鮑姆桑黃 (Sanghuangporus baumii)HSP20基因家族的分子特征及不同發育階段的表達模式分析

中圖分類號：Q931 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006—6500.2025.05.001·

Molecular Characteristics and Expresson Patterns of the HSP20 Gene Family in Sanghuangporus baumi at Different Developmental Stages

IAN Yanting，QI Xin，LIU Hao，LIAO Fangzhou，TONG Yana （TheResearch InstituteofForestryandPomology，TianjinAcademyofAgricultural Sciences，Tianjin3Oo384，China） Abstract：Toelucidatethebiologicalfunctionsandmolecularmechanismsof theheatshockprotein2O（HSP20）genefamilyinthe medicinalfungusSnghuangporusbaumi，thisstudysystematicallyidentifiedtheSbHSP2Ofamilymembersbasedonholeenome dataandinvestigatedtheirrolesinfungalgrowthregulation.Theresultsdemonstratedthat11SbHSP2Ogeneswereidentifiedin S baumi，ncodingproteisithmolecularweightsrangingfrom17.5to8.96Daandisoelectricpoits（p）distrbutedbtwen5.07 and10.38.Phylogeneticanalysisrevealed highhomologybetweenSbHSP2Oproteinsand HSP2OproteinsfromPleurotusostreatus （average sequence identity： 76.8 % ）.The promoter regions harbored 12 classes of stress-responsive cis acting elements，including ABRE，MBS，ndSRE，withtheSH2-7promoterontaningsevendistictstresselatedelements.Expressonprfligaaly sisrevealed thatthe transcription levelsof SbHSP2O-2and SbHSP20-IO wererelativelyhighinmyceliacultured for5days，with valuesof 23.20and9.023，respectively.Meanwhile，theexpresionlevelsofSHSP2-6，SHSP2-7，andSHSP20-10imyelia culturedfor9dayswere52，6.09，nd98，espectively.Colinarityalysisucoveredcromosomalhomologousgiosb tweenS.baumiiandAgaricusbisporus.Inonclusion，thisstudyprovidesthefirstsystematiccharacterzationofthemoleularfeaturesand expression regulation of the SbHSP2O gene family in S .baumii.The findings highlightSbHsP2O-1Oasakeycandidate geneforenhancingfungalstressresistance，oferingboththeoreticalfoundationsandgeneticresourcesformolecularbreedigof stress-tolerant medicinal fungi.

Key words： small heat shock protein （HSP2O）; gene structure; phylogeny; chromosomal localization

鮑姆桑黃（Sanghuangporusbaumii）是一種珍貴的藥用真菌（此前被歸類為鮑氏針層孔菌和鮑氏木層孔菌），幾個世紀以來，在中國、韓國、日本和其他一些亞洲國家被用作傳統草藥。這種真菌通常生長在暴馬丁香的樹干上，大約需要2＼～3年才能發育成黃色的成熟子實體。近幾十年來，鮑姆桑黃因其含有多種生物活性化合物而備受關注，這些化合物包括多糖、三萜類、黃酮類和酚類化合物，具有抗癌、抗病毒、抗氧化和抗炎活性等功效3-。由于這些特性，鮑姆桑黃的野生資源正在枯竭，因此許多研究人員探索了人工栽培的方法，以提高這種珍貴真菌的產量。然而，鮑姆桑黃在生長過程中易受到各種非生物脅迫的影響，這會導致其生長發育受阻，品質和產量也會顯著下降。

活細胞具備各種分子機制來適應物理和化學脅迫，如寒冷、高溫、酸、堿和鹽脅迫。熱休克蛋白（HSPs）就是其中一種普遍存在的機制。當細胞暴露于環境脅迫時，會增加熱休克蛋白的表達，熱休克蛋白作為分子伴侶發揮作用，防止蛋白質聚集8。熱休克蛋白分為5個主要家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱休克蛋白（smallHSP）。其中，小分子熱休克蛋白的分子量范圍為 ，大多數小分子熱休克蛋白的分子量范圍為 14～27kDa^[10] 。小分子熱休克蛋白是不依賴三磷酸腺昔（ATP）的分子伴侶，可防止活細胞中的蛋白質聚集。特別是HSP20，作為小分子熱休克蛋白的一種，已在真核生物、古細菌和細菌中得到深入研究，并且在抵御多種物理和化學脅迫方面發揮著關鍵作用。隨著鮑姆桑黃基因組測序的完成，系統分析其HSP20家族成為可能。目前，有關桑黃屬中HSP20基因的進化、功能分化及它們與藥用成分合成的關聯，尚未得到充分探究。

在擔子菌門（如靈芝和香菇）中，HSP20家族成員的數量差異顯著。一些基因通過基因復制事件發生了擴增，這可能與宿主的環境適應性有關。在曲霉菌中，HSP20基因敲除菌株表現出對熱的敏感性，并且抗氧化能力下降。本研究中，從鮑姆桑黃的參考基因組中共鑒定出12個HSP20（SbHSP20）家族成員基因，并進行了系統發育、蛋白質的基序組成和啟動子區域的順式作用元件分析。利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析了鮑姆桑黃中12個SbHSP20家族成員在不同發育階段的表達模式，為鮑姆桑黃中SbHSP20家族的功能鑒定奠定了理論基礎。

1材料方法

1.1樣品制備

鮑姆桑黃菌株DL101分離自暴馬丁香上的子實體，其純菌絲體培養物保存于中國典型培養物保藏中心（CCTCC編號：M2011137）。鮑姆桑黃的菌絲體放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面上保存，儲存溫度為 4^°C ，每3個月轉接1次。首先，將其放在馬鈴薯葡萄糖（PD）培養液中， 條件下培養8＼～10d。隨后進行二次菌種活化和平板培養，參照先前食用菌培養條件[12-13]。為檢測鮑姆桑黃不同發育階段SbHSP20基因的表達水平，分別在培養3、5、7、9d收集菌絲體和子實體。每個處理設置3個重復。所有樣品隨后冷凍并保存于 -80^°C 條件下，以備后續分析。

1.2鮑姆桑黃基因組中SbHSP20家族的分析

1.2.1鮑姆桑黃基因組中SbHSP20基因的鑒定從NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取鮑姆桑黃的基因組序列數據（NCBI登錄號：ASM148141v2），并從Pfam數據庫（http：//pfam.xfamorg/）下載HSP20結構域的隱馬爾可夫模型（HMM）文件（PF00010）。采用HMMER3.0軟件，在鮑姆桑黃的蛋白質序列中搜索SbHSP20基因家族成員，利用SMART（http：//smart.embl- heidelberg.de/）和NCBI保守結構域對候選的HSP20序列進行進一步驗證。

1.2.2HSP20 基因的結構和基序特征分析使用GSDS2.0 （GSDS 2.0，https：//gsds.gao -lab.org/）分析SbHSP20基因的外顯子-內含子結構。利用MEME工具（https：//meme-suite.org/tools/meme）鑒定 SbHSP20蛋白的基序。使用TBtools v2.136Ω 軟件可視化鄰接樹、基因結構和SbHSP20蛋白基序。為了推斷SbHSP20基因的潛在功能，從鮑姆桑黃基因組中提取每個基因轉錄起始位點上游2000堿基對的序列，并利用PlantCare 網站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/預測順式作用元件。1.2.3HSP20基因家族的系統發育分析與分類鑒定裂褶菌、雙孢蘑菇、冬蟲夏草、糙皮側耳、灰蓋鬼傘和香菇的HSP20蛋白全長氨基酸序列，使用ClustalW軟件對全部HSP20蛋白進行多序列比對，然后在MEGAX軟件中采用鄰接法（NJ）構建系統發育樹。

1.3總RNA提取、cDNA反轉錄和qRT-PCR分析

利用qRT-PCR技術分析12個SbHSP20家族成員基因在不同發育階段的表達情況。使用RNAprepPure植物試劑盒（天根生化科技有限公司，中國北京）提取總RNA。反轉錄時，以 1ug RNA為模板，使用含有gDNAEraser的PrimeScriptMRT試劑盒（寶生物工程有限公司，中國大連）合成第一鏈cDNA。使用PrimerPremier5.O軟件設計qRT-PCR引物。qRT-PCR的試驗步驟參考Qiao等4和Wang等[研究，以 ∝- 微管蛋白基因作為內參。每個試驗設置3個重復，采用 2^ΔΔG 方法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1鮑姆桑黃HSP20基因鑒定與保守基序分析

在桑黃基因組中共鑒定出11個HSP20家族成員基因，依次命名為SbHSP20-1至SbHSP20-11。對11個SbHSP20家族蛋白的理化性質進行分析，結果表明，氨基酸數目為154＼～839，分子量 17 537.82～ 89644.80Da ，二者呈顯著正相關;理論等電點（pI）范圍為 5.07～10.38 ，其中 SbHSP20-6（10.38）與SbHSP20-1（9.12）呈堿性，其余多為弱酸性至中性，反映蛋白電荷性質差異（表1）。通過多序列比對分析可知（圖1），在SbHSP20蛋白中成功鑒定出多個高度保守的結構域。這些保守區域在不同家族成員間呈現顯著的序列同源性，表明其可能參與相似的生化途徑及分子互作網絡。為深入了解SbHSP20基因的結構組成，對其外顯子和內含子結構進行分析，結果發現，不同基因的內含子數量范圍為0＼～11個，多數SbHSP20 基因含有1＼～2個內含子，SbHSP20-10的內含子數量最多，為11個。通過MEME程序分析11個SbHSP20蛋白保守基序，鑒定出9個特異性保守基序（Motif1-6）。如圖2所示，所有SbHSP20蛋白均含有保守的Motif1和Motif 5，二者在SbHSP20 蛋白中位置相近。IbpA、IISP20和APC103個保守結構域在不同的SbHSP20成員中出現，提示SbHSP20成員的功能可能不同。

Conserved region

2.2 HSP20家族系統發育研究

為研究桑黃與5種大型真菌裂褶菌（Schizophyllumcommune）雙孢蘑菇（Agaricusbisporus）灰蓋鬼傘（Coprinopsiscinerea）香菇（Lentinulaedodes）和糙皮側耳（Pleurotusostreatus）的SbHSP20蛋白的進化關系，利用ClustalW對11個SbHSP20蛋白的氨基酸序列進行多序列比對，并在MegaX中通過鄰接法（NJ）構建系統進化樹（bootstrap1000）（圖3）。系統發育分析顯示，11個SbHSP20基因被分為5個不同的進化枝。香菇和桑黃的HSP20蛋白聚于同一系統發育分支，表明二者基序組成相似。這說明桑黃SbHSP20蛋白與香菇的LeHSP20蛋白親緣關系更近。

2.3 SbHSP20基因染色體定位

通過對SbHSP20基因的染色體定位（圖4），確定了它們在基因組中的分布。11個成員相對均勻地分布在10段不同的染色體片段中，部分SbHSP20基因在特定染色體區域（LNZH02000195.1）有聚集現象。這表明在進化過程中，該區域發生了基因重復事件。這種非隨機分布特征提示串聯重復事件在基因家族擴張中和新功能的獲得起到了重要作用。

2.4SbHSP20啟動子順式元件解析

為探究SbHSP20基因家族在非生物脅迫響應中的調控機制，利用在線數據庫PlantCARE分析啟動子區順式元件，手動去除冗余和無關序列后，通過TBtools進行結果可視化。如圖5所示，SbHSP20啟動子區包含多種脅迫響應元件，如光響應、植物生長調控、植物激素信號轉導和應激反應相關的順式作用元件。啟動子區還含有多個脅迫響應及生長發育相關元件，如ARE基序、LTR基序、DRE基序、AAGAA-motif等。因此，桑黃SbHSP20基因家族成員可能通過調控轉錄因子的上游元件參與多種脅迫響應。

2.5跨物種HSP20基因共線性研究

對雙孢蘑菇（A.bisporus）桑黃（S.baumii）、香菇（L.edodes）和裂褶菌（S.commune）等物種的HSP20基因共線性分析（圖6），成功識別出同源基因片段和共線性區域。值得注意的是，桑黃與香菇、裂褶菌沒有表現出同源性，而桑黃與雙胞蘑菇之間發現單個同源基因對，凸顯了二者之間更為密切的進化關系。此外，這一發現為闡明HSP20基因家族在不同物種中的進化保守性和分化提供了重要證據。這些結果也揭示了基因重復和重排事件在進化過程中塑造HSP20基因家族基因組結構和功能演化中的作用。

2.6不同發育階段SbHSP20基因的表達

為了探究HSP20家族基因在鮑姆桑黃（S.baumii）不同發育階段所起到的作用，本研究采用qRT-PCR技術，對培養3＼～9d的菌絲體和子實體中11個SbHSP20家族基因的相對表達水平進行了評估。分析結果顯示，SbHSP20基因在不同發育階段有著不同的表達模式。這表明這些基因可能履行著多種調控功能。值得注意的是，有2個基因（SbHSP20-2和SbHSP20-10）在培養5d的菌絲體中轉錄水平達到峰值，而有3個基因（SbHSP20-6、SbHSP20-7和SbHSP20-10）在培養9d的菌絲體中表達量最高。這表明這些基因可能參與了鮑姆桑黃的菌絲體發育過程。相反，SbHSP20-1在子實體階段表達量升高，因此推測這6個SbHSP20基因可能與子實體的發育更為密切相關（圖7）。

3．討論與結論

3.1 討論

本研究通過對小熱激蛋白（sHSP或HSP20）家族的多維度深入分析，揭示了該家族在基因和蛋白層面的關鍵特征，為闡明其在植物生理學和進化過程中的角色提供了新的見解。在SbHSP20蛋白的保守區域分析中，保守區域的存在強烈表明這些蛋白在基本功能上具有保守性，它們可能參與基本的細胞保護機制。不同成員之間序列相似性的差異可能導致功能的特異性，為后續研究SbHSP20蛋白的功能多樣性奠定了基礎。先前關于擬南芥HSP20家族的研究也揭示了保守區域，但本研究中，SbHSP20蛋白的保守區域在序列特征和分布范圍上有所不同，這可能與不同植物物種的進化軌跡和生態適應模式的差異有關。

種間基因共線性分析成功識別了同源片段和共線性區域，為探索HSP20基因家族在不同物種中的進化保守性和分化提供了直接證據。共線性區域的存在表明，在進化過程中，這些基因在基因組中的相對位置和排列存在一定的穩定性。相反，基因重排和復制事件促使一些基因的分化以及新功能的出現。與其他物種HSP20基因共線性研究相比，本研究所涉及物種的共線性區域長度、參與的基因數量和同源基因的對應模式有所不同，進一步強調了不同植物分類群中HSP20基因家族在進化過程中的獨特歷程。

3.2 結論

本研究在基因和蛋白水平進行了全面分析，鑒定出SbHSP20家族的11個成員，分布于10個不同的染色體片段。通過多序列比對分析，在SbHSP20蛋白中成功鑒定出多個高度保守的結構域。桑黃（S.baumii）與5種大型真菌裂褶菌（S.commune）雙孢蘑菇（A.bisporus）灰蓋鬼傘（C.cinerea）香菇（L.edodes）和糙皮側耳（P.ostreatus）的SbHSP20蛋白進化關系分析顯示，11個SbHSP20基因被分為5個不同的進化支，其中香菇與桑黃的HSP20蛋白聚于同一系統發育分支。共線性分析表明，桑黃與雙孢蘑菇之間存在單個同源基因對。不同發育階段的表達量分析顯示，SbHSP20-6、SbHSP20-7和SbHSP20-10在培養9d的菌絲體中表達量達到峰值，表明這些基因主要參與調控菌絲體的發育過程。

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