妥甸醬油發酵功能菌株篩選及應用

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.006

中圖分類號：TS264.21 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）05-0037-11

Screening and Application of Functional Strains for Fermentation of Tuodian Soy Sauce

WU Quan-rong，ZHANG Hui，HU Yong-jin，ZHU Ren-jun

College of Food Science and Engineering，Yunnan Agricultural University， Kunming 65O201，Chi1

Abstract： Tuodian soy sauce is a special product of Shuangbai region in Yunnan. The relationship between the formation of its excellent quality and microorganisms is not clear. At present，there are mainly problems such as low utilization rate of raw materials，unstable flavor quality，difficulty in precise and stable control of fermentation process，and long fermentation period. In this study，the dominant microorganisms in the mash of Yunnan Tuodian soy sauce are isolated and identified，and three strains with strong enzyme production capacity and high sensory scores are screened out，which are mixed to make fermentation agent and applied for soy sauce fermentation，so as to optimize the soy sauce production process. The results show that the ratio of XT6-5，RT5-3 and JT7-3 is 3：3：2 ： The optimal fermentation process parameters are fermentation temperature of 41^°C ，inoculation amount of 6% and salt concentration of 8% . When the fermentation is completed，the content of amino acid nitrogen of mash is 0.936g/100g ，and the sensory score is 78. 4 points. This study has provided a theoretical basis for improving the quality stability of Tuodian soy sauce.

Key words： soy sauce; screening of bacteria; mixed fermentation agent; process optimization

醬油作為中國傳統的調味品之一，已有2000多年的釀造歷史，由自然接種和混合培養發酵而成，微生物群落在其風味的形成中起著重要的作用[1]。近年來，研究者們越來越重視醬油發酵菌種、品質、安全、功能等方面的研究[2]。因此，在醬油生產過程中，明確的混合發酵劑對于更好地控制發酵過程和提高產品質量的穩定性十分重要[3]。

妥甸醬油是云南雙柏地區的特色產品，其發酵過程在一個開放的混菌發酵體系中完成，存在原料利用率低、風味品質不穩定、發酵過程難以精準穩定控制、發酵周期長等問題。針對以上問題，本文從妥甸醬油醬醪中分離篩選影響醬油品質的高產功能微生物，通過人工純化培養，強化功能微生物在發酵中的作用，提高原料氮轉化率，縮短發酵周期，為提高妥甸醬油的品質穩定性提供了理論依據，對提升醬油品質具有實際生產意義。

1材料與方法

1.1材料

醬醪樣品：取自云南省楚雄彝族自治州雙柏縣妥甸鎮某醬油廠，保藏于一 80°C 超低溫冰箱中備用；大豆、帶殼小麥、食鹽：購于市尚購超市。

1.2培養基

酵母浸出粉脈葡萄糖瓊脂培養基（YPD瓊脂培養基）、營養瓊脂培養基、MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；YPD肉湯培養基、營養肉湯培養基：北京索萊寶科技有限公司；大曲酶解液[4]：將發酵好的大曲與水以 1：4 （質量比）混合， 40^°C 酶解 ，離心取上清液備用，使用時按需要調節鹽濃度。

1.3 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；AX223ZH/E電子天平奧豪斯儀器（常州）有限公司；BSC-250恒溫培養箱上海躍進醫療器械有限公司；PTQZ-6振蕩培養箱常州普天儀器制造有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；STARTER3100/F數字型 pH 計上海儀電科學儀器股份有限公司；SF-TDL-4A高速離心機上海菲恰爾分析儀器有限公司；NikonE20O-F顯微鏡南京新飛達光學儀器公司。

1.4方法

1.4.1樣品采集和保存

采集妥甸醬油不同發酵時間的醬醪。每批醬醪取3個平行，每份 500g ，裝入無菌袋中封袋后保存于冰盒中，當天帶回實驗室，于超凈操作臺上進行優勢微生物培養，余下的樣品分裝于貼好標簽的無菌采樣管中，放入 -80^°C 超低溫冰箱中保存備用。

1.4.2 優勢微生物的分離純化

稱取 10g 醬醪樣品，用無菌生理鹽水梯度稀釋，取250μL 稀釋液均勻涂布于無菌平板上。細菌用營養瓊脂培養基于 36^°C 培養 24h ，乳酸菌用MRS培養基于36°C 培養 24h ，酵母菌用YPD瓊脂培養基于 培養72h[5]。

觀察培養完成后的平板，根據菌落形態挑選出優勢細菌、乳酸菌、酵母菌劃線分離，直至獲得純凈的單菌落。將分離純化后的細菌接種于營養瓊脂斜面上，乳酸菌接種于MRS斜面上，酵母菌接種于YPD瓊脂斜面上，于 4^°C 冰箱中保藏以備后續研究。

1.4.3 高產蛋白酶菌株的篩選

將純化后的菌株接種至對應的液體培養基中活化2代，進行產酸產氣實驗，篩選出不產酸、不產氣的細菌，產酸能力強、不產氣的乳酸菌和產酸產氣能力強的酵母菌，用無菌生理鹽水調整菌液濃度為 1.0×10⁸ CFU/mL，接種到對應的液體培養基中發酵 48h ，以 10000r/min 離心提取上清液，測定蛋白酶活力。

蛋白酶活力的測定參照盧超等[的福林酚比色法并稍作改動。每個樣品設置3個平行。繪制的酪氨酸標準曲線見圖1，線性回歸方程為 y=0.002 4x+0.000 8，R² 為0.9994，線性擬合較好，可用于蛋白酶活力的測定。

1.4.4高產菌株的復篩

選擇蛋白酶活力排名前三的細菌和排名前二的乳酸菌、酵母菌，活化后測定脂肪酶活力和 α -淀粉酶活力，乳酸菌還需測定產酸能力。

脂肪酶活力的測定參照李成龍等的直接滴定法； α -淀粉酶的測定參照GB/T24401— 2009??α? 淀粉酶制劑》。

1.4.5單菌發酵實驗

將目標菌株活化后調整為統一的菌液濃度，接種到大曲酶解液中在適宜溫度下發酵7d，分別進行氨基酸態氮含量測定和感官評價。邀請實驗室9名無鼻炎、嗅覺正常、有一定感官評價經驗的同學組成感官評價小組，對發酵液進行嗅聞，并根據醬油特征香氣對發酵液香氣進行分類打分[8-9]（見表1），從而確定最終用于發酵的菌株。

1.4.6 目標菌株的分子生物學鑒定

挑取斜面保藏的目標菌株在無菌一次性平板上劃線培養，選擇無雜菌污染且分離出單菌落的平板，做好標記，用封口膜密封后放入冰盒中，寄往武漢天一華煜基因科技有限公司進行分子生物學鑒定。細菌類選擇16SrDNA位點進行測定[1°]，酵母菌類選擇ITSrDNA位點進行測定[8]

1.4.7 目標菌株生長曲線繪制

將活化目標菌株配制成相同濃度的菌懸液，按 2% 的接種量接入對應的肉湯培養基中培養 48h ，其中細菌類的培養溫度為 37^°C ，酵母菌類的培養溫度為 28°C ，每 ^2h 取樣測定吸光度值（ OD_600nm ），重復測定3次，繪制菌株生長曲線。

1.4.8 菌株間拮抗作用的驗證

經過實驗發現選用的3個菌株均能在PCA平板上正常生長，故采用交叉劃線法驗證菌株間是否存在拮抗作用[11]。

1.4.9 菌株配比的確定

將目標菌株活化后調整菌液濃度為 1.0×10⁸CFU/mL 按照XT6-5、RT5-3和JT7-3的比例為 1：1：1.1：2：2 、 1：3：3，2：1：2，2：3：1，2：2：3，3：1：3，3：2：1： 3：3：2 混勻后接種至大曲酶解液中發酵 ^72h ，測定發酵 液中氨基酸態氮的含量。

1.4.10 凍干菌粉的制備及存活率的檢測

以XT6-5、RT5-3和JT7-3為 3：3：2 制備混合菌懸液，與滅菌后的保護劑按 1：2 的比例混勻后，取樣，采用平板計數法測定活菌數，立即將混合菌懸液于-20^°C 預冷凍 24h ，隨后放入預凍好的真空冷凍干燥機中，干燥完成后再次取樣測定活菌數，計算存活率。

1.4.11 醬油后發酵工藝優化

1.4.11. 1 醬油發酵工藝

本實驗采用的醬油發酵工藝根據妥甸醬油發酵方法進行改進：選擇飽滿、無蟲蛀的大豆和帶殼小麥作為原料，按照 66% 大豆和 34% 小麥進行備料。將大豆破碎成兩半，用純凈水浸潤 8h ，潤水量為大豆質量的1.25倍，放入高壓鍋中蒸制，蒸熟的大豆應呈淡紅褐色，有彈性但能夠用手碾碎。將小麥放入烤箱中烤至茶色，破碎成顆粒狀，拌入蒸熟的大豆，攪拌均勻后冷卻至 40^°C 左右。將培養好的種曲碾碎拌人原料中， 保持濕度為 90% 制曲 48～72h ，期間翻曲 2～3 次，發酵至曲料質地松散，黃綠色孢子飛揚，具有成曲特有的香氣，無異味。制曲完成后，按照料液比 1：1 拌入鹽水，攪拌均勻后進行固態發酵，發酵時間為 10d_c 。固態發酵10d后，按照料液比 1：1.5 混人 15Be^° 鹽水，攪拌均勻后，于 36^°C 繼續發酵，發酵結束后壓榨過濾獲得生醬油。

1. 4.11. 2 單因素實驗

醬油后發酵是將大曲與鹽水混合后再進行發酵，因此單因素實驗將菌株接種至大曲發酵液中模擬醬油發酵。通過預實驗，以發酵液中氨基酸態氮含量為指標，選擇發酵溫度、接種量、鹽濃度為單因素，其他因素為固定因素。每組設置3個平行，結果取平均值。

a.發酵溫度的確定

固定接種量為 4% ，大曲酶解液鹽濃度為 7% ，將發酵溫度設置為 32，35，38，41，44^°C ，恒溫發酵 ⁷d 。

b.接種量的確定

固定發酵溫度為 35°C ，大曲酶解液鹽濃度為 7% 將接種量設置為 2%4%.6%.8%.10% ，恒溫發酵 ⁷d 0c.鹽濃度的確定。

固定接種量為 4% ，發酵溫度為 35°C ，將大曲酶解液鹽濃度設置為 6.5%.7%.7.5%.8%.8.5% ，恒溫發酵7d。

1. 4.11.3 響應面實驗

以單因素實驗的結果為基礎，設計Box-Behnken實驗，以發酵溫度、接種量、鹽濃度為因素，以發酵55d時醬醪的氨基酸態氮含量和感官評分為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，響應面實驗因素水平見表2。

表2醬油后發酵響應面實驗因素和水平

1. 4.12 醬醪感官評分

由于實驗室設備限制，無法將實驗制備的少量醬醪壓榨獲得足夠感官評價的醬油成品，因此選擇發酵結束時的醬醪進行檢測。參考張偉等[12]關于釀造醬油感官評價的方法，改進后使用。從實驗室邀請身體健康、嗅覺和味覺正常的5女4男對滅菌后的醬醪進行感官評價，感官評價標準見表3。

表3醬油的感官評價標準

2 結果與分析

2.1優勢微生物的分離純化

從妥甸醬油的醬醪樣品中分離得到優勢菌株53株，其中細菌28株，乳酸菌10株，酵母菌15株。將分離純化后的細菌接種于營養瓊脂斜面上，乳酸菌接種于MRS斜面上，酵母菌接種于YPD瓊脂斜面上，置于 4°C 冰箱中保藏。

2.2高產蛋白酶菌株的篩選

根據葡萄糖產酸產氣實驗結果，剔除不符合要求的菌株后，剩余菌株見表4，乳酸菌R6、R10、RT5-3、RT15-6-1的產酸能力較強，酵母菌JT2、JT7-1、JT7-3、JT7-4的產氣能力較強，故選擇以下菌株測定蛋白酶活力。

注：產氣中“一\"表示沒有氣體產生；“ + ”表示杜氏小管中有 1/4 氣體；“ ⁺⁺ \"表示杜氏小管中有1/3氣體；“ +++ ”表示杜氏小管中有1/2氣體； …++++ ”表示杜氏小管中充滿氣體；產酸中“一\"表示培養液呈紫色；“ + ”表示培養液變成黃紫色；“ ⁺⁺ ”表示培養液完全變成黃色。

將活化好的菌株接種至液體培養基中振蕩培養^48h 測定蛋白酶活力，結果見圖2。細菌產蛋白酶能力明顯強于乳酸菌和酵母菌，細菌中蛋白酶活力排名前三的是XT3-7-1、XT2-6-2、XT6-5，其中XT3-7-1的蛋白酶活力最高，達到 1 123U/mL ，XT2-6-2和XT6-5的蛋白酶活力分別為 1081，1064U/mL ；酵母菌蛋白酶活力排名前二的是JT7-3和JT7-1，蛋白酶活力分別達到 170，126U/mL ；乳酸菌蛋白酶活力排名前二的是RT5-3、RT15-6-1，蛋白酶活力分別為 78，62U/mL ，故選擇以上7株菌進入下一階段的篩選。

Fig.2 Screening results of protease production capacity of strains

2.3 高產菌株的復篩

2.3.1菌株產脂肪酶能力測定

Fig.3Determination resultsoflipase production capacity of strains由圖3可知，細菌產脂肪酶能力強于酵母菌和乳酸菌；3株細菌中XT6-5產脂肪酶能力最強，可達到30U/mL ，XT3-7-1次之，XT2-6-2的產脂肪酶能力最弱；酵母菌中JT7-3的脂肪酶活力為 22.8U/mL ，強于JT7-1；乳酸菌中RT5-3的脂肪酶活力為 16U/mL ，強于RT15-6-1。

2.3.2 菌株產 α -淀粉酶能力測定

由圖4可知，3株細菌中XT6-5產 α -淀粉酶能力最強，達到 69.5U/mL，XT3-7-1 次之，XT2-6-2產 α? -淀粉酶能力最弱；酵母菌中JT7-1產 α -淀粉酶能力略強于JT7-3；乳酸菌中RT5-3產 α -淀粉酶能力略強于RT15-6-1，但總體來看7株菌的 α -淀粉酶活力均在 60～70U/mL 之間。

2.3.3 乳酸菌菌株產酸能力測定

乳酸菌分泌有機酸會降低發酵液的pH，可通過測定發酵液pH的動態變化分析乳酸菌的產酸情況。乳酸菌產酸曲線見圖5。

Fig.5 Acid-production curve oflactic acid bacteria

由圖5可知，總體來看隨著發酵時間的延長，兩株菌的發酵液pH不斷下降，在 8～12h 時急劇下降，表明該時間段乳酸菌生長活動旺盛，產生大量酸類物質，隨后發酵液的 pH 基本穩定，乳酸菌生長活動減慢，產酸量減少；RT5-3的產酸能力強于RT15-6-1。

2.3.4菌株形態學觀察

7株菌經過革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，結果見圖6。

注：A為菌株XT3-7-1，B為菌株XT6-5，C為菌株XT2-6-2， D為菌株JT7-1，E為菌株JT7-3，F為菌株RT5-3，G為菌株 RT15-6-1。

由圖6可知，菌株XT3-7-1、RT5-3、RT15-6-1呈紫色，XT6-5和XT2-6-2呈藍色，可以確定它們是革蘭氏陽性菌；XT2-6-2為桿狀；XT3-7-1和XT6-5菌體較小，呈現卵圓狀，不易分散，能夠觀察到有明顯的細胞壁；JT7-1和JT7-3菌體較大，能夠觀察到出芽生殖，JT7-1為圓球狀，JT7-3為橢球狀且有菌絲。RT5-3、RT15-6-1菌體均為球形，成對出現。

2.3.5單菌模擬發酵實驗

由圖7和圖8可知，單菌模擬發酵實驗中，添加XT6-5、JT7-3的發酵液具有明顯的醬香味，同時散發烤土豆的香氣，JT7-3的氨基酸態氮產量高于JT7-1；添加RT5-3的發酵液酸香較明顯，除烤土豆味外，其余項目的感官評分均高于RT15-6-1，且氨基酸態氮產量最高。XT2-6-2的感官評分排名最低，說明其不能產生足夠的醬油特征香氣，故后續發酵實驗剔除該菌。

2.4菌株分子生物學鑒定和生長曲線

將篩選得到的6個菌株進行同源性比對，結果見表5，按照打分排序，提供得分最高且匹配度最佳的一條序列作為鑒定結果，構建系統發育樹，結果見圖9。

生長曲線能夠從宏觀層面反映微生物的生長情況，通過測定不同培養時間下培養液在 600nm 處的吸光度值，能夠大概確定微生物生長的延滯期、對數期、穩定期和衰亡期，為菌株在生產中的應用提供數據支撐[13]。菌株生長曲線見圖10。

由圖10可知，6株菌在培養 前后進入對數生長期，在 14～20h 進入穩定期。其中，RT5-3和XT6-5的對數生長期略早于其他幾株菌，且對數生長期維持時間較長，意味著這兩株菌具有較強的適應能力和繁殖能力。JT7-3雖然較晚進人對數生長期，但該菌能夠在較短時間內進人穩定期，且在穩定期內維持較高濃度，說明該菌具有較強的維持穩定生長的能力。此外，將菌株進行分類，得知酵母菌與細菌相比具有更強的生長穩定性，而細菌生長速率快，但到達穩定期后會出現吸光度值下降的情況。

2.5混合菌株發酵劑研制

2.5.1 菌株拮抗作用驗證結果

綜合前期篩選過程中對菌株生長特性和穩定性的研究，XT6-5、RT5-3、JT7-3這3株菌具有產酶能力強、生長繁殖快、發酵穩定性較好的特點，故選擇這3株菌作為后續發酵的菌株。混菌發酵需要考慮菌株間是否存在拮抗作用，菌株間的拮抗作用通常使用十字交叉劃線法和紙片法進行驗證[14]。本研究使用交叉劃線法進行驗證，將3株菌在基礎培養基上兩兩交叉劃線，生長情況見圖11。

圖11中菌株交叉處菌落生長正常，并未出現明顯抑菌區域，表明3株菌之間不存在拮抗作用或拮抗作用不明顯，因此判定可以將這3株菌混合后進行醬油發酵。

2.5.2菌株配比模擬發酵實驗結果

有研究表明共培養的微生物間往往存在協同作用，它們分工合作，為彼此提供營養，擴大微生物對底物的利用范圍，控制發酵體系 pH ，轉移或消除有毒的抑制產物，因此混菌發酵不僅能夠提高發酵效率，縮短發酵周期，而且可以避免雜菌污染，控制產品質量[15-16]。

Fig.l2 Amino acid nitrogen content of compound fermentation由圖12可知，XT6-5、RT5-3和JT7-3按 3：3：2 接入大曲酶解液中復配發酵產生的氨基酸態氮含量最高，可達到 0.102g/100mL 。

2.5.3凍干存活率結果

因目標菌株中酵母菌的耐受力較強，選擇凍干保護劑時側重偏向于對細菌活性的保持，經查閱文獻，選取以下3個保護劑配方與菌泥按比例混合進行冷凍干燥。

配方一：脫脂乳粉 8% ，海藻糖 5% ，甘油 4%^[17]

配方二：脫脂乳粉17%，海藻糖9%，谷氨酸鈉11%[18]

配方三：脫脂乳粉 11% ，谷氨酸鈉 6.5% ，檸檬酸 鈉14.7%[19]

測定凍干前后的活菌數，計算存活率，結果見圖13。確定脫脂乳粉 17% 、海藻糖 9% 、谷氨酸鈉 11% 為最適的保護劑，凍干后活菌數的對數值為8.26，菌株存活率為 79.5% 。

2.6 醬油混合菌株發酵工藝優化

2.6.1 單因素實驗

2.6.1.1發酵溫度的確定由圖14可知，當發酵溫度為 29～41 （20 ^°C 時，隨著發酵溫度的升高，發酵液中氨基酸態氮含量升高，在 41°C 時達到最大值，為 0.125g/100mL ，之后發酵溫度繼續升高，氨基酸態氮含量下降。因此，應將發酵溫度控制在 38～44^°C 之間。

由圖15可知，當接種量為 2%～6% 時，發酵液中氨基酸態氮含量隨著接種量的增加而升高，當接種量為 6% 時，氨基酸態氮含量達到最高值 0.117g/100mL ，當接種量超過 6% 后，氨基酸態氮含量隨著接種量的增加而下降。因此，應將接種量控制在 4%～8% 之間。

2.6.1.3 鹽濃度的確定

由圖16可知，當鹽濃度為 7.5% 和 8.0% 時，發酵液中氨基酸態氮含量基本一致，達到最高值 0.125g/100mL 因此，應將鹽濃度控制在 7.5%～8.5% 之間。

2.6.2 響應面優化實驗設計及結果

在單因素實驗的基礎上，以發酵溫度 （A ）、接種量 （B） 、鹽濃度 （C） 為實驗因素，經查閱文獻和預實驗確定以發酵第55天時發酵體系中氨基酸態氮含量和感官評分為指標，進行響應面設計，確定醬油發酵最佳工藝，實驗結果見表6。

采用響應面法分析后，得到氨基酸態氮 （Y₁ ）和感官評價 （Y₂ ）與發酵溫度（A）、接種量 （B） 、鹽濃度 （C） 的二次回歸方程： Y₁=0.94+0. 011 25A-0.01B-0. 011 25C+ 0.025AB+0.0375AC+0.005BC-0.05375A²-0.05125B²- 0.08875C² ;Y₂=74.56-0.50A+0.4125B-2.5625C+ 0.525AB+1.025AC-1.705A²-0.23B²-4.33C² 。

2.6.3響應面實驗結果方差分析

表7以氨基酸態氮為評價指標回歸模型方差分析

Table7Analysis ofvariance ofregression modelwith amino acid nitrogen as the evaluation index

由表7可知，以氨基酸態氮含量為指標的回歸模型極顯著（ Plt;0. 01 且失擬項不顯著（ Pgt;0.05 ，回歸模型相關系數 表明模型的擬合度較好，實驗模型與實際情況有較高的擬合度，能夠準確反映因素與響應值之間的變化關系。通過比較 F 值可知影響醬醪氨基酸態氮含量的因素主次順序為發酵溫度 （A）= 鹽濃度 （C）gt; 接種量 （B） 。

表8以感官評分為評價指標回歸模型方差分析

由表8可知，以感官評分為指標的回歸模型極顯著 （Plt;0.01） 且失擬項不顯著 （Pgt;0.05） ，回歸模型相關系數 ，表明模型的擬合度較好，實驗模型與實際情況有較高的擬合度，能夠準確反映因素與響應值之間的變化關系。通過比較 F 值可知影響醬醪感官評分的因素主次順序為鹽濃度 （C）gt; 發酵溫度 （A）gt; 接種量 （B） 。

由圖17和圖18可知，3個因素在對應的實驗范圍內都有響應極值，通過觀察曲面圖的傾斜程度和等高線的形狀，可得出各因素之間的交互作用明顯，說明這幾組因素的交互作用對醬油發酵的影響較大。

2.6.4最佳工藝條件實驗驗證

采用Design-Expert10.O.3軟件對模型進行優化，得到醬油發酵最佳工藝參數為發酵溫度 40.824^°C 、接種量 5.9% 、鹽濃度 7.9% ，氨基酸態氮含量預測值為0.939g/100g ，感官評分預測值為74.9分。為了滿足實際操作的可行性，將最佳工藝參數調整為發酵溫度41^°C 、接種量 6% 、鹽濃度 8% ，在此條件下進行3次驗證實驗，得到醬醪中氨基酸態氮含量為 0.936g/100g 感官評分為78.4分，與預測值較接近，說明響應面分析得到的工藝參數較可靠，具有一定的可行性。

3結論

從妥甸醬油不同發酵階段的醬醪中分離篩選出6株產酶能力較強的菌株，分別為2株芽孢桿菌、2株乳酸菌和2株酵母菌，經過分子生物學鑒定，確定XT3-7-1為Bacillus pumilus，XT6-5為Bacillus amyloliquefaciens，RT15-6-1為Pediococcusacidilactici，RT5-3為Pediococcuspentosaceus，JT7-1為Torulasporadelbrueckii，JT7-3為Pichiakudriauzeuii。對6株菌的產酶能力、生長特性和感官評價進行分析后，發現JT7-3產氣能力最強，RT5-3生長活性最強，XT6-5產脂肪酶、 α -淀粉酶能力最強、感官評分最高，因此選擇XT6-5、RT5-3、JT7-3作為后續混菌發酵的目標菌株。

對篩選得到的3株菌驗證無拮抗作用后確認最佳配比，實驗結果：XT6-5、RT5-3和JT7-3的比例為3：3：2 時發酵液中氨基酸態氮含量最高，按照該比例制備混合菌泥并按 1：2 的比例與保護劑混合后于真空冷凍干燥機內凍干，以菌株存活情況為指標，確定脫脂乳粉 17% 、海藻糖 9% 、谷氨酸鈉 11% 為最適的保護劑，凍干存活率為 79.5% 。

將制備的發酵劑應用于醬油發酵，通過單因素實驗和響應面實驗設計優化醬油后發酵階段工藝，以發酵體系中氨基酸態氮含量和感官評分為指標，確定最佳工藝參數為發酵溫度 41°C 、接種量 6% 、鹽濃度8% ，在此條件下進行驗證實驗，發酵完成時醬醪的氨基酸態氮含量為 0.936g/100g ，感官評分為78.4分。

參考文獻：

[1]WEIQZ，WANG HB，CHENZX，et al.Profiling of dynamic changes in the microbial community during the soy sauce fermentation process[J].Applied Microbiology and Biotechnology， 2013，97（20）：9111.

[2]GAO X L， ZHAO X， HU F，et al. The latest advances on soysauce research in the past decade：emphasis on the advances inChina[J]. Food Research International，2023，173（2） ：113407.

[3]DEVANTHI P V P， GKATZIONIS K. Soy sauce fermentation：microorganisms，aroma formation，and process modification[J].Food Research International，2019，120（2）：364-374.

[4]趙謀明，陳濤，王靖雯，等.醬油發酵過程中細菌的分離鑒定及其特性與交互作用[J].現代食品科技，2020，36（5）：148-154，222.

[5]YI S H，HONG S P.Characteristics of bacterial strains withdesirable flavor compounds from Korean traditional fermentedsoybean paste（Doenjang）[J]. Molecules，2021，26（16） ：5067.

[6]盧超，陳景鮮，王國霞，等.一株高產中性蛋白酶菌株的篩選與誘變[J].中國飼料，2022（11）：30-35.

[7]李成龍，董倩，李喬惠，等.脂肪酶活力的測定方法及比較分析[J].湖北農業科學，2021，60（1）：323-328.

[8]FENG J， ZHAN X B，WANG D，et al. Identification andanalysis of the metabolic functions of a high-salt-toleranthalophilic aromatic yeast Candida etchellsii for soy sauceproductionJ].World Journal of Microbiologyamp;Biotechnology，2012，28（4）：1451-1458.

[9]史伊格，蒲丹丹，勇倩倩，等.10種特級醬油香氣差異分析[J].食品工業科技，2024，45（4）：250-260.

[10]JIANG XW，XUYT，YEJ，et al.Isolation，identificationand application on soy sauce fermentation flavor bacteria ofCS1. 03[J]. Journal of Food Science and Technology，2019，56（4）：2016-2026.

[11]胡家藝.低鹽混菌發酵韭黃醬工藝與品質研究[D].重慶：西南大學，2022.

[12]張偉，楊俊文，余冰艷，等.耐鹽植物乳桿菌的選育及其對高鹽稀態發酵醬油品質的影響[J].食品與發酵工業，2023，49（1）：86-94.

[13]趙建，郭本恒，陳衛，等.肽酶高產菌株的篩選及其生物學特性研究[J].乳業科學與技術，2007（2）：69-72.

[14]李虹宇，張公亮，侯紅漫，等.仿刺參相關微生物對致病燦爛弧菌的拮抗及機理研究[J].食品工業，2012，33（9）：117-120.

[15]徐德陽，王莉莉，杜春梅.微生物共培養技術的研究進展[J].微生物學報，2015，55（9）：1089-1096.

[16]梁雨晴.乳酸菌與釀酒酵母聯合發酵提高淡豆豉品質的研究[D].沈陽：沈陽農業大學，2023.

[17]王旭丹.乳酸菌的篩選及直投式酸菜發酵劑的研制[D].長春：吉林農業大學，2020.

[18]李佳讓.復合發酵劑特性及菌粉制備工藝研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2023.

[19]嚴美婷.直投式納豆發酵菌劑的制備及其應用研究[D].南昌：江西農業大學，2019.