一例北美型和歐洲型豬藍耳病病毒混合感染的診斷

豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductive andRespiratorySyndrome，PRRS），俗稱豬藍耳病，臨床上主要表現為仔豬呼吸困難、生長緩慢、共濟失調；母豬流產、產死胎、木乃伊胎等癥狀，是一種高度傳染性疾病，且具有較高的致病性。豬藍耳病的致病病原為藍耳病病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV），其基因變異和重組的發生率極高，因此，豬藍耳病在我國乃至世界都是防控的難點。

2024年3月，廣東省河源市某豬場引進豬苗2748頭，飼養日齡達82日齡時，豬陸續出現喘氣、呼吸障礙和死亡，其中發病568頭，發病率約 20.7% ；病死170頭，病死率約30% 。為減少豬場損失，確定其發病原因，養殖戶送檢樣品通過實驗室檢測分析進行診斷。

1材料與方法

1.1樣品來源

對豬場送檢三頭豬的血液進行檢測，待血清析出后，將血清轉移至1.5mLEP管中， 10000r/min 離心 ?5min ，取出上清液保存至 .80^qC 環境中備用。

1.2歐洲型和北美型豬藍耳病病毒二重PCR檢測

根據反應體系（ 25μL ）：PrimeScript 1 step Enzyme Mix1μL ， 2×1 step Buffer 12.5μL ，引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F、EU-ORF5 ?R^[2] （ 10μmolΛ ）各 0.5μL ，模板3 μL 無菌超純水 .6.5μL 反應條件如下： 50^qC 反轉錄 30min ： 95^°C 預變性3min； 95°C 變性 20s ， 58^°C 退火 20s ， 72% 延伸 60s 共計35個循環； 72% 終延伸5 imin_c 。將PCR產物進行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析儀拍照保存分析。

1.3序列克隆

將確定為目標樣品的條帶進行切膠，將擴增出的豬藍耳病病毒陽性樣品PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4序列對比分析

使用megalign軟件進行序列比對，使用MEGA軟件、Chiplot繪制進化樹，進行遺傳進化分析。

2結果

2.1PRRSV二重PCR擴增結果

針對3份血液樣品進行歐洲型和北美型豬藍耳病病毒二重RT-PCR擴增（圖1），結果顯示，1、3號樣品中均擴增得到900bp大小的目的條帶，為北美型藍耳病病毒序列（包括ORF5全長基因序列）；2、3號樣品擴增含有1036bp大小的片段，為歐洲型豬藍耳病病毒序列（包括ORF5全長基因序列），其中3號樣品為歐洲型豬藍耳病病毒與北美型豬藍耳病病毒混合感染。

2.2同源性分析

將獲得的4條GP5基因序列HY-20240319-GP5-1（ 603bp ）HY-20240319-GP5-3（ 603bp ）、HY-20240319-Eu-GP5-2（ 606bp ）和HY-20240319-Eu-GP5-3（ 606bp ）與參考株進行同源性分析（圖2）。其中，HY-20240319-Eu-GP5-2和HY-20240319-Eu-GP5-3與歐洲型豬藍耳病病毒毒株BJEU06-1相似度最高，分別為 85.8% 和 186.0% ；HY-20240319-GP5-1、HY-20240319-GP5-3與北美型豬藍耳病病毒毒株QYYZ相似度最高，分別為 89.1% 和 88.9% ，詳見圖2。

2.3遺傳進化分析

將測序所得PRRSV毒株序列基于ORF5序列構建遺傳進化樹（圖3和圖4），所得序列HY-20240319-Eu-GP5-2和HY-20240319-Eu-GP5-3在同一個分支上，且與GDHY-3親緣關系較近，同屬于歐洲型毒株（圖3）；HY-20240319-GP5-1和HY-20240319-GP5-3與QYYZ等毒株在同一個大分支上，親緣關系較近，同屬于北美型毒株譜系3（圖4）。

3討論

豬藍耳病是困擾世界養豬業的重要疾病，如今給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。引起該病的傳染性病原為豬藍耳病病毒（PRRSV），PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。根據病毒的抗原性、基因組及致病性差異可分為2個型：歐洲型（PRRSV-1）以LV株為代表，主要分布在歐洲；北美型（PRRSV-2）以VR2332株為代表，主要分布在美洲和亞洲PRRSV-1和PRRSV-2雖然可引起感染豬出現相似的臨床癥狀，但兩者基因組核苷酸序列存在較大差異，同源性僅有50%～60%^[3] 。我國報道出現最多的是北美型，歐洲型相對少見[4]。盡管實施大規模疫苗接種手段，但該疾病仍在世界范圍內造成巨大的經濟損失。PRRSV具有變異速度快、極易發生重組的特點，導致其不斷演化產生大量新毒株[5目前，國內有關豬藍耳病歐洲型和北美型毒株混合感染的病例較少，但其造成的影響不容忽視。

PRRSV基因組全長約15kb，包含至少10個開發閱讀框，編碼8個結構蛋白（GP5、M、N、GP2a、E、GP3、GP4、GP5a）和14個非結構蛋白（NSP1至NSP14）[。PRRSV北美型和歐洲型均能在機體內、外引起細胞凋亡。而PRRSV所引發的細胞凋亡作用與GP5蛋白密切聯系[]。GP5是PRRSV結構蛋白中最易變異的區域之一，并存在多種突變類型，包括氨基酸的替換、缺失和插入。GP5蛋白常用于遺傳進化分析，且在病毒入侵、吸附、增殖及誘導宿主的中和抗體產生過程中發揮重要作用，對于PRRSV的致病性、診斷、預防和控制具有重要意義[]。因此，本文采用二重RT-PCR擴增三份送檢血清，通過對測序所得GP5基因的核昔酸序列同源性分析和遺傳進化分析。結果表明：HY-20240319-GP5-1和HY-20240319-GP5-3屬于PRRSV-2（北美型）豬藍耳病毒Lineage3（QYYZ-like）亞型毒株；HY-20240319-Eu-GP5-2和HY-20240319-Eu-GP5-3屬于PRRSV-1（歐洲型）毒株。

該豬場存在PRRSV-1（歐洲型）和PRRSV-2（北美型）毒株混合感染，可能是購買豬苗時，沒有做到及時的豬藍耳病檢疫，造成混群后PRRSV-1和PRRSV-2相互感染傳播，引起重大的經濟損失。本文的啟示是在今后購買豬苗時，一定要做好豬藍耳病等重要疫病的檢測檢疫，尤其是購買大量豬苗時，要做到分圈飼養、科學管理；實時關注疫病流行趨勢，發現疑似藍耳病癥狀出現立即隔離，并采集血液組織樣品進行檢測，一經確診嚴格進行撲殺及無害化處理，并對豬場進行全面消毒，避免重大疫病暴發，最大程度上保障豬群健康，降低疫病造成的經濟損失。

結語

豬藍耳病在我國流行近三十年，至今仍未能得到有效控制。如今我國養豬行業中，多為規模化養豬場，這使得豬場一旦感染藍耳病病毒就會迅速傳播，其重組、變異的速度也是越來越快，新的變異株和重組毒株的出現導致疫苗保護效力受到影響，使流行難以控制，最終對豬場的生產和經濟造成影響。自1996年我國首次報道CH-1a株以來，我國所報道病例主要是感染北美型豬藍耳病病毒株，同時感染歐洲型和北美型豬藍耳病病毒的病例相對較少。本文對廣東省河源市某豬場送檢的血液樣品進行檢測，發現該豬場感染豬藍耳病病毒，并檢測到存在PRRSV-1（歐洲型）和PRRSV-2（北美型）毒株混合感染，對豬場造成了較大的經濟損失。根據回顧性調查發現，豬場在選購豬苗時，從多家養殖場選購，并沒有執行嚴格的豬藍耳病檢疫，故在豬苗混養后一段時間后，豬群發生豬藍耳病，造成較大的經濟損失。針對藍耳病的防控，豬場應采用規范的免疫程序，定期免疫，定期抽檢、監測，提高豬場生物安全，并密切關注豬藍耳病病毒流行趨勢和重組變異情況，提前做好預防措施，從而降低感染風險減少經濟損失。

參考文獻：

[1]趙自亮，左妤祺，趙康燕，等.2021一2022年川渝部分地區PRRSV分子流行病學及ORF5遺傳特征分析[J].中國獸醫學報，2024，44（03）：437-444.

[2]周霞.華南部分地區PRRSV和PCV的分子流行病學研究[D].廣州：華南農業大學，2017.

[3]孫琪，許滸，李超，等.歐洲型和美洲型PRRSV的最新分類及其差異的研究進展[J].中國預防獸醫學報，2022，44（09）：1006-1013.

[4]高雅，武欣欣，蔣小玲，等.美洲型與歐洲型PRRSV雙重RT-PCR檢測方法的建立[J].北京農學院學報，2021，36（04）：76-80.

[5]楊漢春，周磊.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異與演化[J].生命科學，2016，28（03）：325-336.

[6]吳瑕，勞夢琴，譚祥梅，等.2017—2020年我國部分地區PRRSV流行毒株變異情況分析[J].中國動物傳染病學報，2021，29（05）：64-74.

[7]周洛譯，孫躍峰，侯石桐，等.豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的發展現狀及mRNA疫苗前景[J].動物醫學進展，2023，44（12）：93-98.

[8]姚睿智，樊宏超，鄧清華，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白在疫苗上的應用研究進展[J].畜牧獸醫科技信息，2016，（03）：4-6.

[9]王輝.近幾年我國PRRSV進化趨勢及其對防控策略的影響[J].中國動物傳染病學報，2021，29（01）：114-118.

[10]王安冉，王桂花，王樹茂，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒糖蛋白5的研究進展[J].中國動物傳染病學報，2024（08）：1-9.

收稿日期：2025-03-16

作者簡介：賈晗鐸（2002—），男，漢族，在讀碩士。研究方向：豬傳染病。*通訊作者：張偉（1979—），男，漢族，碩士，高級實驗師。研究方向：動物疫苗研發與疫病防控。