廣東省桐花樹葉尖枯病病原菌鑒定及拮抗細菌篩選

中圖分類號：S436.65 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2025）03-0139-12

桐花樹屬于紫金牛科 （Myrsinaceae）桐花樹屬（Aegicer），是常見的紅樹植物之一[1]。2000 年一2017年間我國紅樹林面積由約2.2萬 hm² 增長至3.4萬 hm^2[2-3] 。桐花樹是近年人工恢復紅樹林面積的主要栽種樹種之一。

目前，已報道且有癥狀描述的桐花樹病害有12種，分別是桐花樹葉斑病，已鑒定的病原為鏈格孢屬（AIternariasp.）、茄葡霉柄菌（Stemphyliumsolani）和菌核青霉（Penicilliumsclerotiorum）。

不同病原菌引起的葉斑病癥狀不相同。茄葡霉柄菌引起的葉斑病，初期葉片上出現圓形或近圓形帶有明顯黃色暈圈的黃褐色小斑，隨后病斑逐漸擴大成近圓形或橢圓形大斑，嚴重的可擴展整個葉片，后期病葉枯黃、掉落[4；菌核青霉引起的葉斑病癥狀為小而多的凹陷病斑，病斑周圍無暈圈[5。桐花樹灰斑病，病原菌為互隔交鏈孢（AIternariaalternate），受害葉片癥狀表現為黃色小點，病斑慢慢擴大后呈圓形、橢圓形至不規則狀，病斑的顏色為褐色，后期多個病斑連片，造成整個葉片枯死掉落。桐花樹赤斑病，病原菌為棒狀擬盤多毛孢（Neop.clavispora），受害葉片主要癥狀為發病初期病斑為紅褐色，近圓形或不規則形小點，嚴重時，病斑融合成大病斑，使整個葉片成棕褐色、干枯凋亡。桐花樹煤污病，受害葉片主要癥狀為，發病初期是黑色的點狀物，慢慢的點狀物逐漸擴展成圓形或不規則形菌斑，隨著菌斑的不斷擴展，菌斑也逐漸變厚，在葉片上分布有一個或多個菌斑，病害發展到后期，整張葉片都被菌斑覆蓋，已鑒定的病原菌有，番荔枝煤炱菌[8]（Capnodiumanona）、杜莖山星盾炱（Asterinamaesae）、盾殼霉屬（Coniothyriumsp.）、散播煙霉（Fumagovagans）、球孢枝孢（Gladosporiumsphaerospermum）、蜒曲煙孢菌（Leptoxyphiumfumago）、火紅頭孢枝頂孢（Acremoniumrutilum）和柑橘灰色疣孢菌（Zasmidiumcitrigriseum）[6]

近年來，在廣東湛江紅樹林自然保護區，發現部分桐花樹葉片邊緣焦枯，局部林地發病株率平均為 51% （ n=100 ），病株發病葉片率平均為 38.4% 。在已經報道的桐花樹葉部病害中，未見類似癥狀。為有效控制該病害的危害，明確病原菌種類是十分必要的。因此，本研究通過形態特征、多基因系統發育分析以及致病性測定，明確在湛江市引起桐花樹葉片邊緣焦枯的致病因子，并進行病原菌生物學特性研究和拮抗菌篩選，以期為該病害防治提供參考依據。

材料與方法

1.1 供試材料

桐花樹葉尖枯病樣品取自廣東省湛江紅樹林保護區（ 109.76^°E～114.93^°E ， 22.72^°N～22.76^°N ）。致病性測定所用桐花樹1年生植株均自珠海紅樹林苗木公司。生物學特性研究供試菌株-THJK1A3為本研究分離純化所得。生防菌平板拮抗試驗供試菌株由本實驗室保存：阿氏腸桿菌79（Enterobacterasburiae）、泛菌B1N2-1（Pantoeaanthophila）、鞘氨醇單胞菌T3（Sphingomonasmelonis）、米氏假單胞菌T1（Pseudomonasoryzihabitans）。華南農業大學植物保護學院真菌研究室舒燦偉博士惠贈了解淀粉芽孢桿菌68（B.amyloliquefaciens）。

1.2 試驗試劑

PCR產物快速膠回收試劑盒（D205-01），Direct-Load StarMarker D2000（ M122-05），StarGreen核酸染料（E107-01）， 50× TAEDNAElectrophoresisBuffer（E102-50）購自北京康潤生物技術有限責任公司； 10% 次氯酸鈉、無水乙醇、 75% 乙醇購于天津市富宇精細化工有限公司；注射器、 NH₄NO₃ 、尿素、丙氨酸、賴氨酸、乳糖、瓊脂粉、培養皿等常用試劑及其他生物學試驗耗材購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；本試驗所用PCR擴增引物合成和核酸測序由北京擎科生物科技有限公司完成。擴增上下游引物序列如表1所示。根據《植病研究方法》[9]和《植物病理學實驗技術》[10]制備試驗所需培養基。

1.3 方法

1.3.1 林間病害癥狀觀察和病樣采集 2019年5月一2023年5月，調查了廣東省湛江市和惠

州市等紅樹林保護區的桐花樹病害的發生狀況和癥 狀特點。對于特定病害的發病林，隨機選取100 株紅樹植物，統計發病株率和病葉率，觀察記錄葉

片上不同發病時期病斑的特點。采集典型的發病葉片，裝入采樣袋中，注明采集時間、采集地點、寄主名稱和采集人。

式中： γ 為發病株率， n 為發病植株數， N 為調查植株數。

式中： ψ 為病株病葉率，W為病株發病葉片數，W為發病植株總葉片數。

1.3.2病原菌的分離與純化取典型病斑組織塊（ 5mm×5mm ）表面消毒后，在PDA培養基上進行組織分離與病原菌純化，并統計不同形態分離物的分離頻率。

1.3.3病原菌的致病性測定將分離純化后的菌株接種到PDA培養基上， 28^°C 恒溫培養。使用血球計數板調整分生孢子濃度在 10⁶ 個 ?mL^-1 。選取健康且生長一致的植株作為接種材料。接種時，使用浸有 75% 酒精的無菌脫脂棉球輕輕擦拭植株葉片后，用浸有滅菌水的無菌脫脂棉球擦洗3次，再使用滅菌接種針刺傷接種葉片。接種方法：吸取 5μL 的分生孢子懸浮液（ 10⁶ 個 ?mL^-1 ）接種于葉片刺傷點，以等量無菌水接種為對照。每個處理接種 5～6 個葉片，重復3次。接種期間觀察葉片的發病情況，對發病葉片拍照記錄。使用1.2.2中的織組分離法對發病葉片進行再分離和鑒定，若分離得到的菌株與接種菌株一致即可確定為病原菌。1.3.4病原菌鑒定在 28^°C 黑暗培養，觀察菌落特征（菌落的顏色、質地、高度、邊緣、表面紋飾、菌絲的疏密程度和氣生性），使用CanonPowerShotA640相機拍照記錄。待菌落產孢后，觀察分生孢子、分生孢子梗、產孢細胞和子囊等結構，再隨機選取100個分生孢子測量孢子大小。查閱相關文獻[12]進行形態學鑒定。

使用ITS1/4，Bt2a/Bt2b和TEF1＼～728F/TEF1＼～986R共3對引物（引物序列見表1），擴增桐花樹葉尖枯病病原菌菌株的ITS、TUB2和TEF1基因序列。PCR擴增反應體系均為 50μL ，其中 2x PCRMasterMix25μL、上下游引物各2μL、DNA模板2μL， ddH₂O 補足至 50μL ，PCR反應程序見表2。對測序序列進行同源性比較，使用TBtools3.0軟件下載同源性較高的模式菌株和已發表鑒定的菌株作為參考序列（表3）。使用MEGA.11中的ClustalW對序列進行比對，使用Phylosuite.6中的Gblocks 和 Sequens concatenate 對序列進行剪切和連接，利用MEGA.11軟件的尋找最優模型，使用最大簡約法（Maximumparsimony）進行1000次bootstrapes重復建立系統發育樹，建樹所用序列登錄號如表3。

1.4 菌落生長速率測定

以不同培養基、溫度、pH、光照、碳源和氮源為變量，將直徑為 5mm 的菌餅接種于供試培養基平板（ 9cm ）的中央，置于培養箱中培養，研究不同培養條件對代表菌株THJK1A3菌落生長速率的影響。供試培養基分別為查氏培養基（CA），玉米瓊脂培養基（CMM）、燕麥瓊脂培養基（OA）、水瓊脂培養基（WA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）；供試溫度分別是5、10、15、20、25、28、30、35和 40^°C 共9個溫度梯度；用 1mol?L^-1 的NaCI和 1mol?L^-1 的NaOH調節pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、

11.0、12.0共9個梯度；光照條件設置全光照、全黑暗和光暗交替（ 12h 光照 112h 黑暗）3個處理；將查氏培養基中的蔗糖用等量替換的方法換成葡萄糖、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉或乳糖，制成不同碳源培養基，以不含碳源培養基作為對照；將查氏培養基中的硝酸鈉用等量替換的方法換成賴氨酸、甘氨酸、硝酸銨、蛋白陳、牛肉膏、酵母粉或尿素，制成不同氮源培養基，以不含氮源培養基作為對照。試驗中除不同溫度對菌落生長速率的影響外，其余培養條件均為 25°C 、光暗交替（ 12h 光照 112h 黑暗）；除不同培養基和碳氮源對菌落生長速率的影響外，其余供試培養基均為PDA培養基。試驗中接種所用菌塊直徑均為 5min ，每個處理重復3次。從第5d開始觀察培養基中菌落的生長情況，采用\"十字交叉法\"測量菌落平均直徑，直到對照長滿9cm培養皿結束，按照公式3計算其菌落生長速率：

式中， G 為菌落生長速率， D 為處理菌落直徑/cm， t 為培養時間/d。

1.5 生防細菌的篩選

將本課題組前期篩選到5株具有生防潛力的細菌在LB培養基中 28^°C ，280rpm過夜培養。打取各病原菌菌餅（ 6mm ）接種于PDA培養基中央，在其四周 2.0cm 處滴 2μι 細菌菌液，以單獨接種病原菌為空白對照，在 28°C 培養箱中倒置培養，待對照組長滿全血后，使用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落平均生長直徑，并做好記錄[14]。拍照并記錄抑菌效果。每個處理4次重復。

式中： R 為菌落抑制率， d 為對照菌落直徑/cm， D 為處理菌落直徑/cm。

1.6 數理統計分析方法

使用SPSSStatistics22.0統計分析軟件對所得試驗數據進行數據處理，采用單因素方差分析（One-WayAnova）計算平均值和標準誤，采用鄧肯氏新復極差法（Duncan's newmultiple rangetest，DMRT）進行多重比較，在 plt;0.05 水平上進行分析處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 桐花樹葉尖枯病林間發病癥狀

桐花樹葉尖枯病發病株率平均為 51% （ n= 100），病株發病葉片率平均為 38.4% 。桐花樹葉尖枯病發病初期葉尖部褪綠，失水后變為灰褐色，病健交界明顯，發病部位稍凹陷，焦枯變褐，后期病斑由尖部邊緣向葉面蔓延，葉片干枯卷曲，最終導致葉片脫落（圖1）。桐花樹葉尖部發病的癥狀未見報道。

2.2 桐花樹葉尖枯病病原菌分離與致病性測定

對桐花葉尖枯病典型發病葉片進行組織分離，純化后獲得26個分離菌株，均為真菌。根據形態特征初步將其分為4類真菌，分別編號THJK1、THJK2、THJK3和THJK4。其中THJK1，分離頻率達到 80.76% ，為優勢菌。

2.3 桐花樹葉尖枯病病原菌菌株THJK1A3形態 特征

28^°C 條件下該菌在PDA培養基上生長速度較快，3d即可長滿培養基，培養基正面氣生菌絲初期為白色（圖3a），隨后變成灰色（圖3c），背面初期白色（圖3b），隨后菌落中心變為黑色（圖3d）。菌絲有隔，厚垣孢子鏈狀（圖3e＼～h）。該菌在SNA培養基、紫外誘導和SNA + 滅菌松針培養基等多種誘導條件下均不產孢，僅當菌絲接種到桐花樹葉片上才觀察到分生孢子。分生孢子橢圓形至梭形，薄壁半透明（圖 31～m ），大小為（ 15.19～ 19.66） × （4.59＼～6.07） μm （ n=100 ）。根據形態特征初步將桐花樹葉尖枯病病原菌鑒定為新殼梭孢屬（Neofusicoccumsp.）。

2.4 桐花樹葉尖枯病病原菌分子系統學鑒定

選取病原菌THJK1的3個菌株（THJK1A3、THJK1A9和THJK1A16）進行分子系統學鑒定，擴增其ITS、TUB2和TEF1基因序列（圖4），并

注：該菌在SNA培養基，紫外誘導和SNA + 滅菌松針培養基等多種誘導條件下均不產孢，僅當菌絲塊接到桐花樹葉片上才觀察到分生孢子；（a-b）PDA培養基 28^°C 培養3d菌落形態（a：菌落正面；b：菌落背面）；（ c～d ）PDA培養基 28‰ 培養5d菌落形態（c：菌落正面；d：菌落背面）；（ e～h ）厚垣孢子；（ i～m ）分生孢子；Scalebar =10μm

圖4桐花樹葉尖枯病病原菌各菌株的PCR產物電泳圖

Fig.4Electrophoresis of PCR amplification products of various strains of Aegiceras corniculatum leaf blight pathogen

將上述基因序列提交至NCBI，獲得Genbank登錄號（表3），同源性比對發現菌株THJK1A3、THJK1A9和THJK1A16擴增的基因序列均與新殼梭孢菌的相似性最高，下載該屬模式菌株和已發表鑒定的23個菌株序列，以Botryospharriadothidea和B.corticis為外群，構建ITS、TUB2和TEF1單基因和多基因聯合進化樹。結果表明病原菌菌株THJK1A3、 THJK1A9和THJK1A16與N.ribis聚在同一個分支，節點自展支持率為99% （圖5）。根據形態學鑒定和多基因系統發育分析結果，最終將桐花樹尖枯病病原菌鑒定為新殼梭孢菌（N.ribis）。

2.5 新殼梭孢菌生物學特性

2.5.1非營養因子對新殼梭孢菌生長的影響新殼梭孢菌可在 10～35°C 的環境中生長， 5°C 和40^°C 條件下菌絲不能生長。最適生長溫度為25°C 、 28°C 和 30°C ，菌落平均直徑分別為75.83±1.05mm 、 77.68±1.85mm 和 75.94± 1.97mm ，三者之間無顯著差異。其次是 20^°C ，菌落平均直徑為 69.08±8.85mm 。但該菌的適宜生長溫度范圍較窄，溫度低于 20°C 或高于 30^°C 時，菌絲生長顯著受到抑制（圖6a）。不同光照條件下菌絲生長速率無顯著差異（圖6b）。新殼梭孢菌對pH適應范圍較廣，在pH值為 4～12 條件下均能正常生長，pH值為 4～11 時菌落平均直徑無顯著差異，pH值為4時，平均菌落直徑達到最大為 82.36±1.04mm ，pH值為12時菌絲生長顯著受到抑制，菌落平均直徑僅為 42.38±2.12mm （圖6c）。

2.5.2營養因子對新殼梭孢菌生長的影響在供試的8種不同碳源中，菌絲生長都較為稀疏。最適碳源為葡萄糖，平均菌落直徑為 63.75±5.16mm 其次為可溶性淀粉，平均菌落直徑為 58.15± 5.32mm （圖7a）。供試的7種不同氮源中，利用率最高的是硝酸銨和蛋白肺，平均菌落直徑為70.90±1.77mm 和 70.68±1.13mm ，二者之間無顯著差異，其次為賴氨酸，平均菌落直徑是66.68±3.38mm ，利用率最低的為含尿素的培養基，菌絲幾乎不生長（圖7b）。最適培養基為PDA培養基，菌落平均直徑為 82.35±0.96mm （圖7c）。

2.6 生防細菌對新殼梭孢菌的抑制效果

本文對課題組前期篩選的5株具有生防潛力細菌進行拮抗實驗（圖8）。在 28^°C ，培養2d后，發現解淀粉芽孢桿菌菌株68對菌株THJK1A3的菌絲生長抑制率達到 68.71%±2.56% （表4）。

3 討論

3.1 桐花樹葉尖枯病癥狀

桐花樹葉部病害多為葉片中央出現病斑，本文發現的桐花樹葉尖枯病癥狀為葉尖邊緣焦枯變褐，這一癥狀尚未有學者報道。為探究其發病原因，我們首先是現場挖根，根部生長正常，未發現壞死現象；然后考慮到可能是缺水引起，可是桐花

3.2 新殼梭孢菌的鑒定及其所引起的植物病害

在桐花樹葉尖枯病病原菌株THJK1A3的形態學鑒定中，本文嘗試了SNA培養基、紫外光照射和 SNA+ 滅菌松針培養基等誘導桐花樹尖枯病病原菌產孢，都只觀察到厚垣孢子，并未觀察到分生孢子。當把該菌接到桐花樹葉片上，可以觀察到分生孢子。根據病原菌的菌落和孢子形態，鑒定為新

殼梭孢屬。在此基礎上，選用ITS、TUB2和TEF1基因進行系統發育分析，將桐花樹葉尖枯病病原菌鑒定為新殼梭孢菌。

新殼梭孢菌是一種重要的植物病原真菌，主要引起熱帶和亞熱作物葉片病害。在馬來西亞，新殼梭孢菌可引起橡膠葉枯病[15-16]，引起蘋果和草莓采后儲藏腐爛和藍莓莖枯病[17-18]，在國內有報道可引起楊樹潰瘍病[19]。本文中新殼梭孢菌引起的桐花樹葉尖枯病為國內外首次報道。

對新殼梭孢菌的生物學特性研究目前暫未見報道，因此該屬代表菌種小新殼梭孢菌（Neofusicoccumparvum）進行比較分析。本研究中該菌的的最適生長溫度為 25～30^°C ，這與多位學者分別分離自核桃枝枯病、裂葉喜林芋葉斑病和油桐黑斑病的小新殼梭孢菌的研究結果一致[20-22]，但是本文中的新殼梭孢菌在溫度低于20^°C 和高于 30^°C 時顯著抑制菌絲生長，這與以上學者研究結果不同，可能是本文中的新殼梭孢菌寄主在海邊，晝夜溫差小，而導致該菌的適宜生長溫度范圍較窄。本文中新殼梭孢菌對pH適應范圍較廣，最適pH值為 4～11 ，這與吳松等[23]分離自樟樹潰瘍病的小新殼梭孢最適pH為7結果不同，這可能是由于本文中新殼梭孢菌的寄主植物生長在長期水淹狀態下，會產生硫酸根離子導致周圍環境偏酸性[24]

3.3 生防菌的篩選

隨著人們生態意識的增強，急需開展對紅樹植物病害的生物防治制劑。解淀粉芽孢桿菌分布于土壤和植物組織中，生長繁殖快，且具有芽孢結構可以適應各種極端環境，廣泛應用于防治病原菌、動物生產和水產養殖等[25-26]。已有報道解淀粉芽孢桿菌對西瓜枯萎病、棗黑斑病和黃瓜灰霉病等多種病原菌具有較強的抑制作用[27-29]，但對紅樹植物病害的防治未見學者報道。本文通過對課題組前期分離的5株具有生防潛力的細菌進行平板拮抗試驗，發現解淀粉芽孢桿菌菌株68對從紅樹植物葉部病害分離的新殼梭孢菌抑制率是 68.71%±2.56% 68解淀粉芽孢桿菌菌株具有防治紅樹植物病害的優良生防菌潛力。但該菌在紅樹植物中的定殖和林間防治效果仍有待進一步驗證。

4結論

首次報道新殼梭孢菌（Neofusicoccumribis）是引起廣東省湛江市桐花樹葉尖枯病的致病菌。該菌最適生長溫度 25～30°C ，對pH適應范圍較廣，在PDA培養基、碳源為蔗糖和可溶性淀粉、氮源為牛肉膏和酵母粉和黑暗條件下有利于菌絲生長。首次發現解淀粉芽孢桿菌68對菌株THJK1A3的拮抗效果較好。

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139.

ldentification of Neofusicoccum ribis Causing Leaf Tip Blight on Aegiceras corniculatum and Screening of Its Antagonistic Bacteria in Guangdong Province

YUAN Yong-qiang1， JI Wen-xia1，MI Ren-jun2， ZHOU Shun1，MA Hai-bin3，LIU Song-song1， LI Zhi-guang1，WANG Fu-sheng1， RAO Xue-qin1，WAQAR Ahmed'，WANG Xin-rong1 （1.CollegeofPlantProtection，South ChinaAgricultural UniversityGuangdongProvinceKeyLaboratoryofMicrobialSignals andDisease Control，Guangzhou510642，Guangdong，China;2.ForestryBureauofChenxiCounty，Huaihua419500， Hunan， China;3.Research Institute of Tropical Forestry， Chinese Academy of Forestry， Guangzhou510642，Guangdong，China）

Abstract： [Objective]To identify the pathogen causing tip blight on Aegiceras corniculatum in Zhanjiang City，Guangdong Province，China.Thestudyinvolveselucidatingthebiologicaland molecularcharacteristicsof thepathogenandscreening forantagonistic bacteria，aiming toprovideabasisfor diseasepreventionand control.[Methods] Isolationand purification of the pathogen were carried out using infected tissuesamplesand single spores.The isolated fungal strainswere identified throughmorphological observations and phylogenetic analysis of concatenated gene sequences， including ITS， TEF-1a and TUB2. Biologicalcharacteristicssuchasgrowthrate，colony diameter，and growth morphology indiferentenvironmental conditions wereassessed.Pathogenicitywasconfirmed byartificial inoculationondetached leaves ofA.corniculatum.Antagonistic bacteria were screened using dual cultureassays to identifypotential candidates for controlling leaf tip blight.[[Results]The isolated fungi displayed rapid growth on PDA medium at 28^°C ，fully covering the Petri dish within3 days.The aerial mycelium initially appeared whiteamd later turnedgray，while theunderside transitioned fromwhite toa black center.Microscopic observationrevealedseptate hyphae forming thick-walled，sporechain-likestructures.Theconidiawereovaltospindleshaped， thin-walled，semi-transparent， and measured（ （15.19～19.66）×（4.59～6.07）μm（n=100） .Morphological characteristics and phylogenetic analysis identified the strain as N. ribis.Artificial inoculation with theisolatecaused symptoms identical to those observed innaturally infected leaves.The optimal growth temperature for the N. ribis strain THJK1A3 was 28^°C ，with a narrow growth range; hyphal growth was significantly inhibited below 20^°C or above 30^°C .The optimal pH condition was determined to be 4. Finally，Bacillusamyloliquefaciens 68demonstrateda 68.71±2.56% inhibition of the hyphal growth of strain THJK1A3，suggesting itspotential asa promising biocontrol agent for practical application.[Conclusion] Thecausative agent of tip blight inA.corniculatum in Zhanjiang City，Guangdong Province， China，was identifiedasN.ribisstrainTHJK1A3.AdditionalyB.amyloliquefaciens68demonstratedstrongantagonisticactivityagainstTHJK1A3，making ita promising candidate for the biological control of this disease.

Keywords：Aegiceras corniculatum tip blight; pathogen identification; phylogeneticanalysis; biologica control; antagonistic bacteria

（責任編輯：崔貝）