天山郁金香種子解除休眠過程中生理生化的變化

中圖分類號：S682.263 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2025）05-0977-07

Abstract：In this study，seeds of Tulipa thianschanica Regel were subjected to stratification at 4°C to systematically analyzethe physiological and biochemical changes during theprocess ofseeddormancyrelease.Theresults showed that in termsofseed storagesubstances，withtheextensionof stratificationtime，thecontentof solublesugarsintheseeds firstdecreasedand thenincreased，thecontentof starch firstincreasedandthendecreased，andthecontentof soluble proteinscontinuouslydeclined.Intermsofseedenzymeactivity，withtheextensionofstratificationtime，theactivityofperoxidase （ P（DD ）intheseeds first decreasedand then increased.Intheearly stratificationstage（1-1Odays），theactivities of glucose-6-phosphate dehydrogenase （G-6-PDH） and 6-phosphogluconate dehydrogenase （ 6-PGDH ） in the seeds showed no significantchange.However，inthelatestratificationstage（4Odays），theactivitiesofbothenzymesintheseedssignificantly

increased.In terms of endogenous hormone content，with theextensionofstratificationtime，thecontentofabscisic acid（ABA）in theseedsfirst increased and then decreased，thecontentofgibberellin（ GA₃ ）first decreased andthen increased，while thecontentsof auxin（IAA）and cytokinin（CTK）continuously rose.The results ofthis studyelucidated the changes in the content of storage sub

stances，enzyme activities，and hormone levels duringthe dormancyrelease of Tulipa thianschanica Regel seeds，providing a theoretical basis for the dormancy regulationand eficient propagationof Tulipa thianschanica Regel seeds.

Keywords：Tulipa thianschanica Regel；seed；dormancy；enzyme activity；hormone

天山郁金香（Tulipa thianschanica Regel）為百合科（Liliaceae）郁金香屬（Tulipa）多年生野生花卉，主要分布于中國新疆和中亞地區[1]，其花色艷麗、花型獨特、抗逆性強。在自然生境中，天山郁金香主要通過鱗莖或種子繁殖，但其繁殖效率較低，1個4＼～5年生的鱗莖每年僅能產生1＼～3個子球，且鱗莖采集會對原生境造成破壞。因此，種子繁殖是天山郁金香規模化人工栽培的首選繁殖方式。然而，郁金香種子具有休眠特性，在自然條件下需經歷夏熟冬藏的過程才能解除休眠并萌發[2-4]，漫長的萌發周期嚴重制約了種質資源的開發利用。深入研究天山郁金香種子休眠機制，不僅有助于加速其育種進程，還能為解析早春短命植物的繁殖策略提供科學依據，同時對其他國產野生郁金香資源的開發利用及新品種選育具有重要指導意義。植物種子休眠機制復雜，主要受外界環境因素和種子自身因素的共同影響。種子自身因素包括種殼障礙、含有萌發抑制物質以及種胚形態生理未成熟等[5]。在種子休眠解除過程中，內源抑制物質和內源激素的含量會發生變化。以燕山花椒種子為例，其發育過程中可溶性糖含量變化顯著，先升高后降低，而可溶性蛋白含量則相反，先降低后升高，同時過氧化物酶（POD）活性持續升高[6。滇重樓種子休眠解除過程中，可溶性糖、可溶性蛋白和淀粉含量顯著下降，而POD活性顯著升高[。油用牡丹鳳丹種子休眠解除過程中，可溶性糖含量呈現先下降再上升后又下降的趨勢，淀粉含量和可溶性蛋白含量持續下降，同時POD活性逐漸升高[8]。值得注意的是，孫曉梅等[9]發現，牡丹種子萌發過程中，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性持續下降，而過氧化氫酶（CAT）活性則呈上升趨勢[9]。這些差異可能與種子萌發及休眠解除的啟動時機有關。

植物激素在種子休眠調控中發揮重要作用。脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、細胞分裂素（CTK）之間的動態平衡及種子對其敏感性的變化共同調節種子的休眠與萌發過程[10-11]。GA 參與種子休眠解除，但單獨使用 GA₃ 處理種子通常不能誘導完全休眠種子的萌發，因為種子萌發過程還伴隨ABA含量降低以及種子對ABA的敏感性減弱[12-14]。金飚等[15]發現，休眠解除后，隨著芍藥種子胚芽生長，其GA含量下降，而生長素（IAA）和CTK含量上升。紫楠種子休眠解除過程中，內源IAA和 GA₃ 含量持續增加，而ABA含量逐漸減少[16]。這些研究為揭示種子休眠解除的分子機制提供了重要理論基礎，但不同植物種子休眠解除的生理生化特征存在差異。

本研究擬以天山郁金香種子為試驗材料，對其種子休眠解除過程中生理生化指標進行測定，以期揭示其休眠解除機制，為天山郁金香的人工繁育、種質資源保護和新品種選育提供理論依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

天山郁金香種子由省農業科學院郁金香國家種質資源庫 （41^°49^′N，123^°32^′E） 提供。采集天山郁金香成熟蒴果，將其裝于尼龍袋并懸掛于溫室中自然風干至開裂，用鑷子剝離蒴果，去除殘渣及雜質。在燈箱上篩選具有胚的完整種子，室溫保存。

1.2 層積處理

將天山郁金香種子用 KMnO₄ 溶液消毒 2min ，ddH₂0 沖洗3次。用濾紙吸干種子表面水分，挑取100粒種子置于鋪有雙層濾紙的 11cm×11cm 培養皿中，加入 5mL 蒸餾水，用封口膜密封培養皿。共設置30個培養皿，置于 4^°C 黑暗條件下培養。培養期間每7d補充 5mL 蒸餾水以保持濕潤。如圖1所示，收集層積 1d，10d，20d，30d，40d 的種子。每個時間點選取6個培養皿，共600粒種子。將種子用液氮速凍并研磨成粉末，每 0.5g 種子粉末為1份，用錫箔紙分裝，保存于 -80^°C 冰箱。

1.3 測定指標與測定方法

1.3.1可溶性糖含量、淀粉含量與可溶性蛋白含量測定可溶性糖含量采用蒽酮比色法[17]測定。淀粉含量測定：取可溶性糖提取后剩余的自然干燥殘渣，加人 20.0mL 蒸餾水， 100^°C 水浴加熱 20min 。加入2.0mL 9.2mol/l 高氯酸溶液，提取 20min 。冷卻后將溶液轉移至 25mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至25.0mL ，過濾后收集濾液。取 1.0mL 濾液，加人 1.5mL 蒸餾水稀釋，再加入 0.5mL2% 蒽酮試劑，沿管壁緩慢加入 5.0mL 濃硫酸，充分混勻后靜置冷卻。使用分光光度計在 620nm 波長下測定溶液吸光度（OD值）。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法[18]測定。

1.3.2過氧化物酶、淀粉酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 ?+6? 磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性測定過氧化物酶活性采用愈創木酚法[9測定。淀粉酶活性采用水楊酸顯色法[19測定。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 +6. 磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性測定：取 1g 天山郁金香種子，加入 2.0mL 0.1mol/L Tris-HCI緩沖液及少量石英砂，研磨成勻漿， 4^°C 條件下 10 000r/min 離心30min ，取上清液。在 10mL 離心管中依次加入 0.5mL 0.1mol/L Tris-HCl緩沖液 .0.3mL0.1mol/LMgCl₂ 溶液、 0.2mL 4mg/L 煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH） .0.1mL 0.1mol/L 葡萄糖-6-磷酸鈉鹽和1.8mL 超純水，反應體系總體積為 2.9mL 。取0.1mL 酶液加入反應體系，于 340nm 波長下測定吸光度，記錄 3min 內吸光值。

1.3.3植物激素含量的測定取 0.5g 研磨后的郁金香種子粉末于 5mL 離心管中，加入 2mL 預冷的80% 甲醇水溶液，均質 1min 后， 4‰ 過夜浸提。次日搖勻浸提液， 10 000r/min 離心 10min ，收集上清液，殘渣用 80% 甲醇重復浸提 1～2h ，再次離心，合并上清液定容至 4mL 。使用CleanertSAX固相萃取柱進行純化，依次用 2mL 純甲醇和 2mL2% 氨水活化，用 2mL2% 氨水和 2mL 純甲醇淋洗，最后用2mL1% 甲酸-甲醇溶液洗脫3次，得到 4mL 含激素的洗脫液。洗脫液經 1800r/min 真空離心后，分5次加人 1mL 10% 乙腈，用 0.22μm 濾膜過濾2次備用。

色譜分析條件：流動相A為 0.1% 甲酸水溶液，流動相B為乙腈，進樣量 3μL ，流速 0.4mL/min ，柱溫 40% ，樣品溫度 8°C 。梯度洗脫程序為 0～0.3 min（ 90% A），0.3～2.0min（ 20% A）， 2.0～3.0min （ 20% A），3.0～3.1min（ 90% A）， 3.1～5min（90% A）。

質譜分析采用電噴霧離子源（ESI），如表1所示，采用正/負離子多反應監測（MRM）模式，參數設置如下：脫溶劑氣溫度 450°C ；流量 1000L/h ;錐孔氣流量 50L/h ;電噴霧電壓 （+）3500V_l（-）2200 V；霧化器電壓 50V ；碰撞氣壓力為中等水平；氣簾氣電壓 30V ；輔助氣電壓 50V ;離子源溫度 300^qC 。

1.4 數據統計與分析

利用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析，通過Duncan’s法對組間差異進行多重比較，利用GraphPadPrism8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1休眠解除過程中天山郁金香種子中主要貯藏物質含量的變化

如圖2所示，隨著層積時間的延長，天山郁金香種子中可溶性糖含量呈先降低后升高的變化趨勢。層積10d和 20d 的種子可溶性糖含量低于層積1d的種子（ Plt;0.05） ），層積30d和40d的種子可溶性糖含量與層積1d的種子相比無顯著差異（ （Pgt;0.05） 。隨著層積時間的延長，天山郁金香種子淀粉含量呈先升高后降低的變化趨勢。層積 20d 的種子淀粉含量顯著高于層積1d的種子（ Plt; 0.05），層積 30d 和 40d 的種子淀粉含量顯著降低（ Plt;0.05） 。天山郁金香種子中淀粉含量的動態變化可能與其休眠調控機制密切相關。在層積處理前期，種子淀粉含量升高，這是因為種子將可溶性糖轉化為淀粉從而降低代謝活性，維持休眠狀態；而在層積處理后期，種子休眠逐漸解除，淀粉含量隨之下降，這是因為淀粉被水解為可溶性糖，為種胚的萌發和生長提供能量。同時，淀粉含量下降也反映了淀粉酶活性的增強。隨著層積時間的延長，天山郁金香種子可溶性蛋白含量下降。層積10d和 20d 的種子可溶性蛋白含量顯著低于層積1d的種子（ Plt; 0.05）。層積30d和 40d 的種子可溶性蛋白含量顯著低于層積 10d 和 20d 的種子（ （Plt;0.05） 。在層積初期，種子吸脹，代謝活動開始增強，此時可溶性蛋白含量較高。隨著層積時間的延長，可溶性蛋白含量顯著降低。在層積后期，種子休眠逐漸解除，此時需要降解蛋白質以提供種子萌發所需的酶類和其他代謝物質，導致種子中可溶性蛋白含量急劇下降。

2.2休眠解除過程中天山郁金香種子中酶活性的變化

如圖3所示，隨著層積時間的延長，天山郁金香種子過氧化物酶（ POD ）活性呈先降低后升高的變化趨勢。層積 20d 的種子過氧化物酶活性最低，層積40d的種子過氧化物酶達到最高。層積 1d，10d 730d的種子葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 +6. -磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性無顯著差異（ Pgt;0.05） 。層積 40d 的種子葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 +6. -磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性達到最高，顯著高于層積1d、10d 、20d，30d 的種子（ Plt; 0.05）。表明在種子休眠解除過程中，磷酸戊糖途徑（PPP）相關酶發揮重要作用。層積 20d 的種子 α 淀粉酶活性顯著低于層積1d的種子（ Plt;0.05 ；層積40d 的種子 α -淀粉酶活性達到最高，顯著高于層積^1d，10 d ，20d，30d 的種子 （Plt;0.05 。

層積30d的種子 β -淀粉酶活性顯著高于層積1d的種子（ Plt;0.05） ；層積 40d 的種子 β -淀粉酶活性達到最高，顯著高于層積1d、10d ，20d，30d 的種子（ Plt;0.05） 。在層積前期，淀粉酶活性較低，此時種子的代謝活動緩慢。隨著層積時間的延長，種子的休眠逐漸解除，代謝活動增強。同時，淀粉被逐漸水解為還原糖，為種子的萌發和生長提供能量。

2.3休眠解除過程中天山郁金香種子激素含量的變化

如圖4所示，隨著層積時間的延長，天山郁金香種子赤霉素含量呈先降低后升高的變化趨勢。層積20d的種子赤霉素含量最低，層積40d的種子赤霉素含量達到最高。隨著層積時間的延長，種子生長素含量升高。層積40d的種子生長素含量達到最高。隨著層積時間的延長，天山郁金香種子脫落酸含量呈先升高后降低的變化趨勢。層積 20d 的天山郁金香種子脫落酸含量達到最高。隨著層積時間的延長，細胞分裂素含量升高。層積 40d 的天山郁金香種子細胞分裂素含量達到最高。

3 中 討論與結論

3.1天山郁金香種子休眠解除過程中貯藏物質含量和酶活性的變化

在休眠解除過程中，天山郁金香種子貯藏物質含量的變化直接反映了種子內部的代謝活動。本研究發現，可溶性糖含量、淀粉含量和可溶性蛋白含量隨層積時間呈現動態變化。在層積初期，種子快速吸脹，碳水化合物代謝活躍。隨著層積時間的延長，小分子物質含量逐漸減少，而淀粉含量略有增加。這可能是因為生理性休眠限制了代謝活動，促使碳水化合物轉化為淀粉貯存，抑制種子萌發。值得注意的是，隨著層積時間的延長，天山郁金香種子中淀粉含量呈現先升高后降低的趨勢，表明天山郁金香種子需經歷后熟過程。隨著休眠解除，淀粉在淀粉酶作用下轉化為可溶性糖，為種胚生長提供能量。王蕾等[20]發現，休眠解除過程中，貝母種子中的淀粉不斷降解為蔗糖和葡萄糖等供能物質，與本研究結論一致。

可溶性蛋白作為種子重要營養組分，參與細胞構建、酶的合成以及生物膜透性調節等過程[21-24]。本研究中，雖然種子中可溶性蛋白含量整體呈下降趨勢，但在層積 10～20d ，可溶性蛋白含量出現短暫升高。這可能是因為種子為維持休眠狀態而合成抑制萌發的物質，同時產生蛋白質作為代謝氮源，此階段種子內部代謝活動最為復雜活躍。于蘭莉等[25]的研究也證實，種子休眠解除過程中并非單純消耗蛋白質，某些細胞在蛋白質消耗過程中仍會合成新的蛋白質。

種子休眠解除過程中，過氧化物酶和淀粉酶促進貯藏物質向供能物質轉化。過氧化物酶（POD）與植物細胞壁的形成有關，參與脂肪酸代謝，調節細胞膜透性，還參與種子休眠的調節[26-27]。本研究發現，隨著層積時間的延長，種子過氧化物酶（POD）

活性呈先下降后上升的變化趨勢。這可能是因為在休眠解除初期，種子代謝緩慢，呼吸作用微弱；隨著休眠解除，種子代謝增強， POD 活性升高，促進脂肪酸氧化分解，為種子萌發供能。在層積前期（1～20d），種子淀粉酶主要以酶原形式貯存，含量沒有明顯變化;而到層積后期，種子淀粉酶活性激增，淀粉酶被轉運至胚乳催化淀粉降解。閆芳[28]發現，淀粉酶活性與種子萌發速度呈正相關，與本研究結論一致。

在代謝途徑方面，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶作為磷酸戊糖途徑（PPP）的關鍵限速酶，在層積前期沒有明顯變化，在層積后期（40d）活性顯著升高。表明PPP可能未參與休眠解除過程，但對種子萌發具有重要作用。閆芳[28]的研究結果表明，黃瑞香種子休眠解除過程中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性升高，對種子休眠的解除具有積極作用。

3.2天山郁金香種子休眠解除過程中內源激素含量的變化

各類植物激素通過協同或拮抗作用共同調控種子從休眠到萌發的轉變過程。赤霉素（GA）是打破種子休眠的關鍵激素，它和淀粉酶等水解酶系統作用促進貯藏物質分解，或替代低溫作用解除種子休眠。與之相反，脫落酸（ABA）是維持種子休眠的重要激素，通過抑制胚的生長幫助種子適應不良環境，并與GA等生長促進類激素表現出拮抗作用。細胞分裂素（CTK）與GA協同促進胚根和胚芽的生長發育，而生長素（IAA）則主要調控胚根的生長發育[29-30]

關于ABA的作用機制，Schmitz等[31]提出，種子休眠的關鍵因素并非ABA絕對含量的變化，而是胚對ABA敏感性的改變，種子休眠解除主要源于胚對ABA識別能力或代謝能力的下降。在休眠誘導與維持階段，ABA含量與GA含量的平衡至關重要。在桃[32]、甜櫻桃[33]和大麥[34]中，ABA含量與GA含量比值的降低有助于種子休眠解除，且這一激素平衡比其他激素間的相互作用影響更為顯著。

本研究利用UPLC-MS/MS技術檢測了天山郁金香種子在解除休眠過程中內源激素的變化。結果表明，隨著層積時間的延長，ABA含量呈現先升高后降低的趨勢， GA₃ 含量先下降后上升，IAA和CTK含量均持續上升。綜上，天山郁金香種子的休眠解除并非單一激素作用的結果，而是ABA、 GA₃ 、IAA和CTK協同調控的動態平衡過程。

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（責任編輯：成紓寒）