人子宮腺肌病相關原代細胞培養的研究進展

[摘要] 子宮腺肌病是一種常見的雌激素依賴性婦科良性疾病，是子宮內膜（包括腺體和間質）侵入子宮肌層生長而產生的病變。盡管子宮腺肌病是良性疾病，但其發展過程與惡性腫瘤的生物學行為相似，發病機制復雜，具有易復發及難治性的特點，目前仍缺乏有效的治療藥物。近年來子宮腺肌病的發病率呈上升趨勢，且趨于年輕化，但其發病機制至今仍不清楚。子宮腺肌病患者的在位和異位子宮內膜原代細胞培養是子宮腺肌病研究中必要且廣泛使用的工具。本文通過文獻檢索，闡述子宮腺肌病在位和異位子宮內膜原代細胞培養的各種方法，旨在獲得人子宮腺肌病原代子宮內膜細胞最高效和最簡便的方法，為進一步探索人子宮腺肌病的發病機制和藥物篩選研究提供有價值的實驗模型。

[關鍵詞] 原代細胞培養；子宮腺肌病；子宮內膜

[中圖分類號] R711.71" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.18.023

子宮腺肌病是一種常見的雌激素依賴性婦科良性疾病，是指具有活性的子宮內膜遷移至子宮肌層并繼續生長、增殖，病灶呈局灶性或彌漫性改變^[1]。子宮腺肌病的主要癥狀是疼痛（進行性加重的痛經、盆腔疼痛）和異常子宮出血，繼發貧血及不孕。子宮腺肌病還與較低的臨床妊娠率、較高的流產率和妊娠并發癥有關，這些癥狀嚴重影響育齡期女性的身心健康^[2]。子宮腺肌病雖為良性疾病，但具有惡性腫瘤的生物學行為及一定的惡變潛能，是婦科和醫療保健經濟學中的臨床挑戰之一^[3]。盡管有大量關于子宮腺肌病的文獻，但人們對這一疾病的發病機制仍不清楚，目前尚無有效的治療藥物。大多數子宮腺肌病的重點研究主要依賴臨床樣本提供描述性研究，對功能或機制理解的實施有限。根據目前被廣泛接受的子宮內膜內陷理論，獲取子宮腺肌病患者的在位和異位子宮內膜原代細胞是該疾病研究中必要且廣泛使用的工具。

近年來，細胞生物學發展迅速，細胞分離和培養技術在實驗室程序和實驗條件的支持下，為體外研究健康和疾病狀態的病理和生理學過程提供廣泛機會^[4]。原代細胞體外培養使人們能更深入地理解細胞生物學、疾病機制領域的知識，并在藥物測試方面發揮巨大作用^[5]。實驗室培養的患者來源原代細胞是用以研究疾病過程簡單且具有成本效益的方法，這些原代細胞常用于婦科醫學領域的研究^[6]。相對于細胞系而言，原代培養的細胞更加接近和反映機體生長的特性。然而，原代細胞培養存在不易培養、存活率低等不足，且在有限數量的體外傳代后無法

存活。此外，來自非癌組織的原代細胞在體外培養時壽命有限，增殖能力降低^[7]。大部分文獻報道子宮腺肌病病灶原代細胞培養產物均為異位子宮內膜上皮細胞、間質細胞及平滑肌細胞等混合細胞。關永格等^[8]報道人子宮腺肌病病灶細胞的原代培養和鑒定，然而未后續進行人子宮腺肌病病灶異位上皮細胞和間質細胞的分離培養。細胞的分離純化方法有離心分離法、過濾分離法和基于細胞表面特征的免疫磁珠分離法及流式細胞術。免疫磁珠分離法和流式細胞術因技術要求和成本較高，目前還未應用于原代子宮腺肌病病灶細胞的分離和純化。流式細胞術需細胞高速流動，影響細胞活性，且操作過程中難以嚴格無菌操作，分選后的細胞繼續培養存活困難易被污染。針對這些難點問題，通過識別和采集人子宮腺肌病病灶的異位子宮內膜組織，采用Ⅰ型膠原酶消化法對已獲得的異位子宮內膜組織進行消化及后續原代細胞培養，通過簡單可操作的無菌細胞濾網過濾法分離培養的原代細胞，最后經流式細胞術進行細胞類型鑒定、純度和活性分析，成功分離出活性好、純度高的異位上皮和間質細胞^[9]。

1" 人子宮腺肌病在位子宮內膜原代細胞培養

1.1" 標本的采集和處理

選取接受宮腔鏡手術或全子宮切除術的子宮腺肌病患者標本，收集在位子宮內膜組織。子宮全切手術標本離體后用刀片Y型剖開子宮，另取干凈無菌刀片輕輕刮取在位子宮內膜組織保存于達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）/F12（Ham’s F-12）中，4℃下24h內進行細胞分離和培養。將全部標本及培養基倒入10cm無菌培養皿中，PBS洗滌3次，用無菌眼科剪將在位子宮內膜組織剪成1～2mm³大小；PBS再次沖洗剪碎的內膜并用巴氏管吸取至50ml離心管中，1000轉/min離心5min，棄上清液。整個過程需嚴格無菌操作。

1.2" 標本的消化

對處理后的標本進行消化。用于消化在位子宮內膜組織的酶類主要為膠原酶，部分研究聯合脫氧核糖核酸酶進行組織消化。酶類工作濃度各異，大部分文獻的酶類濃度為0.10%～0.25%，消化所需時間約1h，Wang等^[10]消化標本的方法是加入含0.2%Ⅰ型膠原酶和含0.005%脫氧核糖核酸酶的混合液，37℃下完全消化40～50min。戚瑩瑩等^[11]消化標本的方法是在處理好的標本中滴入0.1%的Ⅰ型膠原酶后置入37℃溫箱5h，消化完畢后滴入含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的完全培養基并過濾和離心，1000轉/min離心3次，每次8min。Che等^[12]采用1mg/ml的Ⅲ型膠原酶37℃下消化60min。Yokomizo等^[13]用100μg/ml的Ⅰ型膠原酶將剪碎的子宮內膜組織置37℃振蕩培養箱中消化2h。Guo等^[14]將處理后的標本放入含有Ⅰ型膠原酶（0.25%）、羥乙基哌嗪乙磺酸（0.02mol/L）和胰蛋白酶（0.006%）的混合液中37℃消化60min。

1.3" 原代細胞的分離和培養

大部分研究報道原代子宮內膜細胞的分離均通過無菌細胞過濾器完成。該方法操作簡便，成本低；而關于哪種孔徑細胞濾網分離的細胞純度高目前并無相關報道。Che等^[12]通過200μm和70μm細胞過濾器連續2次過濾分離子宮內膜上皮和間質細胞；隨后將子宮內膜上皮細胞重懸于原代上皮生長培養基中，并在補充含有10% FBS的DMEM/F12培養基中培養子宮內膜間質細胞。Yokomizo等^[13]通過100μm和40μm尼龍網過濾并分離細胞，離心收集細胞沉淀重懸于含有1%青霉素–鏈霉素及10% FBS的DMEM中培養。Guo等^[14]使用100μm和70μm尼龍細胞過濾器過濾細胞，分離出的上皮和間質細胞在含抗生素及5% FBS的DMEM/F12中培養。

2" 人子宮腺肌病異位子宮內膜原代細胞培養

2.1" 標本的采集和處理

選取因子宮腺肌病行子宮腺肌病灶剔除術或全子宮切除術患者的病灶組織標本。既往文獻報道在無菌條件下取直徑1～2cm的新鮮子宮腺肌病灶組織標本后置入無血清的DMEM/F12培養基中低溫保存，盡早轉移至超凈臺處理。用PBS洗滌3次以去除碎片和多余血細胞。用無菌刀片及眼科剪將組織剪碎至0.5～1.0mm³大小轉移至另一無菌50ml離心管中，1000轉/min離心5min，棄上清液。Fang等^[9]對標本的處理過程較子宮腺肌病病灶組織簡單，可極大縮短處理標本的時間，確保細胞活性。

2.2" 標本的消化

Wang等^[15]將處理后子宮腺肌病病灶組織以2mg/ml Ⅳ型膠原酶（體積比為1：4）37℃恒溫下緩慢振蕩消化4h后，加入3倍體積的完全培養基（含10% FBS的DMEM/F12培養基）終止消化。Huang等^[16]則采用Ⅱ型膠原酶和脫氧核糖核酸酶Ⅰ于室溫下消化4～5h。姜心禪等^[17]加入適量0.1%Ⅰ型膠原酶，置于37℃恒溫箱消化5～6h。韓妍等^[18]將處理后組織置于終濃度為2.5g/L的Ⅳ型膠原酶溶液中37℃消化4～6h，反復震蕩，待組織呈云霧狀時終止消化。上述文獻的標本消化方法均是對子宮腺肌病病灶組織的消化方法。Fang等^[9]將處理后子宮腺肌病病灶中的異位內膜組織加入0.2%Ⅰ型膠原酶（體積比為1：3）置于37℃恒溫搖床上緩慢振蕩30～60min，消化時間由標本量決定，證實該方法可極大縮短消化時間，減少消化酶對細胞的損傷，提高細胞活性和存活率。

2.3" 原代細胞的分離和培養

大部分研究將子宮腺肌病病灶異位混合細胞簡單過濾去除雜質后直接種皿進行培養，最后經免疫細胞化學法（角蛋白、波形蛋白、平滑肌肌動蛋白）鑒定用于后續實驗研究。另有研究將消化后的細胞懸液用尼龍網過濾去除未消化的組織碎片，離心后將細胞重懸于含10%～15% FBS的DMEM中，5% CO₂培養箱37℃培養用于后續實驗^[15-16]。

子宮腺肌病病灶組織較硬，消化時間長，常導致細胞結構損傷，細胞培養成活率降低或無法貼壁。韓妍等^[18]將細胞混懸液接種于鋪有多聚賴氨酸的蓋玻片上培養，利用差速脫壁法分離和純化細胞，但最終未實現子宮腺肌病病灶中異位內膜上皮和間質細胞的高度純化，提示子宮腺肌病病灶中異位細胞種類較多不易分離提純。Fang等^[9]應用100μm和40μm無菌細胞濾網過濾法成功分離和培養子宮腺肌病病灶異位上皮和間質細胞，其中上皮細胞培養成功率62.5%，間質細胞成功率87.5%，異位上皮和間質細胞純度均在90%以上。

3" 小結與展望

目前，子宮腺肌病的具體發病機制不明確，與之相關臨床癥狀嚴重威脅女性身心健康。人子宮腺肌病在位和異位子宮內膜培養物是研究子宮腺肌病的有力工具。細胞系的培養程序簡單，易于培養，但缺乏個體間差異，具有局限性。當前子宮腺肌病在位子宮內膜原代細胞分離和培養程序已較成熟。現有文獻報道分離子宮內膜細胞的最常用方法是使用濃度0.1%～0.2%的Ⅰ型膠原酶對組織消化60min，應用細胞濾網過濾法對細胞進行分離培養。該方法存在一定的局限性，特別是對子宮內膜上皮細胞，培養困難、數量少、壽命有限、不能正常擴增；也不能增殖并獲得更高的融合；無法后續傳代。組織標本消化時間的掌控至關重要，不宜過度消化，一旦消化過度將嚴重影響原代細胞的活性及貼壁能力；但若消化不足，細胞產量嚴重減少，過濾后細胞所剩無幾，無法滿足實驗要求。因此有待進一步研究具體使用哪種膠原酶及其最佳作用時間和濃度培養出數量最多、純度和活力更好的細胞。此外對在位子宮內膜細胞的分離，大部分研究均采用細胞濾網過濾法分離細胞，該方法操作簡便、成本低，但不同研究使用濾網的孔徑不同，何種孔徑尺寸能分離出更高純度的細胞亦有待進一步研究對比。

與既往文獻報道的細胞培養方法相比，Fang等^[9]報道的子宮腺肌病異位內膜的細胞培養方法在處理和消化標本方面程序簡易、耗時短，可極大縮短細胞種皿前時間，提高細胞活性，并可分離純化子宮腺肌病病灶異位上皮和間質細胞，最后流式細胞術進行鑒定及純度分析，結果顯示異位上皮和間質細胞純度均高達90%以上。這為子宮腺肌病的研究提供一個簡單、可行、快速的體外細胞培養方法，并在理論上提供子宮腺肌病靶向治療研究的新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–01–30）

（修回日期：2025–06–08）