水稻干尖線蟲(chóng)海藻糖6-磷酸合成酶基因雙鏈RNA細(xì)菌表達(dá)體系構(gòu)建

關(guān)鍵詞：水稻干尖線蟲(chóng)；海藻糖-6磷酸合成酶基因；雙鏈RNA；RNA干擾中圖分類號(hào)： S435.114⁺8 （204號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-4440（2025）05-0867-08

Abstract： Exogenous double-stranded RNA （dsRNA）can affct the gene expression of plant nematodes through RNAinterference（RNAi）to achieve the purpose ofpest control. The use of bacterial expression system for dsRNA preparation has high production efficiency and low cost， whichis the preferred strategy forlarge-scale preparation of dsRNA.Inorder toexplore theroleofbacterial dsRNA expression based on RNAi technology in the control of Aph 1 elechoidesbesseyi，in thisstudy，the trehalose-6-phosphate synthase genes AbTPS1 and AbTPS2of Aphelechoidesbes

seyi wereusedastarget genes to designand constructbacterial expressiondouble-strandedRNA（dsAbTPS1 and dsAbTPS2）vectorsandtransform Escherichiacoli HTi15（DE3）.Theinduction expresionconditionsand extractionmethodsof dsRNA wereoptimized，andthe silencing eficiencyof dsRNA expressedbybacteriaontarget genes wasdetermined byfluorescence quantitative PCR，and the control effct of dsRNAonAphelenchoides beseyi was evaluated.The results showed that when the concentration of isopropyl ?β D -thiogalactoside（IPTG）was O.5 mmol/L and the induction time was 6 h ，thedsRNA yieldofthe AbTPS -L4440 expression vector HT115 strain constructed in this study reached the maximum. TheyieldofdsRNA extractedfromtheexpresionstrainsusing Trizolmethodandformamide method was significantlyhigher thanthatobtainedusing ethanol-sodiumchloride method.After treating Aphelenchoidesbeseyi with dsAbTPS1 and dsAbTPS2，the expresion levels of target genes AbTPS1and AbTPS2 were down-regulated.The survival rate of Aphelenchoidesbesseyi underlow temperature of 4 C ，high temperature of 40 ΔC and dehydration and drying conditions was significantlylowerthan thatinM9buffertreatmentanddsGFP treatment.Inthisstudy，thebacterialdsRNAexpresionsystem targeting AbTPS1 and AbTPS2 of A . besseyi was successfully constructed，and the obtained dsRNA exhibited obvious RNAi effects，which provided technical support for the use of RNA-based pesticides to control A .besseyi.

Key Words：Aphelenchoides besseyi； trehalose-6-phosphate synthase genes；double stranded RNA；RNA interferen

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種進(jìn)化上保守的序列特異機(jī)制，能調(diào)控大部分真核生物基因表達(dá)。一般而言，內(nèi)源或外源雙鏈RNA（dsR-NA）被加工成 18～30nt 的小RNA，包括小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）。這些小RNA可識(shí)別互補(bǔ)的mRNA或DNA，通過(guò)切割mRNA和抑制翻譯、DNA甲基化和染色質(zhì)修飾等，在轉(zhuǎn)錄時(shí)或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)[1]。由于dsRNA具有低毒、環(huán)境友好以及容易設(shè)計(jì)等特點(diǎn)，因此，基于RNAi技術(shù)，利用dsRNA進(jìn)行植物病蟲(chóng)害防治得到越來(lái)越多的關(guān)注[2]

大量高效制備dsRNA或小RNA是RNAi防治策略得到應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。基于細(xì)菌體系生產(chǎn)dsRNA，制備簡(jiǎn)便且成本低廉，是dsRNA規(guī)模化制備的優(yōu)選策略。目前的研究中通常將靶標(biāo)基因序列構(gòu)建進(jìn)入RNAi載體，轉(zhuǎn)化至中性、共生或有益細(xì)菌，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，提取發(fā)酵產(chǎn)物中的dsRNA，從而實(shí)現(xiàn)dsRNA的量產(chǎn)[2-3]。當(dāng)前應(yīng)用較多的細(xì)菌表達(dá)體系是大腸桿菌HT115（DE3）[4-6]。HT115（DE3）菌株缺乏核酸內(nèi)切酶RNAaseI基因，從而避免細(xì)胞產(chǎn)生的dsRNA降解。此外，HT115（DE3）菌株在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)下可產(chǎn)生T7聚合酶，因此通過(guò)構(gòu)建帶有T7啟動(dòng)子的RNAi載體（如L4440 等）可實(shí)現(xiàn)dsRNA的大量合成[3，7]但目前有關(guān)發(fā)酵條件及提取方法對(duì)細(xì)菌體系dsRNA產(chǎn)量的影響研究較少。

水稻干尖線蟲(chóng)（Aphelenchoidesbesseyi）是水稻重要病原線蟲(chóng)之一，被列入世界十大植物病原線蟲(chóng)名單[8]。干尖線蟲(chóng)為害水稻時(shí)，水稻植株常出現(xiàn)劍葉葉尖干枯或小穗頭等癥狀，導(dǎo)致穗長(zhǎng)縮短、穗粒數(shù)減少以及稻米品質(zhì)變差，對(duì)水稻安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[9]。水稻干尖線蟲(chóng)是典型的外寄生線蟲(chóng)，主要為害水稻地上部分生組織，在孕穗期進(jìn)入穎花，隨著種子成熟停正取食，藏匿米粒和穎殼之間進(jìn)入脫水休眠狀態(tài)，并依賴種子實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播[10]。基于上述寄生特點(diǎn)，水稻干尖線蟲(chóng)能適應(yīng)高溫、干燥、高滲透等多種逆境脅迫。

隨著分子生物學(xué)研究的深入，作物響應(yīng)逆境脅迫的海藻糖-6磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphatesynthase，TPS）基因等相繼被克隆和分析[10-11]。海藻糖是生物體的血糖，經(jīng)水解為生物體提供能量，而TPS是昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)及病原菌海藻糖合成途徑中的關(guān)鍵酶，廣泛參與微生物的生長(zhǎng)發(fā)育、侵染寄生及其對(duì)逆境脅迫響應(yīng)與適應(yīng)等過(guò)程[12]。RdTPS1基因?qū)润迹≧hyzoperthadominica）適應(yīng)熱逆境至關(guān)重要，通過(guò)dsRNA處理能顯著降低谷蠹體內(nèi)海藻糖水平及其在高溫脅迫下的存活率[13]。水稻褐飛虱（Nilapa-rvatalugens）TPS基因在不同發(fā)育階段差異化表達(dá)，基于RNAi技術(shù)可抑制TPS3基因的表達(dá)水平，進(jìn)而造成褐飛虱蛻皮障礙和翅發(fā)育畸形[14]。水稻稻瘟病病原菌（Maganaphortheoryzae）MoTPS1基因還可調(diào)控病原菌的侵染和致病性[15]。Chen 等[11]鑒定了2個(gè)水稻干尖線蟲(chóng)TPS基因（AbTPS1和AbTPS2），體外合成dsRNA證實(shí)這2個(gè)基因?qū)€蟲(chóng)在低氧脅迫逆境中的存活和代謝非常重要，并有望成為水稻干尖線蟲(chóng)防治的靶標(biāo)。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建攜帶AbTPS基因的RNAi載體，利用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌HT115（DE3）表達(dá)制備dsRNA，并評(píng)估其應(yīng)用效果，為基于RNAi策略防治水稻干尖線蟲(chóng)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1 線蟲(chóng)準(zhǔn)備

本研究所采用水稻干尖線蟲(chóng)種群最初分離自江蘇省發(fā)病水稻病穗，后在灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）平板上擴(kuò)繁培養(yǎng)。用無(wú)菌水洗脫平板進(jìn)行線蟲(chóng)收集，并用含 100μg/mL 氨芐青霉素 、50μg/mL 卡那霉素和 100μg/mL 兩性霉素的消毒液對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行消毒[16]。

2 線蟲(chóng)RNA提取和cDNA合成

收集活性良好的線蟲(chóng)，液氮速凍后迅速研磨成粉，加入 1mL Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行線蟲(chóng)RNA提取。利用2% 瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific 公司產(chǎn)品）的 OD₂₆₀/OD₂₈₀ （ 260nm 和 280nm 的吸光度比值）進(jìn)行RNA質(zhì)量和產(chǎn)量評(píng)估。采用TransScript uni one-step gDNA re-movalandcDNAsynthesissuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）進(jìn)行cDNA合成。

3 靶標(biāo)片段擴(kuò)增

將水稻干尖線蟲(chóng)海藻糖-6磷酸合成酶基因cD-NA序列（AbTPS1：NCBI登錄號(hào)KY661388;AbTPS2：NCBI登錄號(hào)KY661389）上傳 siRNA target finder網(wǎng)站（https：//www. genscript. com/tools/sirna-target-find-er），設(shè)置水稻干尖線蟲(chóng)（A.besseyi）為靶標(biāo)物種，含有4個(gè)及以上潛在siRNA的序列進(jìn)行靶標(biāo)序列分析。采用Primer3 plus 網(wǎng)站（http：//www.primer3plus.com/）設(shè)計(jì)引物，并用PrimerBlast網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行特異性檢驗(yàn)后，委托生工（上海）生物工程股份有限公司進(jìn)行引物合成。分別以引物AbTPS1-F/AbTPS1-R和AbTPS2-F/AbTPS2-R擴(kuò)增AbTPS1和AbTPS2序列片段，并連接至pMD20-T載體，測(cè)序正確的重組轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，用于后續(xù)研究。本研究所用引物序列見(jiàn)表1。

4重組表達(dá)菌株構(gòu)建

根據(jù)RNAi載體L4440多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)含載體接頭序列的引物，以方法3測(cè)序正確的重組質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增TPS序列，并以pCambia1304載體DNA為模板PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白（GFP）片段。PCR反應(yīng)體系 50μL;2×1 PhantaMasterMix（諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品）25μL 上下游引物（ 10μmol/L， 各 2μL 、質(zhì)粒模板（10ng）2μL，ddH，0 19μL. 。反應(yīng)程序如下： 95^°C 預(yù)變性3m i n ; 9 5 變性 15s，58‰ 退火 15s，72‰ 延伸45s，32個(gè)循環(huán)； 72°C 補(bǔ)充延伸 5min 。采用ClonExpress I one stepcloningkit（諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品）將靶標(biāo)片段連接至HindIl和SmaI雙酶切的L4440載體，并轉(zhuǎn)化至RNaseII缺陷型大腸桿菌（Escherichiacoli）HT115（DE3）菌株，測(cè)序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

5靶標(biāo)dsRNA細(xì)菌表達(dá)的誘導(dǎo)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

將含有AbTPS1-L4440重組質(zhì)粒的 E coliHT115（DE3）轉(zhuǎn)化子菌液按體積比 1：1 000 添加至含氨芐青霉素 100.0μg/mL 、四環(huán)素 12.5μg/mL 的LB 液體培養(yǎng)基， 180r/min 37 9C 振蕩培養(yǎng) ^16h 。吸取 0.2mL 培養(yǎng)菌液加到 20mL 含上述抗生素的LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（ OD₆₀₀=0.4^? ，加入IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，上海SigmaAldrich公司產(chǎn)品）進(jìn)行誘導(dǎo)。為明確靶標(biāo)dsRNA細(xì)菌表達(dá)的適宜誘導(dǎo)條件，本研究設(shè)置 0μmol/mL 0.1μmol/mL，0.5μmol/mL 和 0μmol/mLlt; 4個(gè)IPTG濃度，分別振蕩誘導(dǎo) ^4h ，測(cè)定不同IPTG濃度下的dsRNA產(chǎn)量，以明確適宜的IPTG誘導(dǎo)濃度。并在 0.5μmol/mL 的IPTG濃度下，分別振蕩誘導(dǎo)2h，4h，6h，8h 和 ^10h ，測(cè)定不同誘導(dǎo)時(shí)間下的dsR-NA產(chǎn)量以確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

6 細(xì)菌表達(dá)dsRNA提取

取IPTG誘導(dǎo)的新鮮菌液 離心收集菌體沉淀，加入 1mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，提取細(xì)菌RNA，提取方法同方法2。為大量制備dsRNA、降低生產(chǎn)成本，進(jìn)一步分別采用甲酰胺法和乙醇-氯化鈉（EtOH-NaCl）法提取RNA。甲酰胺法提取RNA的方法如下：在 10.0mL 菌液沉淀中加入 0mL 含98.0% 甲酰胺、 0.2% 巰基乙醇、 0.1% 十二烷基硫酸鈉、0.5mol/L乙二胺四乙酸的提取緩沖液，渦旋后置于 60.0^qC 水浴 20min 使菌體充分裂解，離心收集上清液，并通過(guò)異丙醇-乙醇法純化RNA[17-18]乙醇-氯化鈉（EtOH-NaCl）法提取RNA的方法如下：10mL 菌液 80^°C 孵育 20min ，離心收集菌體沉淀，依次用 75% 乙醇（ 1×PBS 緩沖液配制）和150μmol/mLNaCl 重懸菌體沉淀，離心收集上清液，得到 RNA 粗提液[19]。使用 T7 RNAi transcription kit（諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品）處理RNA，每 20μL RNA粗提液加入 1μL 質(zhì)量濃度為2ng/μL 的DNaseI和1個(gè)單位RNaseA，于 37^°C 孵育30min 以消化殘留單鏈RNA和DNA。上述方法提取的RNA均通過(guò) 5% 瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000分光光度計(jì)測(cè)定dsRNA質(zhì)量和產(chǎn)量。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

7 RNA干擾

將2000條線蟲(chóng)分別浸泡于 1×M9 緩沖液、1μg/μL 的AbTPS1基因dsRNA、 的AbTPS2基因dsRNA 和 1μg/μL 的GFP基因dsRNA中，25C 避光處理 24h ，通過(guò)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)AbTPS1和AbTPS2基因沉默效率。采用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品）進(jìn)行cDNA模板制備，通過(guò)SYBRGreenPremixProTaqHS試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品）在LightCycler96PCR平臺(tái)（德國(guó)Roche公司產(chǎn)品）進(jìn)行qPCR分析。以水稻干尖線蟲(chóng)18SrDNA為內(nèi)參基因，分別以特異性引物qAbTPS1-F/qAbTPS1-R和qAbTPS2-F/qAbTPS2-R檢測(cè) AbTPS1和AbTPS2的相對(duì)表達(dá)水平。相對(duì)基因表達(dá)水平通過(guò) 2^-ΔΔct 法計(jì)算[20]。為檢測(cè)靶標(biāo)基因沉默后水稻干尖線蟲(chóng)對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力，按照文獻(xiàn)[21]的方法，對(duì)RNA干擾后的水稻干尖線蟲(chóng)分別進(jìn)行 4^°C 低溫 40‰ 高溫和常溫干燥脫水處理，每處理100條線蟲(chóng)， ^48h 后將蟲(chóng)體轉(zhuǎn)移至室溫?zé)o菌水中，在體視顯微鏡下觀察線蟲(chóng)活性，以線蟲(chóng)蟲(chóng)體僵直或呈“C”形彎曲、針觸無(wú)反應(yīng)為依據(jù)判定線蟲(chóng)是否死亡，并統(tǒng)計(jì)存活率[22]

2 結(jié)果與分析

2.1TPS靶標(biāo)序列的擴(kuò)增和雙鏈RNA制備

利用L4440載體在E.coliHT115中表達(dá)產(chǎn)生靶標(biāo)dsRNA的流程見(jiàn)圖1A。基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中AbTPS1和AbTPS2cDNA序列設(shè)計(jì)的特異引物，PCR擴(kuò)增分別獲得 358bp 和 329bp 片段條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證其序列與預(yù)期一致。采用同源重組法分別將獲得的AbTPS1和AbTPS2構(gòu)建至L4440載體，并轉(zhuǎn)化至HT115菌株，待細(xì)菌生長(zhǎng)至指數(shù)期加IPTG誘導(dǎo)后可見(jiàn)目標(biāo)條帶。當(dāng)用RNaseA和DNaseI消化單鏈

RNA和DNA后，dsRNA條帶清晰可見(jiàn)（圖1B）。

A：RNAi載體構(gòu)建及細(xì)菌表達(dá)dsRNA體系流程圖;B：細(xì)菌表達(dá)靶標(biāo)基因dsRNA電泳檢測(cè)。 Ψ_M ：DNA分子標(biāo)尺；1：細(xì)菌表達(dá)含dsAbTPS1的總產(chǎn)物；2：細(xì)菌表達(dá)含dsAbTPS2的總產(chǎn)物;3：經(jīng)RNaseA和DNaseI消化后的dsAbTPS1;4：經(jīng)RNaseA和DNaseI消化后的dsAbTPS2。

2.2 dsRNA誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

以AbTPS1為測(cè)試對(duì)象，不同IPTG誘導(dǎo)濃度和時(shí)間下，細(xì)菌表達(dá)載體產(chǎn)生dsRNA質(zhì)量濃度的變化如圖2所示。從圖中可以看出，隨著IPTG濃度的增加，dsRNA質(zhì)量濃度呈先增后減的趨勢(shì)，0μmol/mL， 0.1μmol/mL， 0.5μmol/mL 及0μmol/mL IPTG誘導(dǎo)濃度下，細(xì)菌表達(dá)載體產(chǎn)生的dsRNA質(zhì)量濃度分別為 2.13μg/mL，3.11μg/mL

13.45μg/mL 及 10.67μg/mL ，即細(xì)菌表達(dá)載體產(chǎn)生dsRNA的適宜IPTG 濃度為 0.5μmol/mL （圖2A）。當(dāng)IPTG 濃度為 0.5μmol/mL 時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，細(xì)菌表達(dá)載體產(chǎn)生的dsRNA質(zhì)量濃度亦呈先增加后減少趨勢(shì)，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間 6h 時(shí)，細(xì)菌表達(dá)載體產(chǎn)生的dsRNA質(zhì)量濃度達(dá)到最高（圖2B）。因此細(xì)菌表達(dá)載體產(chǎn)生dsRNA的適宜IPTG濃度為0.5μmol/mL ，誘導(dǎo)時(shí)間為 6h 。

2.3不同提取方法對(duì)dsRNA質(zhì)量濃度的影響基于上述最優(yōu)dsRNA誘導(dǎo)條件，分別采用Trizol法、甲酰胺法及乙醇-NaCI法提取細(xì)菌總RNA，并經(jīng)DNaseI和RNaseA對(duì)DNA和單鏈RNA消除后，不同提取方法得到的電泳圖和dsRNA質(zhì)量濃度如圖3所示。從圖中可以看出，Trizol法、甲酰胺法及乙醇-NaCl法均可獲得單一條帶（圖3A）;采用Trizol法或甲酰胺法提取獲得的dsRNA質(zhì)量濃度顯著高于乙醇-NaCl法，而Trizol法和甲酰胺法得到的dsRNA質(zhì)量濃度無(wú)顯著差異（圖3B）。由于甲酰胺法提取dsR-NA所需的成本更低，所以從大量生產(chǎn)dsRNA的角度，使用甲酰胺法提取dsRNA是合適的。

A：Trizol法、甲酰胺法及乙醇-氯化鈉法提取細(xì)菌總RNA，并經(jīng)RNaseA和DNaseI消化后的電泳圖； M：DNA 分子標(biāo)尺；1、2、3分別表示 Tr-izol法、甲酰胺法及乙醇-NaCI法提取的細(xì)菌總RNA電泳圖。B：Trizol法、甲酰胺法及乙醇 ?NaCI 法提取得到的dsRNA質(zhì)量濃度。ns、 ^** 分別表示處理間差異不顯著和差異極顯著（ Plt;0.01 ）。

2.4 RNAi效果評(píng)價(jià)

用細(xì)菌表達(dá)的dsAbTPS1和dsAbTPS2浸泡線蟲(chóng)24h ，對(duì)應(yīng)靶標(biāo)記基因AbTPS1和AbTPS2的表達(dá)水均低于M9緩沖液處理和dsGFP處理（圖4A、圖4B）。在常溫（ 25‰ ）、低溫（ 、高溫（ 40% ）及脫水干燥逆境中，M9緩沖液處理和dsGFP處理的線蟲(chóng)存活率均超過(guò) 94% ，而經(jīng)細(xì)菌表達(dá)的dsAbTPS1處理和dsATPS2處理的線蟲(chóng)在常溫（ 25°C ）下的存活率分別為 75.33% 和833% ，均顯著低于M9緩沖液處理和dsGFP處理。在低溫 （4^°C） 、高溫 （40^qC ）及脫水干燥逆境下，dsAbTPS1處理和dsAbTPS2處理的線蟲(chóng)存活率為39.67%～62.67% ，顯著低于M9緩沖液處理和dsGFP處理（表2）。

圖4dsRNA處理對(duì)水稻干尖線蟲(chóng)AbTPS1和AbTPS2靶基因表達(dá)水平的影響

Fig.4Effetsofdouble-strandedRNA（dsRNA）treatmentontheexpresionlevelsofAbTSandAbTS2inApelenchodesbese

A：AbTPSI的相對(duì)表達(dá)水平;B：AbTPS2的相對(duì)表達(dá)水平。M9緩沖液、dsGFP、dsAbTPS1、dsAbTPS2分別利用 1×M9 緩沖液、 GFP 基因的dsRNA、AbTPS1基因的dsRNA、AbTPS2基因的dsRNA浸泡水稻干尖線蟲(chóng) 24h 處理。**、 分別表示處理間差異極顯著（ Plt;0.01 ）和差異顯著（ Plt;0.05） 1 表示處理間差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

目前，作物病蟲(chóng)害防治通常依賴化學(xué)藥劑、品種抗性或其他農(nóng)藝措施，但線蟲(chóng)病害防治缺乏有效技術(shù)手段或抗性資源[2]。基于RNAi技術(shù)，應(yīng)用dsR-

NA干擾線蟲(chóng)重要靶標(biāo)基因的表達(dá)水平，有效降低植物病原線蟲(chóng)環(huán)境適應(yīng)性，可達(dá)到殺蟲(chóng)防病的目的[23]。一般而言，體外dsRNA合成需要分別轉(zhuǎn)錄合成正義RNA和反義RNA序列，然后退火形成dsRNA片段，但該方法大多依賴商業(yè)化的試劑盒，成本高昂且流程復(fù)雜，不適用病蟲(chóng)害防治規(guī)模化應(yīng)用[24]。原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)dsRNA，因具備低成本、效率高等優(yōu)點(diǎn)，適合批量制備dsRNA[25]

轉(zhuǎn)化L4440RNAi載體的E.coliHT115誘導(dǎo)生產(chǎn)dsRNA的產(chǎn)量，取決于dsRNA序列及培養(yǎng)方法[3」。計(jì)慧君等[2構(gòu)建了褐飛虱蛋白激酶B雙鏈RNA（dsNIAKT）的原核表達(dá)體系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG工作濃度為 0.1μmol/mL 和 0.5μmol/mL ，細(xì)菌表達(dá)dsNIAKT水平顯著高于 0μmol/mL ，說(shuō)明低濃度IPTG有助于提高dsRNA產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明0.5μmol/mL IPTG濃度能誘導(dǎo)dsRNA的高表達(dá)，而 0.1μmol/mL 的IPTG不利于dsRNA的制備。同時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)菌表達(dá)載體表達(dá)的dsR-NA質(zhì)量濃度呈先增加后減少的趨勢(shì)，在誘導(dǎo) 6h 時(shí)，dsRNA質(zhì)量濃度達(dá)到最高，說(shuō)明 6h 是本細(xì)菌表達(dá)體系下的最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致[26]。Papic等[27]發(fā)現(xiàn)dsRNA的產(chǎn)生與表達(dá)細(xì)菌生物量密切相關(guān)，通過(guò)分批進(jìn)料增加菌體生物量的方式最高可產(chǎn)生 182mg/L dsRNA，這使得細(xì)菌表達(dá)dsRNA大規(guī)模制備成為可能，其制備成本也遠(yuǎn)低于體外試劑盒的制備方法。本研究以dsAbTPS1為對(duì)象進(jìn)行測(cè)試，優(yōu)化后的細(xì)菌表達(dá)體系最高可產(chǎn)生超過(guò) 15μg/mL 質(zhì)量濃度的dsRNA。本研究還比較了3種常用提取細(xì)菌RNA方法的效率，其中Trizol法和甲酰胺法提取RNA的質(zhì)量和效率優(yōu)于乙醇-氯化鈉法。Trizol試劑是RNA提取最常用試劑，但價(jià)格比較昂貴，且萃取過(guò)程常需要使用氯仿等有毒試劑。甲酰胺試劑成本低廉，提取操作簡(jiǎn)便，適合于細(xì)菌表達(dá)的dsRNA批量制備。

Chen等[1]研究結(jié)果表明，海藻糖合成酶基因AbTPS1和AbTPS2參與水稻干尖線蟲(chóng)對(duì)逆境的適應(yīng)過(guò)程，采用體外合成的dsRNA浸泡蟲(chóng)體能顯著降低AbTPS1和AbTPS2的轉(zhuǎn)錄豐度，并導(dǎo)致低氧脅迫下線蟲(chóng)死亡率增加。本研究利用細(xì)菌表達(dá)的dsAbTPS1和dsAbTPS2浸泡線蟲(chóng) 24h ，靶標(biāo)基因AbTPS1和AbTPS2的表達(dá)水平均顯著下降，線蟲(chóng)在低溫、高溫和干燥脫水逆境下的存活率均低于M9緩沖液處理和dsGTP處理。說(shuō)明AbTPS1和AbTPS2基因表達(dá)水平對(duì)水稻干尖線蟲(chóng)逆境生存能力有重要影響，通過(guò)細(xì)菌表達(dá)的dsRNA可有效降低AbTPS1和AbTPS2基因的表達(dá)水平，導(dǎo)致線蟲(chóng)在環(huán)境壓力下的死亡率提高。

綜上所述，本研究建立了水稻干尖線蟲(chóng)AbTPS基因的dsRNA細(xì)菌表達(dá)體系，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件和提取方法，可實(shí)現(xiàn)dsRNA的批量生產(chǎn)，為利用RNA農(nóng)藥防治水稻干尖線蟲(chóng)提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] PALLI SR.RNAi turns 25：contributions and challenges in insect science[J].Frontiersin Insect Science，2023，3：1209478.

[2] ZHAOJH，LIUQY，XIEZM，etal.Exploring thechallengesof RNAi-based strategies for crop protection[J].Advanced Biotechnology，2024，2（3）：23.

[3] HOUGH J，HOWARD JD，BROWN S，et al. Strategies for the production of dsRNA biocontrols as alternatives to chemical pesticides[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology，2022， 10：980592.

[4] TIMMONSL，COURTDL，F(xiàn)IREA.Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interferenceinCaenorhabditiselegans[J].Gene，2001，263（1/2）：103- 112.

[5] AHNSJ，DONAHUEK，KOHY，etal.Microbial-baseddoublestranded RNA production to develop cost-effective RNA interference application for insect pest management[J]. International Journal of Insect Science，2019，11：1179543319840323.

[6] LONGGJ，LIU XZ，GUO H，et al.Oral-based nanoparticlewrapped dsRNA delivery system：a promising approach for controllinganurban pest，Blattella germanica[J].Journal ofPest Science，2024，97（2）：739-755.

[7] 馬中正，閆碩，沈杰.基于工程菌高效合成靶向昆蟲(chóng)基因 的dsRNA的方法[J].應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2019，56（2）：342-347.

[8] JONESJT，HAEGEMANA，DANCHINEGJ，etal.Top10 plant-parasitic nematodesin molecularplantpathology[J].MolecularPlant Pathology，2013，14（9）：946-96

[9] LIN MS，DING XF，WANG ZM，et al. Description of Aphelenchoides besseyi from abnormal rice with‘small grains and erect panicles’symptominChina[J].RiceScience，2005，12（4）：289- 294.

［10]謝家廉，楊芳，黃文坤，等.近年水稻主要線蟲(chóng)病害的研究進(jìn) 展[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2017，44（6）：940-949.

[11]CHENQL，WANGF，LIDL，etal.Trehalose metabolismgenes renderricewhitetipnematodeAphelenchoidesbesseyi（Nematoda： Aphelenchoididae）resistant to an anaerobic environment[J]. Journal of Experimental Biology，2018，221（4）：jeb171413.

[12]YANGHJ，CUIMY，ZHAOXH，etal.Trehalose-6-phosphate synthase regulates chitin synthesis in Mythimna separata[J].Frontiers in Physiology，2023，14：110966

[13]XUE DR，YANGY，F(xiàn)ANGL W，et al.Trehalose 6-phosphate synthase gene rdtps1 contributes to thermal acclimation in RhyzoperthaDominica[J].BMC Genomics，2024，25（1）：172.

[14］唐斌，沈祺達(dá)，曾伯平，等.褐飛虱一個(gè)新的海藻糖合成酶基 因的特性、發(fā)育表達(dá)及RNAi效果分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019，52（3） ：466-477.

[15］蔣志洋，師東梅，陳怡彤，等.靶向稻瘟菌海藻糖-6-磷酸合成 酶——具有新穎殺菌機(jī)制的含異丙醇胺片段化合物的篩選與 發(fā)現(xiàn)［C]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì).中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2023年學(xué) 術(shù)年會(huì)論文集.北京：中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)，2023：617.

[16]FENGH，ZHOUDM，DALYP，etal.Characterization and functional importance of two glycoside hydrolase family16 genes from thericewhite tip nematodeAphelenchoidesbesseyi[J].Animals， 2021，11（2） ：374.

[17]ZHAOXL，LIY，DUANYK，et al.A simplemethodology for RNAisolation frombacteriabyintegrationof formamideextraction andchitosan-modified silicapurification[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2021，413（26）：6469-6477.

[18]常瑞，王俊，付開(kāi)贊，等.4種原核表達(dá)雙鏈RNA的dsRNA 提取方法效果評(píng)價(jià)[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，58（4）：700-71

[19]MAZZ，ZHOUH，WEI YL，etal.A novel plasmid-Escherichia coli system produces large batch dsRNAs for insect gene silencing [J].PestManagement Science，2020，76（7）：2505-2512.

[20]SCHMITTGEN TD，LIVAK KJ. Analyzing real-timePCR data by the comparative CT method[J]. Nature Protocols，2Oo8，3：1101- 1108.

[21]FENGH，WEILH，CHEN HG，et al.Calreticulin is required for responding to stress，foraging，and fertility in the white-tip nematode，Aphelenchoides besseyi[J].Experimental Parasitology，2015， 155：58-67.

[22］趙一桐，楊行州，周冬梅，等.噻唑麟和吡蟲(chóng)啉二元復(fù)配劑防治 水稻干尖線蟲(chóng)效果評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（6）：131- 136.

[23]DINGSW，WANGDW，XUCL，etal.Anewfungus-mediated RNAi method established and used to study the fatty acid and retinolbinding protein function of the plant-parasitic nematode Aphelenchoides besseyi[J].RNA Biology，2021，18（10）：1424-1433.

[24］張映瞳，趙歡歡，周宏勝，等.基于大腸桿菌HT115合成dsRNA 殺菌劑前體物質(zhì)的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2022，43（9）： 186-19

[25]NWOKEOJIAO，NWOKEOJIEA，CHOUT，etal.A novel sustainableplatformforscaledmanufacturingofdouble-stranded RNA biopesticides[J].Bioresources and Bioprocessing，2022，9（1）： 107.

[26]計(jì)慧君，林羿光，付彤煜，等.基于細(xì)菌體系生產(chǎn)雙鏈RNA的 條件優(yōu)化[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2023，45（3）：703-710.

[27]PAPICL，RIVASJ，TOLEDOS，etal.Double-stranded RNA production and the kineticsof recombinant Escherichia coli HT115 infed-batch culture[J].BiotechnologyReports，2018，2O：e00292. （責(zé)任編輯：石春林）