甘藍型油菜OSCA家族基因鑒定及其在非生物脅迫下的表達分析

中圖分類號：S656.4 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2025）06-1050-13

Abstract：Hyperosmolarity-gate calcium-permeable channels（OSCA）playa significant role in the response of plants to abiotic stress.To elucidate the response mechanism of BnaOSCA family members under abiotic stress，this study identified 37 OSCA genes from the whole genome of Brassica napus and analyzed the gene structure，protein properties，and expresion paterns.The results showed that these 37 OSCA genes were unevenly distributed on 13 chromosomes and could bedivided intothreesubfamilies.Membersof thesamesubfamilyhadconservedgenestructuresandconserved motifs，and thepromoter regions of BnaOSCA family genes contained avariety of _cis -actingelementsrelated to abioticstressand hormoneresponses.The collinearity analysisresults indicatedthat gene loss ocurredduring theevolutionof the BnaOSCA family genes，and gene family expansion also took place.Undersaltanddrought stress，therelative expresion levelsof BnaOSCA family genes varied，indicating that BnaOSCA family genes played diferent regulatory roles inthe response to abiotic stress.This study provides a basis for further perfecting the regulatory network of BnaOSCA family genes.

Key words： Brassica napus；OSCA family genes；drought stress；salt stress；expression pattern

鈣通透性陽離子通道蛋白OSCA（Hyperosmolar-ity-gatecalcium-permeablechannels）是一類非選擇性通道，作為植物中首個被鑒定的滲透壓感受型鈣離子通道，在感知胞外滲透壓變化和調控植物生長發育中發揮重要作用[1-3]

在模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）中，已鑒定出15個OSCA家族成員，這些成員具有高度保守的氨基酸序列，并攜帶與植物抗逆性相關的DUF221結構域[45]。在大豆（Glycine max）中，已鑒定出 21個OSCA家族成員，其中 GmOSCA3.2 基因響應干旱脅迫，干旱時在葉片、花和根系中的相對表達量上升， GmOSCA3.I 基因響應堿脅迫[6]。在水稻（Oryzasativa）中，已鑒定出12個OSCA家族成員，在NaCl、ABA和PEG處理后，10個OSCA基因呈現差異表達[]。大麥（Hordeumvul-gare）中，已鑒定出14個OSCA家族成員，在干旱脅迫下，HvOSCA03HvOSCAO5和HvOSCA13相對表達量上升[8]。茄屬植物（Solanum habrochaites）中的11個OSCA家族成員能夠響應干旱脅迫、低溫脅迫和脫落酸處理[9]。這些研究結果表明，OSCA家族在植物逆境脅迫響應過程中具有重要作用。

甘藍型油菜是全球四大主要油料作物之一，其生長易受到干旱脅迫、鹽堿脅迫和低溫脅迫的影響。在擬南芥、大豆、番茄[1]和辣椒[1]等植物中，OSCA已被深入研究，但甘藍型油菜BnaOSCA家族的研究尚未見報道。本研究擬利用生物信息學方法對油菜BnaOSCA家族成員進行系統分析，同時探究BnaOSCA基因在鹽脅迫和干旱脅下的表達模式。

1材料與方法

1.1 數據獲取

從BnPIR數據庫中下載甘藍型油菜（Brassicanapus）的基因組序列、蛋白質氨基酸序列和基因注釋文件[12]，從 EnsemblPlants（https：//plants.ensem-bl.org/index.html）獲取了白菜（Brassicarapa）和甘藍（Brassica oleracea）的基因組序列和注釋信息[13]；從TAIR數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥（Arabidopsisthaliana） OSCA1-15蛋白氨基酸序列[14]

1.2 OSCA家族成員鑒定

在BnPIR數據庫中篩選擬南芥AtOSCA1-15蛋白的同源氨基酸序列。利用NCBI（https：//www.nc-bi.nlm.nih.gov/cdd）和 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線工具檢測候選序列是否含有OSCA特征的DUF221結構域，剔除無典型結構域的序列，最終確定甘藍型油菜OSCA家族成員。采用相同方法鑒定白菜和甘藍的OSCA家族成員。

1.3 蛋白質理化性質分析和亞細胞定位預測

通過Expasy 在線工具（https：//web.expasy.org/compute_pi/）計算BnaOSCA家族成員的相對分子量、等電點[15]，利用WoLFPSORT在線平臺（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）預測亞細胞定位[16]

1.4 系統進化樹構建

利用Clustal軟件對擬南芥、甘藍型油菜、白菜和甘藍的OSCA蛋白氨基酸序列進行比對，利用MEGA7.0軟件構建系統進化樹[17-18] 。

1.5基因結構和保守基序鑒定

利用MEME（https：//meme-suite.org/）鑒定BnaOSCA蛋白的保守基序；利用TBtools[19]軟件獲得BnaOSCA基因結構。

1.6基因啟動子區域順式作用元件分析

提取BnaOSCA基因啟動子上游 2kb 序列，利用Plant Care（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[20]預測啟動子區域的順式作用元件。

1.7 蛋白質結構預測

利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page /NPSA/npsa_sopma.html）預測二級結構，利用 SWISS-MODEL（https：//swissmod-el.expasy.org/interactive）構建三級結構模型。

1.8共線性分析和在不同組織中的表達模式分析

利用TBtools軟件的McScanX工具分析甘藍型油菜、白菜、甘藍及擬南芥4種植物的OSCA基因的共線性關系;通過TBtools中的 K_a/K_s Calcator插件計算K_a/K_s 值。基于BnPIR數據庫的轉錄組數據[21」，通過TBtools生成不同組織中BnaOSCA基因表達熱圖。

1.9 鹽脅迫、干旱脅迫處理

以甘藍型油菜品種中雙11號為材料，對四葉期幼苗分別進行鹽脅迫（250mmol/LNaClHoagland溶液）和干旱脅迫（ 10% PEG60O0Hoagland 溶液）處理。分別在脅迫處理 0h，1h，2h，4h，8h，12h 和24h 取樣。每個時間點設3次生物學重復試驗。

1.10 RNA提取與qRT-PCR檢測

使用PlantRNApureKit試劑盒（Zomanbio公司產品）提取葉片總RNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。使用 EasyScript@ One-Step gDNA Removaland cDNA SynthesisSuperMix 試劑盒（Transgen 公司產品）反轉錄合成cDNA。通過qRT-PCR技術測定鹽脅迫和干旱脅迫下6個BnaOSCA基因的相對表達量。BnaOSCA4、BnaOSCA15、BnaOSCA23、BnaOSCA26、BnaOSCA31和BnaOSCA36及內參基因BnaActin的引物信息如表1所示。

2 結果與分析

2.1OSCA家族成員及其理化性質

從BnPIR數據庫中篩選出37個甘藍型油菜的OSCA基因。如表2所示，這37個BnaOSCA基因編碼的蛋白質長度為585～829aa，其中BnaOSCA9蛋白長度最長，BnaOSCA26蛋白長度最短。BnaOSCA蛋白相對分子量為66733.61（BnaOSCA26）～ 95914.48（BnaOSCA33），等電點（pI）為6.94（BnaOSCA17）～9.55（BnaOSCA18）。37個BnaOSCA基因編碼的蛋白質均定位于細胞質膜。

2.2OSCA基因染色體定位和系統進化樹分析

基于15個擬南芥的OSCA蛋白氨基酸序列、37個甘藍型油菜的OSCA蛋白氨基酸序列、19個白菜的OSCA蛋白氨基酸序列、17個甘藍的OSCA蛋白氨基酸序列和14個辣椒的OSCA蛋白氨基酸序列構建系統進化樹。如圖1所示，102個0SCA蛋白被分為3個亞族，其中第I亞族包含7個OSCA蛋白，第I亞族包含42個OSCA蛋白，第Ⅲ亞族包含53個OSCA蛋白，同一亞族的OSCA基因同源性較高，它們可能具有相似的功能。如圖2所示，37個0SCA基因不均勻地分布在13條染色體上。A基因組中含有19個OSCA基因，其中A03和A08染色體上的OSCA基因數量較多，分別含有5個OSCA基因。C基因組中含有18個OSCA基因，其中C03染色體上的OSCA基因數量較多，含有6個OSCA基因。

A基因組來自蕓蔓屬的白菜（Brassica rapa）;C基因組來自蕓蠆屬的甘藍（Brassica oleracea）

2.3 基因結構及保守基序

分析甘藍型油菜OSCA家族成員及編碼蛋白質結構。如圖3所示，BnaOSCA家族成員具有復雜的基因結構，而親緣關系較近的BnaOSCA家族成員基因外顯子的分布和數量相似。所有BnaOSCA家族成員均含有Motif1、Motif7和Motif8這3個保守基序。其中，BnaOSCA14和BnaOSCA27分別含有5個Motif，而BnaOSCA7含有7個Motif，其余成員則含有8＼～10個Motif。親緣關系較近的BnaOSCA家族成員保守基序的分布也具有相似性。

2.4 順式作用元件

采用PlantCARE工具對OSCA家族成員啟動子中的順式作用元件進行分析。如圖4所示，啟動子區域包含多種激素響應元件，包括赤霉素響應元件（GARE-motif、P-box）、脫落酸響應元件（ABRE）、茉莉酸甲酯響應元件（TGACG-motif/CGTCA-motif）。有34個OSCA家族成員的啟動子區域含有GARE-motif響應元件，32個OSCA家族成員的啟動子含有ABRE響應元件，32個OSCA家族成員含有P-box響應元件，21個OSCA家族成員含有TGACG-motif/CGTCA-motif響應元件。此外，在啟動子區域還鑒定出與非生物脅迫響應元件，包括干旱誘導的MYB結合位點、低溫響應元件、厭氧誘導調節元件、應激反應相關元件。表明BnaOSCA家族的成員可能參與非生物脅迫響應和激素調控。

2.5蛋白質二級結構和三維結構預測

如表3所示，37個BnaOSCA家族成員蛋白質的二級結構都由 α -螺旋 47.65%～59.83% ） B 折疊0 1.24%～4.46% ）延伸鏈 （9.99%～15.57% ）和無規則卷曲（ 27.18%～38. 10% ）構成。其中， α? -螺旋和無規則卷曲占比較高。如圖5所示，BnaOSCA家族成員的空間構象以 α -螺旋和無規則卷曲為主，同時含有少量的延伸鏈和 β -折疊。

2.6 共線性分析

如圖6所示，對甘藍型油菜OSCA基因進行共線性分析，共鑒定出60對共線性基因對。除A02、A04、A10、C02和C07這5條染色體外，其余14條染色體上均存在片段重復序列，這些重復序列可能與基因家族的演化有關，表明基因重復是甘藍型油菜OSCA基因擴增和演化的重要機制。為了解析OSCA家族基因的演化歷程，本研究對甘藍型油菜、白菜、甘藍和擬南芥4種植物OSCA家族基因進行共線性分析。如圖7所示，擬南芥與甘藍型油菜之間存在51對共線性OSCA基因，甘藍型油菜與白菜之間存在29對共線性OSCA基因，甘藍型油菜與甘藍之間存在25對共線性OSCA基因。進一步分析發現，甘藍型油菜、白菜和甘藍中分別含有25個、16個和16個與擬南芥OSCA基因同源的基因。值得注意的是，在甘藍型油菜、白菜和甘藍中均未發現與擬南芥AT3G01100.1基因同源的基因，該基因可能在進化過程中丟失，其功能可能已被其他基因代償[22-23]。

此外，甘藍型油菜和白菜之間存在62對共線性OSCA基因，其中，17個甘藍型油菜OSCA基因在白菜中存在對應的同源基因。在甘藍型油菜與甘藍之間存在62對共線性OSCA基因。其中，17個甘藍型油菜OSCA基因在甘藍中存在對應的同源基因。這些結果表明，在白菜和甘藍雜交形成甘藍型油菜的過程中，伴隨著基因丟失的事件。此外，盡管甘藍型油菜基因組中存在OSCA基因丟失現象，但OSCA家族卻發生了擴張，表明基因復制在物種進化過程中發揮了重要作用。

2.7BnaOSCA基因在不同組織中的表達模式

從BnTIR平臺下載中雙11號甘藍型油菜在不同組織中的轉錄組數據。如圖8所示，BnaOSCA26、BnaOSCA31BnaOSCA33和BnaOSCA36在葉和角果中的相對表達量較高，BnaOSCA8和BnaOSCA30在根、葉、子葉、芽、萼片、花瓣、花粉、長角果、種子中均不表達，而大部分BnaOSCA基因只在某些組織中的相對表達量較高，表現為組織特異性表達。

2.8非生物脅迫下BnaOSCA基因的表達

基于BnaOSCA家族基因在不同組織中的相對表達量，篩選出在葉中相對表達量較高的6個BnaOSCA基因，進一步分析其在鹽脅道、干旱脅迫下甘藍型油菜葉中的相對表達量。如圖9所示，BnaOSCA4、BnaOSCA23和BnaOSCA26相對表達量呈先升高后降低的趨勢，在鹽脅迫 ^2h ，BnaOSCA4、BnaOSCA23和BnaOSCA26相對表達量達到最大。在鹽脅迫 ¹h BnaOSCA15BnaOSCA31和BnaOSCA36相對表達量達到最大。如圖10所示，干旱脅迫 1h，BnaOSCAI5.

BnaOSCA23和BnaOSCA36相對表達量達到最大。干旱脅迫 12h，BnaOSCA4 相對表達量達到最高；干旱脅迫 4h，BnaOSCA26 相對表達量達到最大。

3 討論與結論

植物在生長發育過程中常面臨干旱、低溫、鹽堿脅迫以及病原體侵染等多種逆境脅迫[24]。在長期進化過程中，植物形成了快速感知和應對逆境的耐受和規避機制[1]。OSCA（鈣通透性陽離子通道蛋白）在鈣信號傳導中起關鍵作用。目前，已在擬南芥、大豆、大麥和茄屬植物中分別鑒定出15個、21個、14個和11個OSCA家族成員，這些成員均具有DUF221結構域。本研究從甘藍型油菜基因組中鑒定出37個OSCA家族基因，這些基因編碼的蛋白質具有高度保守的氨基酸序列特征，且大多數含有與植物逆境脅迫響應相關的DUF221結構域。

通過系統進化分析，BnaOSCA家族基因可以被劃分為3個亞族。這37個BnaOSCA基因在13條A基因組來自蕓墓屬的白菜（Brassica rapa）;C基因組來自蕓墓屬的甘藍（Brassica oleracea）。

染色體上不均勻分布，其中，A基因組包含19個BnaOSCA基因，而 c 基因組則包含18個BnaOSCA基因。本研究還鑒定了甘藍型油菜的二倍體祖先物種——白菜和甘藍的基因組，分別鑒定出19個和17個OSCA家族成員。共線性分析結果表明，甘藍型油菜OSCA家族基因在進化過程中存在基因丟失現象，同時也發生了基因擴張。BnaOSCA家族表現出進化保守性、結構穩定性和功能連續性[25]

研究結果表明，OSCA基因在植物逆境脅迫響應中發揮重要作用[26。在鹽脅迫下，玉米ZmOSCA2.3.ZmOSCA2.4 表達量可提高200倍，且與脯氨酸含量呈顯著正相關。在干旱脅迫下，擬南芥中 ZmOSCA2.4 的表達量上升[26]。水稻OsOSCA1.2和 OsOSCA2.2 在調節細胞對外界滲透壓變化的響應過程中，受到晝夜節律的影響，OsOSCA基因還響應干旱脅迫、鹽脅迫[27-28]。綜上，OSCA家族基因在響應植物的非生物脅迫中具有重要的作用。

本研究發現，甘藍型油菜BnaOSCA家族基因中含有大量的逆境響應元件，這些元件可能通過不同激素信號通路調控油菜生長發育和逆境響應。本研究對部分OSCA家族基因在鹽脅迫、干旱脅迫下的相對表達量進行分析。結果表明，BnaOSCA4、BnaOSCA23和BnaOSCA26相對表達量呈先升高后降低的趨勢，在鹽脅迫 2h，BnaOSCA4，BnaOSCA23 和BnaOSCA26相對表達量達到最大。在鹽脅迫 1h，BnaOSCAI5，BnaOSCA3I 和BnaOSCA36相對表達量達到最大。干旱脅迫 ^1h BnaOSCA15、BnaOSCA23和BnaOSCA36相對表達量達到最大。干旱脅迫 12h，BnaOSCA4 相對表達量達到最大;干旱脅迫 相對表達量達到最大。表明BnaOSCA家族基因在甘藍型油菜響應鹽脅迫和干旱脅迫過程中發揮重要作用。本研究結果為進一步完善BnaOSCA家族基因調控網絡提供了理論依據。

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（責任編輯：成紓寒）