strains"were"identified"as"Streptomyces，"one"as"Nocardiopsis，"and"one"as"Microbacterium."The"antibacterial"activity"of"the"fermented"crude"extracts"of"the"obtained"strains"was"evaluated"against"nine"pathogenic"bacteria，"including"Vibrio"owensii"using"the"filter"paper"method."Results"showed"that"all"strains"exhibited"inhibitory"effects"on"at"least"one"type"of"bacteria."High-performance"liquid"chromatography"（HPLC）"was"employed"to"assess"the"chemical"diversity"of"the"crude"extracts."Results"showed"that"strain"HZ057"had"a"higher"abundance"of"secondary"metabolites"than"other"strains."To"further"investigate"the"salt"stress"tolerance"of"the"strains，"salt"tolerance"tests"were"conducted."The"results"showed"that"all"the"strains"could"grow"well"on"0%?4%"NaCl，"HZ054"and"HZ057"could"still"grow"at"a"salt"concentration"of"12%."The"whole"genome"of"HZ057"was"sequenced"and"the"functions"of"each"gene"cluster"were"predicted"using"antiSMASH."The"analysis"revealed"that"the"genome"contained"29"secondary"metabolite"genes"clusters"with"diverse"structural"types，"indicating"that"this"strain"is"associated"with"a"rich"diversity"of"secondary"metabolites."In"this"study，"strains"of"Streptomyces，"Nocardiopsis"and"Micrococcus"were"isolated"firstly"from"the"algae"Caulerpa"sertularoides"f."Longipes"in"the"South"China"Sea，"indicating"that"the"algae"contained"abundant"actinomycete"resources."Moreover，"it"was"found"that"the"identified"strains"exhibited"significant"antibacterial"activity"and"the"ability"to"produce"a"variety"of"secondary"metabolites，"suggesting"the"potentials"for"future"research"and"applications.

Keywords："Caulerpa"sertularoides"f."Longipes;"symbiotic"or"epiphytic"actinomycetes;"isolation"and"identification;"antibacterial"activity;"secondary"metabolites

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.024

在過去幾十年，自然漁業資源的枯竭促進了水產養殖的蓬勃發展，目前亞洲水產60%以上來源于中國，并且產量還在逐年增加。大規模及高密度養殖使海洋病原細菌引起的病害嚴重影響水產養殖業[1-2]。據不完全統計，水產病害導致我國每年水產養殖損失高達上百億元。為快速有效地控制各種疾病，人們常使用殺菌劑及抗生素等化學藥物，但濫用化學藥劑導致耐藥性等問題日益突出，促使對生物防治的需求不斷提高。目前放線菌來源的天然產物已成為微生物源農藥的主體之一[3]。如土霉素和克林霉素已廣泛應用于漁業病害防治，以減緩或替代部分化學農藥的使用。由于陸生環境中新生物活性物質的發現數量逐年減少，導致人類對新型生物活性物質的探索進程受到嚴重阻礙[4]，人類將目光轉向目前開發不足10%的海洋。海洋放線菌在高壓、高鹽、缺氧、低（無）光照等特殊的海洋生態系統中可能產生結構新穎和活性顯著的次級代謝產物[5-8]。

海藻藻際存在大量微生物，海藻為微生物提供營養，反之微生物通過產生生物活性物質或結構新穎的次級代謝產物保護其宿主[9-10]。例如，石莼來源放線菌產生具有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant"Staphylococcus"aureus，"MRSA）活性的苯丙霉素類化合物[11]，從褐藻中分離得到的鏈霉菌產生活性代謝物去鐵胺B及其新衍生物去鐵胺B2對MRSA、耐亞胺培南鮑氏不動桿菌（imipenem-resistant"Acinetobacter"baumannii，"IRAB）和耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（carbapenem-resistant"Pseudomonas"aeruginosa，"CRPA）具有抗菌活性[12]。由此可見，海藻共附生放線菌具有產生新的活性次級代謝產物的能力，但是目前對藻類共附生微生物的研究主要集中在真菌上，而對放線菌培養利用的研究較少[13]。

羽毛藻，學名棒葉蕨藻變種（Caulerpa"sertul aroides"f."Longipes），隸屬于綠藻門（Chlo rop hy ta）綠藻綱（Chlorophyceae）蕨藻目（Caulerpales）蕨藻科（Caulerpaceae）蕨藻屬（Caulerpa），是一種羽毛狀的海藻，具有繁殖快、生長快和環境適應性強、吸收污染物以及生產有機物和氧氣等特點。近年來LIMA等[14]研究發現，將羽毛藻與蝦共生能使蝦的存活率與生長率顯著提高，這可能與羽毛藻表面的微生物有關，但尚未進行驗證。本研究對羽毛藻樣品的共附生放線菌進行分離、鑒定，并對其抗菌活性和次級代謝產物多樣性進行評價，以推進羽毛藻共附生微生物的開發利用，為南海海藻共附生放線菌資源研究奠定基礎。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試樣品""羽毛藻樣品采自海南省陵水黎族自治縣黎安鎮黎安港瀉湖（110°03′3.00″E，"18°25′46.66″N），采后將樣品裝入無菌密封袋中置于冰盒中保存。

1.1.2""培養基""（1）分離培養基。改良高氏1號培養基[10]：可溶性淀粉20.0"g/L、氯化鈉0.5"g/L、硫酸亞鐵0.01"g/L、硝酸鉀1.0"g/L、磷酸氫二鉀0.5"g/L、硫酸鎂0.5"g/L、瓊脂15.0"g/L、海鹽17.5"g/L，pH為7.3±0.2。

TWYE培養基[15]：酵母提取物0.25"g/L、磷酸氫二鉀0.5"g/L、瓊脂20"g/L、海鹽17.5"g/L，pH為7.3±0.2。

1/2"ATCC培養基[10]：葡萄糖10.0"g/L、可溶性淀粉20.0"g/L、酵母提取物5.0"g/L、酸水解酪蛋白5.0"g/L、碳酸鈣1.0"g/L、瓊脂15.0"g/L、海鹽17.5"g/L，pH為7.3±0.2。

（2）放線菌純化培養基。ISP2培養基[10]：麥芽提取物10.0"g/L、酵母提取物4.0"g/L、葡萄糖4.0"g/L、瓊脂20.0"g/L、海鹽17.5"g/L，pH為7.3±0.2。

（3）放線菌液體發酵培養基。LM1培養基：蔗糖20.0"g/L、麥芽提取物10.0"g/L、葡萄糖10.0"g/L、蛋白胨1.0"g/L、碳酸鈣1.0"g/L、海鹽17.5"g/L，pH為7.3±0.2。

LM3培養基：葡萄糖20.0"g/L、麥芽提取物10.0"g/L、蛋白胨1.0"g/L、碳酸鈣1.0"g/L、海鹽17.5"g/L，pH為7.3±0.2。

（4）抗菌活性篩選培養基。LB液體培養基[15]：胰蛋白胨10.0"g/L、酵母粉5.0"g/L、氯化鈉5.0"g/L、瓊脂20.0"g/L，pH為7.3±0.2。

胰酪大豆胨液體培養基（TSB）[10]：胰酪胨17.0"g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3.0"g/L、氯化鈉5.0"g/L、磷酸氫二鉀2.5"g/L、葡萄糖2.5"g/L、海鹽17.5"g/L，pH為7.3±0.2。

1.1.3""供試病原菌菌株""水稻白葉枯病菌（Xa nt ho monas"oryzae"pv."Oryzae，"A）、無乳鏈球菌（Stre ptococcus"agalactiae，"B）、哈維氏弧菌（Vib rio"harveyi，"C）、溶藻弧菌（V."alginolyticus，"D）、藤黃微球菌（Micrococcus"luteus，"E）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA，"F）、歐文斯氏弧菌（V."owensii，"G）、海豚鏈球菌（S."iniae，"H）、美人魚發光桿菌（Photobacterium"damselae，"I）保存于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所。

1.1.4""主要試劑和儀器""電子分析天平ME104T購自瑞士Mettler"Toledo集團；恒溫搖床（ZQZY-"CS8V）購自上海知楚儀器有限公司；色譜甲醇購自天津康科德科技有限公司；分析純級乙酸乙酯購自廣東光華科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海麥克林生化科技有限公司；電熱鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司；生化培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司；立式旋轉蒸發儀購自上海愛朗儀器有限公司；高效液相色譜儀（1260型）購自美國Agilent公司；數控超聲波清潔器KQ-500DE購自東莞市科橋超聲波設備有限公司。

1.2""方法

1.2.1""樣品處理及其共生微生物分離純化""使用無菌半海水（海鹽濃度為1.75%）清洗羽毛藻樣品2～3次，將沙泥沖洗干凈，用75%酒精浸泡30"s殺滅表面細菌，然后用無菌半海水沖洗2遍，置于超凈臺晾干。使用無菌鑷子、剪刀將樣品剪成小塊，置于無菌研缽中，加入5～10"mL無菌半海水研磨成漿，移入無菌試管進行梯度稀釋，吸取原液、10?1、10?2、10?3稀釋液各200"μL涂布于高氏1號、TWYE以及1/2"ATCC培養基（分離培養基均含50"μg/mL重鉻酸鉀）上，重復2個平板。倒置于28"℃恒溫培養箱中培養，每周觀察，培養至8周。根據菌落形態用牙簽挑取分離板上的單菌落，接種至ISP2固體平板培養基進行純化培養，多次純化后得到純培養物，對菌株進行編號，將菌株保存于無菌甘油（20%）中，置于–80"℃保存，備用。

1.2.2""放線菌16S"rRNA基因序列分析""將分離得到的菌株進行16S"rRNA基因測序。將獲得的序列在EZ"BioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/"login）數據庫中進行同源序列比對搜索，選擇相似度大于98%的菌株的16S"rRNA基因序列作為參比對象，使用MEGA"11軟件進行多序列對比，采用鄰接法（neighbor-joining"method）進行系統發育樹的構建和分析。

1.2.3""菌株的抗菌活性篩選""以供試病原菌菌株為指示菌進行活性篩選。在50"mL錐形瓶中配制20"mL液體LB培養基，于121"℃高壓滅菌20"min，冷卻后加入活化的病原菌菌液20"μL，在37"℃、160"r/min條件下振蕩培養12～24"h，使OD600為0.50～0.65，用于活性篩選試驗，并與40%甘油1∶1混合后保存于–80"℃。

（1）菌株發酵。根據形態和16S"rRNA序列分析結果將分離獲得的放線菌去重后選取LM1和LM3液體培養基進行小規模發酵。在純化的待測放線菌中挑取適量孢子接種于100"mL種子培養基TSB中，在28"℃、160"r/min條件下振蕩培養3"d，然后按體積分數為10%的接種量轉接至2"L發酵培養基LM1和LM3中，在28"℃、160"r/min條件下振蕩培養14"d。發酵結束后，在發酵液中加入等體積乙酸乙酯萃取3次，將有機相合并后在旋轉蒸發儀中濃縮得到粗提物，粗提物用二甲基亞砜（dimethyl"sulfoxide，"DMSO）配制成濃度為20"mg/mL的溶液，置于4"℃保存，用于抗菌活性檢測。

（2）活性篩選。采用濾紙片法觀察測定發酵粗提物對9種供試病原菌的抑菌活性。吸取200"μL病原菌菌液和20"mL冷卻至50"℃的LB固體培養基于50"mL錐形瓶中，混勻后傾注于培養皿。待平板凝固后，用無菌鑷子放入滅菌濾紙片（直徑10"mm），以DMSO為陰性對照，卡那霉素（10"mg/mL）為陽性對照，每個濾紙片上滴加10"μL菌株發酵粗提物（20"mg/mL），設置3次重復，置于28"℃恒溫培養12～24"h后觀察。如果供試樣品具有抑菌活性，在濾紙片周圍會出現清晰的無菌生長抑菌圈。采用十字交叉法測定抑菌圈直徑，重復3次。

（3）HPLC分析檢測。將菌株HZ037、HZ041、HZ046、HZ051、HZ054、HZ055、HZ056、HZ057、HZ063發酵提取物經色譜甲醇溶解后，使用0.22"μm過濾器過濾，濾液置于質譜小瓶進行HPLC檢測（Agilent"Zorbox"SB"C18色譜柱，"250"mm×4.6"mm，"5μm）。檢測條件：以超純水（A）、甲醇（B）為流動相；梯度洗脫：0～15"min，10%～"100%"B；15～20min，100%"B；20～25"min，10%"B，流量為1.0"mL/min，柱溫為25"℃，進樣量為10"μL。

1.2.4""菌株的耐鹽度試驗""刮取分離純化的9株放線菌孢子接種于TSB液體培養基中，置于搖床于28"℃、160"r/min振蕩培養3"d，吸取200"μL定量涂板。在分離菌株能夠生長良好的ISP"2培養基中分別添加0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%"NaCl滅菌后倒平板，定量涂布，每組設2個重復，倒置于28"℃培養箱恒溫培養14"d，觀察并記錄生長情況。

1.2.5""目標菌株的全基因組測序與分析""將菌株純化后送至測序公司，基于Nanopore"promethION"48三代技術平臺以及illumina"Novaseq"6000二代測序技術平臺進行測序，使用Flye軟件進行組裝得到高質量的組裝基因組，通過基因預測、功能元件分析，以及專有數據庫注釋了解全基因組的信息，通過antiSMASH（https：//antismash.second ar ymetabolites.org）在線網站對次級代謝基因簇進行分析。

2""結果與分析

2.1""海藻共附生放線菌菌種分離、鑒定

利用3種分離培養基從海南陵水采集的羽毛藻中共分離得到22株放線菌。其中，改良高氏1號培養基分離得到10株，1/2"ATCC培養基分離得到5株，TWYE培養基分離得到7株。由此可見，改良高氏1號培養基用于分離羽毛藻放線菌具有明顯優勢，可作為首選培養基。為確定菌株分類地位，對22株放線菌進行16S"rRNA基因序列鑒定，通過EZ"BioCloud序列比對、相似性分析，其中鏈霉菌屬（Streptomyces）最多（20株），擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）和微桿菌屬（Microbacterium）各1株，這些菌株為首次從羽毛藻中分離獲得的純培養物。根據16S"rRNA基因序列構建22株海藻共附生放線菌相近種之間的系統發育樹（圖1）。菌株HZ037、HZ039、HZ047、HZ052、HZ053、HZ061和HZ064與S."rochei"NRRLB"2410T的相似度達100%；HZ041、HZ042、HZ043、HZ044、HZ060和HZ062與S."daghestanicus"NRRLB"5418T的相似度為99.93%；HZ046、HZ048和HZ059與S."griseoincarnatus"LMG"19316T的相似度為100%；HZ051與S."abyssomicinicus"CHI39T的相似度為99.85%；HZ054與S."griseoflavus"LMG"19344T的相似度為100%；HZ055與N."changdeensis"Mg02T的相似度為99.71%；HZ056與S."luozhongensis"TRM"49605T的相似度為99.78%；HZ057與S."levis"NBRC"15423T的相似度為99.93%；HZ063與M."resistens"NBRC"103078T的相似度為98.31%。

2.2""菌株發酵粗提物抑菌活性及化學多樣性分析

以歐文斯氏弧菌等9種病原細菌為指示菌，采用濾紙片法對9株放線菌發酵粗提物進行抗菌活性測定。抗菌試驗結果如表1所示，9株放線菌均對至少1種指示菌表現出抑菌活性，但均對哈維氏弧菌（C）無抑制活性。將菌株HZ037、HZ041、HZ046、HZ051、HZ054、HZ055、HZ056、HZ057以及HZ063的發酵粗提物進行HPLC分析，結果發現菌株HZ057的次級代謝產物相較其他菌株的次級代謝產物豐富度高，以菌株HZ057為研究對象進行后續試驗。由于選用的2種液體培養基成分高度相似，使同種菌株在2種不同發酵培養基中獲得的粗提物活性和代謝產物豐富度較一致。

2.3""菌株HZ057的全基因組測序與分析

通過高通量測序對菌株HZ057進行全基因組測序獲得基因組數據，在NCBI中下載與菌株HZ057鄰近的相關菌株基因組序列，利用Type"Strain"Genome"Server（https：//tygs.dsmz.de/）構建菌株HZ057與鄰近菌株在全基因組水平上的系統發育樹（圖2）。在基因組系統發育樹中，菌株HZ057與S."djakartensis"JCM4957T聚為一支，進化關系最近，通過計算二者的平均核苷酸同一性（average"nucleotide"identity，"ANI）和數字DNA-"DNA雜交（digital"DNA-DNA"hybridization，"dDDH），分別為94.27%和56.00%，不支持二者為同一物種；選取與這2株菌聚類為同一大支的另外11株典型菌株，分別計算這些菌株與HZ057的ANI和dDDH（表2），結果顯示，ANI均小于目前原核生物分類體系中種分類的ANI臨界值（95%）和dDDH臨界值（70%）。由此推測，菌株HZ057可能是鏈霉菌屬的一個新物種，但仍需進一步結合其形態學特征、生理生化特征、培養特征和化學特征進行判斷。

通過antiSMASH在線網站（https：//antismash."secondarymetabolites.org）對菌株HZ057的次級代謝產物生物合成基因簇類型進行分析，結果如表3所示。菌株HZ057存在29個潛在的次級代謝產物合成基因簇，負責合成的次級代謝產物主要類型有：萜類（terpene）、聚酮類（PKS）、類似核糖體肽（RiPP-like）以及鐵載體（NI-siderophore）等。從基因簇相似度來看，HZ057有7個基因簇與已知基因簇的相似度為100%；有3個基因簇與已知基因簇的相似度大于60%，有12個基因簇與已知基因簇的相似度小于60%，有7個未知基因簇可能產生新的次級代謝產物。其中，基因簇9位于基因組的4553～76"325"nt，與去鐵胺B/E（desferrioxamin"B/E）生物合成基因簇相似度達到100%。去鐵胺是一種天然的螯合劑，主要用于治療鐵中毒以及與鐵相關的疾病治療[21]。基因簇24位于基因組46"157～71"976"nt，與萜類化合物iso re nierantene生物合成基因簇的相似度為100%。isorenierantene是一種芳香類胡蘿卜素，已成為涂抹奶酪的成分之一，具有特殊的抗氧化能力和顯著的光保護作用[29]。基因簇29位于基因組5070～46"254"nt，與Ⅲ型PKS"germicidin生物合成基因簇的相似度為100%，germicidin屬于α-吡喃酮家族的一員，具有烯烴和芳香化合物的性質，可作為關鍵的生物合成中間體并參與如生物防御等許多不同類型的生物反應過程，具有廣泛的生物活性[32]。

2.4""菌株耐鹽性試驗

選擇去重后的9株放線菌分別定量涂布于含不同濃度NaCl的ISP2固體培養基（不含海鹽）上，培養14"d后觀察菌株生長狀態。結果表明，所有菌株在含0%～4%"NaCl的固體培養基上生長良好，在含6%"NaCl的固體培養基上生長一般，在含8%"NaCl的固體培養基上有零星孢子生長；菌株HZ054和HZ057在含10%、12%"NaCl的固體培養基上仍有孢子生長（表4）。由此可見，菌株HZ054和HZ057具有高度的鹽環境適應性。

3""討論

3.1""海藻的生態與資源價值

海藻不僅對海洋生態系統的健康和平衡發揮著重要作用，而且含有豐富的活性物質。近年來，隨著對海洋動植物共附生放線菌的研究不斷深入，海藻共附生放線菌被不斷發現并受到關注。例如，于偉偉等[10]采用稀釋涂布平板法對6種海藻進行放線菌分離，從西沙海藻共附生環境中分離出鹽孢菌屬；PALMER等[32]分離鑒定了褐藻和馬尾藻來源的4個放線菌以及綠藻來源的3個放線菌；孫曉夢[33]利用稀釋平板法從采自北極新奧爾松地區的海洋紅藻多管藻樣品中分離純化得到60株可培養的藻類附生細菌，其中10株隸屬于放線菌門的鹽地桿菌屬（Salinibacterium）。目前海洋大型藻類已成為獲得新型藻類附生菌資源以及新型微生物活性物質的理想研究對象及分離源。

本研究通過采用3種分離培養基對羽毛藻的共附生放線菌進行分離，得到22株放線菌，其中鏈霉菌屬為優勢菌屬，擬諾卡菌屬以及微桿菌屬為海洋稀有放線菌屬，這表明羽毛藻中的放線菌種類較豐富。在耐鹽性測試中所有菌株在含0%～"4%"NaCl的培養基中均生長良好，而菌株HZ057和HZ054在含12%"NaCl的培養基中仍有孢子生長，說明羽毛藻共附生放線菌具有對鹽環境的適應性。

3.2""海藻放線菌在水產養殖病害防治中的潛力

由弧菌和鏈球菌等引起的病害是水產養殖業中影響嚴重的細菌型病害，發生如體色變黑、鰓絲呈灰白色、腹部腫脹、鰭基部充血、口部充血發紅等癥狀的弧菌病在我國沿海養殖區擴散[34]；能感染多種經濟魚的無乳鏈球菌造成魚的死亡率達30%～80%，經濟損失高達數億元[35]。海洋病原細菌的抗生素耐藥性問題已成為從海洋環境中尋找新型抗菌化合物的重要驅動力。例如，ULFAH等[36]從紅海藻中分離出10種海洋放線菌并進行抗弧菌試驗，結果表明，5株放線菌對溶藻弧菌和副溶血性弧菌的最小抑菌濃度（MIC）在0.625～5.000"μg/μL之間；于偉偉等[10]從南海仙掌藻、蕨藻以及伴綿藻中分離出36株海洋放線菌，對歐文斯氏弧菌等10種海洋病原性細菌進行抑菌試驗，結果表明，36株放線菌均至少對1種病原細菌有抗菌活性，且部分放線菌的抗菌活性優于陽性對照卡那霉素。由此可見，海洋放線菌在弧菌等水產養殖病原細菌的防治中具有一定的應用潛力。

本研究分離獲得的海藻共附生放線菌對水產養殖病原細菌，包括無乳鏈球菌、溶藻弧菌、歐文氏弧菌、海豚鏈球菌和美人魚發光桿菌等均表現出抗菌活性，為防治這些致病菌提供了新的選擇，具有潛在的應用價值。

3.3""海藻共附生微生物次級代謝產物的研究進展與前景

自20世紀以來，很多學者開始關注海藻相關真菌的次級代謝產物，這些真菌能夠產生多種新穎且具有生物活性的次級代謝產物。近年來，海藻相關放線菌的次級代謝產物也逐漸受到關注，如分離自褐藻的鏈霉菌S."cyaneofuscatus"M-27能夠產生抗腫瘤的化合物daunomycin和cosmo m ycin"B，抗真菌的大環內酯類化合物maltophilin和聚酮類化合物germicidins"A、B[37]；S."carnosus"M-40能產生具有抗炎、抗癆作用的lobophorine"B和聚酮類化合物galtamycin"B[37]；S."sundarbansensis"WR1L1S8能夠產生抗細菌活性的phaec hro mycins"B、C、E和1個新的聚酮化合物，其中新化合物對MRSA的MIC為6"μmol/L[38]；馬尾藻共附生放線菌Nocardiopsis"sp."AS23C能夠產生一個新的酚酸衍生物4-amino-6-methylsalicylic"acid，該物質具有較強的抗細菌活性[39]；小單孢菌（Micromonospora"sp.）CNY-010能夠產生大環內脂新霉素B[39]。這些研究表明，海藻共附生微生物及其代謝產物在醫藥和農業等領域具有較好的應用前景。

本研究在抑菌活性試驗中發現羽毛藻中分離獲得的放線菌至少對1種供試病原細菌表現出抑制作用，并且對水產病原細菌歐文斯氏弧菌和無乳鏈球菌表現出較好的抑菌活性。對其中次級代謝產物豐富的菌株HZ057進行全基因組測序和次級代謝產物生物合成基因簇分析，發現該菌株的次級代謝產物生物合成基因簇中與已報道的去鐵胺、germicidin以及保羅霉素等具有抗菌、抗腫瘤、抗癌、免疫抑制活性分子的生物合成基因簇類似，菌株HZ057可能產生類似結構的次級代謝產物從而發揮抗菌活性；此外，HZ075基因組中也有與已知代謝物生物合成基因簇相似性低或未預測到的基因簇，存在產生新穎結構次級代謝產物的可能。因此，進一步深入研究該菌株的次級代謝產物，有望發現具有重要生物活性的新型次級代謝產物，在水產病害防治上具有應用前景，為海洋藥物或生物防治菌劑的研發提供新資源。

參考文獻

[1]"WANG"J"J，"BEUSEN"A"H"W，"LIU"X"C，"BOUWMAN"A"F."Aquaculture"production"is"a"large，"spatially"concentrated"source"of"nutrients"in"Chinese"freshwater"and"coastal"seas[J]."Environmentnal"Science"Technology，"2020，"54（3）："1464-1474.

[2]"FLORES"KOSSACK"C，"MONTERO"R，"KOLLNER"B，"MAISEY"K."Chilean"aquaculture"and"the"new"challenges："pathogens，"immune"response，"vaccination"and"fish"diversification[J]."Fish"Shellfish"Immunology，"2019，"98："58-27.

[3]"郭志凱，"王蓉，"吳煒城，"黎明，"何汪桂，"周石林."兩株海綿放線菌產生的抗菌活性產物研究[J]."深圳大學學報（理工版），"2022，"39（5）："550-558.GUO"Z"K，"WANG"R，"WU"W"C，"LI"M，"HE"W"G，"ZHOU"S"L."Bioactive"secondary"metabolites"from"two"sponge-derived"actinomycetes[J]."Journal"of"Shenzhen"University"Science"and"Engineering，"2022，"39（5）："550-558."（in"Chinese）

[4]"KATZ"L，"BALTZ"R"H."Natural"product"discovery："past，"present，"and"future[J]."Journal"of"Industrial"Microbiology"Biotechnology，"2016，"43（2/3）："155-176.

• 王成，"張國建，"劉文典，"楊新雨，"朱妮，"申靜敏，"王志成，"劉楊，"程珊，"于廣利，"管華詩."海洋藥物研究開發進展[J]."中國海洋藥物，"2019，"38（6）："35-69.WANG"C，"ZHANG"G"J，"LIU"W"D，"YANG"X"Y，"ZHU"N，"SHEN"J"M，"WANG"Z"C，"LIU"Y，"CHENG"S，"YU"G"L，"GUAN"H"S."Recent"progress"in"research"and"development"of"marine"drugs[J]."Chinese"Journal"of"Marine"Drugs，"2019，"38（6）："35-69."（in"Chinese）
• SHARMA"S，"RANI"V，"SAINI"R，"VERMA"M"L."Bioprospe cti ng"and"biotechnological"applications"of"microbial"endophytes[J]."Microorganisms"for"Sustainability，"2020，"54："191-"228.
• XIONG"Z"J，"WANG"R，"XIA"T"F，"MA"S，"GUO"Z"K."Natural"products"and"activity"from"actinomycetes"associated"with"marine"algae[J]."Molecules，"2023，"28（13）："5138.

[8]"SELVIN"J，"NINAWE"A"S，"SEGHAL"KIRAN"G，"LIPTON"A"P."Sponge"microbial"interactions："ecological"implications"and"bioprospecting"avenues[J]."Critical"Reviews"in"Microbiology，"2010，"36（1）："82-90.

[9]"RENGASAMY"K"R，"MAHOMOODALLY"M"F，"AUME ER UDDY"M"Z，"ZENGIN"G，"XIAO"J，"KIM"D"H."Bioactive"compounds"in"seaweeds："annbsp;overview"of"their"biological"properties"and"safety[J]."Food"and"Chemical"Toxicology，"2020，"135："111013.

[10]"于偉偉，"唐賢明，"熊子君，"張世清，"王蓉，"曾曉起，"郭志凱."西沙海藻共附生放線菌的分離鑒定及其抗菌活性評價[J]."微生物學報，"2023，"63（4）："1472-1489.YU"W"W，"TANG"X"M，"XIONG"Z"J，"ZHANG"S"Q，"WANG"R，"ZENG"X"Q，"GUO"Z"K."Isolation"and"antimicrobial"bioactivity"of"algae-associated"actinomycetes"from"Xisha"islands[J]."Acta"Microbiologica"Sinica，"2023，"63（4）："1472-1489."（in"Chinese）

[11]"顏禎陽，"李曉，"王遠強，"羅明和."海洋放線菌Streptomyces"sp.11695次生代謝產物的研究[J]."天然產物研究與開發，"2024，"12（5）："1-9.YAN"Z"Y，"LI"X，"WANG"Y"Q，"LUO"M"H."Secondary"metabolites"of"marine-derived"Streptomyces"sp."11695[J]."Natural"Products"Research"and"Development，"2024，"12（5）："1-9."（in"Chinese）

[12]"BLUNT"J"W，"COPP"B"R，"HU"W"P，"MUNRO"M"H"G，"NORTHCOTE"P"T，"PRINSEP"M"R."Marine"natural"products[J]."Natural"Product"Reports，"2008，"25（1）："35-94.

[13]"PORTILL"CLARK"G，"CASILLAS"HERNANDEZ"R，"SERVIN"VILLEGAS"R，"MAGALLON"BARAJAS"F"G."Growth"and"survival"of"the"juvenile"yellowleg"shrimp"Farfantepenaeus"californiensis"cohabiting"with"the"green"feather"alga"Caulerpa"sertularioides"at"different"temperatures[J]."Aquaculture"Research，"2012，"44（1）："22-30.

[14]"LIMA"P"C"W"D"C，"TORRES"V"M，"RODRIGUES"J"A"G，"LOBO"W"R."Effect"of"sulfated"polysaccharides"from"the"marine"brown"alga"Spatoglossum"schroederi"in"Litopenaeus"vannamei"juveniles[J]."Revista"Ciencia"Agronomica，"2009，"40（1）："79-85.

[15]"陳健鑫，"魏玉倩，"劉麗，"張東華，"馬煥成，"伍建榕."云南油茶炭疽病菌的鑒定及生防菌篩選[J]."華南農業大學學報，"2022，"43（5）："43-53.CHEN"J"X，"WEI"Y"Q，"LIU"L，"ZHANG"D"H，"MA"H"C，"WU"J"R."Identification"of"Colletotrichum"gloeosporioides"and"screening"of"biocontrol"bacteria"in"Yunnan[J]."Journal"of"South"China"Agricultural"University，"2022，"43（5）："43-53."（in"Chinese）

[16]"LIU"Z，"ZHANG"Y，"SUN"J，"HUANG"W"C，"XUE"C"H，"MAO"X"Z."A"novel"soluble"squalene-hopene"cyclase"and"its"application"in"efficient"synthesis"of"hopene[J]."Front"Bioeng"Biotechnol，"2020，"8："426.

[17]"SHAO"M，"MA"J，"LI"Q，"JU"J."Identification"of"the"anti-infe ctive"aborycin"biosynthetic"gene"cluster"from"deep-sea-deri ved"Streptomyces"sp."SCSIO"ZS0098"enables"production"in"a"heterologous"host[J]."Marine"Drugs，"2019，"17（2）："127-127.

[18]"劉東旭，"劉向陽，"鄧子新，"蔣明."醌那霉素生物合成基因簇中alp2F和alp2G基因的功能表征[J]."基因組學與應用生物學，"2019，"38（11）："5037-5044.LIU"D"X，"LIU"X"Y，"DENG"Z"X，"JIANG"M."Functional"characterization"of"alp2F"and"alp2G"genes"in"the"kinamycin"biosynthetic"gene"cluster[J]."Genomics"and"Applied"Biology，"2019，"38（11）："5037-5044."（in"Chinese）

[19]"FENG"Y，"QIU"M，"SHAO"L，"JIANG"Y，"ZHANG"W，"XIN"F，"JIANG"M."Strategies"for"the"biological"production"of"ectoine"by"using"different"chassis"strains[J]."Biotechnol"Advances，"2024，"70："108306.

[20]"ZHENG"D，"WILEN"B"R，"OBERG"O，"WIK"T，"MODIN"O."Metagenomics"reveal"the"potential"for"geosmin"and"2-meth ylis oborneol"production"across"multiple"bacterial"phyla"in"recirculating"aquaculture"systems[J]."Environmental"Microbiology，"2024，"26（10）："16696-16714.

[21]"CODD"R，"RICHARDSON"SANCHEZ"T，"TELFER"T"J，"GOT SBACHER"M"P."Advances"in"the"chemical"biology"of"desferrioxamine"B[J]."ACS"Chemical"Biology，"2018，"13（1）："11-25.

[22]"GUO"L，"LI"W，"GU"Z，"WANG"L，"GUO"L，"MA"S，"LI"C，"SUN"J，"HAN"B，"CHANG"J."Recent"advances"and"progress"on"melanin："from"source"to"application[J]."International"Journal"of"Molecular"Sciences，"2023，"24（5）："4360-4386.

[23]"ZHANG"H，"WANG"Q，"NING"X，"HUANG"H，"MA"J，"YANG"X，"LU"X，"ZHANG"J，"LI"Y，"NIU"C."Synthesis"and"biological"evaluations"of"a"series"of"thaxtomin"analogues[J]."Journal"of"Agricultural"and"Food"Chemistry，"2015，"63（14）："3734-3741.

[24]"唐越，"王敏，"丁勇，"李金娥，"陳義華."通過保羅酸的加成提高保羅霉素的穩定性[J]."有機化學，"2018，"38（9）："2420-"2445.TANG"Y，"WANG"M，"DING"Y，"LI"J"E，"CHEN"Y"H."Improvement"of"paulomycin"stability"by"addition"of"paulic"acid[J]."Chines"Journal"of"Organic"Chemistry，"2018，"38（9）："2420-"2445."（in"Chinese）

[25]"ARKADEEP"S，"SILVIA"P"S，"TANU"ADHIKARI"N，"SHORT"K"A，"NIRAULA"N"P."The"complete"genomic"sequence"of"Streptomyces"spectabilis"NRRL-2792"and"identification"of"secondary"metabolite"biosynthetic"gene"clusters[J]."Journal"of"Industrial"and"Biotechnology，"2019，"46（8）："1217-"1223.

[26]"HORBAL"L，"STIERHOF"M，"PALUSCZAK"A，"ECKERT"N，"ZAPP"J，"LUZHETSKYY"A."Cyclofaulknamycin"with"the"rare"amino"acid"D-capreomycidine"isolated"from"a"well-cha rac terized"Streptomyces"albus"strain[J]."Microorganisms，"2021，"9（8）："1609-1623.

[27]"劉靜，"徐幼橋，"張春花，"夏卓璐，"王志祥，"黃德春，"江峰."吩嗪及其類似物抗腫瘤活性研究進展[J]."藥學進展，"2022，"46（9）："710-722.LIU"J，"XU"Y"Q，"ZHANG"C"H，"XIA"Z"L，"WANG"Z"X，"HUANG"D"C，"JIANG"F."Progress"of"research"on"anti-tumor"activity"of"phenazine"and"its"analogues[J]."Progress"in"Pharmaceutical"Science，"2022，"46（9）："710-722."（in"Chinese）

[28]"鄭勝藍，"李宗顯，"朱運平."藍色化合物榴菌素及其類似物的研究現狀[J]."中國食品學報，"2022，"22（5）："399-411.ZHENG"S"L，"LI"Z"X，"ZHU"Y"P."Research"status"of"blue"pigment"granaticin"and"its"analogues[J]."Journal"of"Chinese"Institute"of"Food"Science"and"Technology，"2022，"22（5）："399-411."（in"Chinese）

[29]"CHEN"Y，"ZHOU"Y，"CHEN"M，"XIE"B，"YANG"J，"CHEN"J，"SUN"Z."Isorenieratene"interaction"with"human"serum"albumin："multi-spectroscopic"analyses"and"docking"simulation[J]."Food"Chemistry，"2018，"258："393-399.

[30]"MOLL"L"V，"SMET"J"D，"COS"P，"CAMPENHOUT"L"V."Microbial"symbionts"of"insects"as"a"source"of"new"antimicrobials："a"review[J]."Critical"Reviews"in"Microbiology，"2021，"47（5）："562-579.

[31]"HEERDEN"A"V，"PHAM"N"Q，"WINGFIELD"B"D，"WIN GF IE LD"M"J，"WIKEN"P"M."Six"type-I"PKS"classes"and"highly"conserved"melanin"and"elsinochrome"gene"clusters"found"in"diverse"Elsinoe"species[J]."BMC"Genomics，"2024，"25（1）："990-1001.

[32]"PALMER"J"M，"WIEMANN"P，"GRECO"C，"CHIANG"Y"M，"WANG"C"C"C，"LINDNER"D"L，"KELLER"N"P."The"sexual"spore"pigment"asperthecin"is"required"for"normal"ascospore"production"and"protection"from"UV"light"in"Aspergillus"nidulans[J]."Journal"of"Industrial"Microbiology"and"Biotechnology，"2021，"48（9/10）："55-64.

[33]"孫曉夢."海藻可培養附生細菌多樣性分析及多相分類學研究[D]."濟南："山東師范大學，"2021.SUN"X"M."Diversity"and"polyphasic"taxonomy"of"epiphytic"bacteria"isolated"from"macroalgae[D]."Jinan："Shandong"Normal"University，"2021."（in"Chinese）

[34]"秦蕾，"王印庚，"閻斌倫."大菱鲆微生物性疾病研究進展[J]."水產科學，"2008，"27（11）："598-602.QIN"L，"WANG"Y"G，"YAN"B"L."Advances"in"research"on"diseases"of"turbot"Scophthalmus"maximus"affected"by"microorganisms[J]."Fisheries"Science，"2008，"27（11）："598-602."（in"Chinese）

[35]"張德鋒，"袁偉，"可小麗，"劉志剛，"曹建萌，"盧邁新，"王淼，"衣萌萌."中國羅非魚主養區無乳鏈球菌的分子流行特征及其傳播方式[J]."中國水產科學，"2017，"24（3）："606-614.ZHANG"D"F，"YUAN"W，"KE"X"L，"LIU"Z"G，"CAO"J"M，"LU"M"X，"WANG"M，"YI"M"M."Molecular"characteristics"and"transmission"of"Streptococcus"agalactiae"in"a"major"tilapia"culturing"area"of"China[J]."Journal"of"Fishery"Sciences"of"China，"2017，"24（3）："606-614."（in"Chinese）

[36]"ULFAH"M，"KASANAH"N，"WIJAYANTI"N."Antivibriosis"and"cytotoxicity"of"Actinobacteria"associated"with"red"seaweed"Gelidiella"acerosa[J]."Aquaculture"Research，"2021，"52（12）："6786-6794

[37]"DJINNN"I，"DEFANT"A，"KECHA"M，"MANCINI"I."Antibacterial"polyketides"from"the"marine"alga-derived"endophitic"Streptomyces"sundarbansensis："a"study"on"hydroxypyrone"tautomerism[J]."Marine"Drugs，"2013，"11（1）："124-135.

[38]"ELIWAl"E"M，"ABDEL"RAZEK"A"S，"FRESE"M，"HALAWA"A"H，"EI"AGRODY"A"M，"BEDAIR"A"H，"SEWALD"N，"SHAABAN"M."New"naturally"occurring"phenolic"derivatives"from"marine"Nocardiopsis"sp."AS23C："structural"elucidationnbsp;and"in"silico"computational"studies[J]."Vietnam"Journal"of"Chemistry，"2019，"57（2）："164-174.

[39]"KIM"M"C，"MACHADO"H，"JANG"K"H，"TRZOSS"L，"JENSEN"P"R，"FENICAL"W."Integration"of"gen"omic"data"with"NMR"analysis"enables"assignment"of"the"full"stereostructure"of"neaumycin"B，"a"potent"inhibitor"of"glioblastoma"from"a"marine-derived"Micromonospora[J]."Journal"of"the"American"Chemical"Society，"2018，"140（34）："10775-10784.