西藏野生垂穗披堿草CnC0R410基因克隆及表達分析

引用格式：，饒等．西藏野生垂穗披堿草CnCOR410基因克隆及表達分析[J].草地學報，2025，33（7）：2090 -2098 CHAI Yi，RAO Xin-yuan，YUANLu-yao，et al. Cloning and Expression Analysis of the CnCOR410 Gene in Campeiostachys nutans Griseb.[J].Acta Agrestia Sinica，2025，33（7） ：2090-2098

Cloning and Expression Analysis of the CnCOR410 Gene in Campeiostachys nutans Griseb.

CHAI Yi1，RAO Xin-yuan1， YUAN Lu-yao1，WANG He-tong1， ZHANG Bo-ning1，MIAO Yan-jun ² CAO Zhong-hua2，YANG Pei-zhi1，HU Tian-mingl*，FU Juan-juan1* （1.DepartmentofGrassandSience，CollegeofGrassadAgricultue，NorthwstAamp;FUniversity，Yanging，aaniProvin0 China;2.CoegeofalSieeAgiculturalndAialHusbadryolgeofbetUnversitygchiiang6a

Abstract： To investigate the molecular mechanism of dehydrin regulating plant abiotic stress response，the CnCOR410 gene was cloned from Xizang wild Campeiostachys nutans Griseb. Amino acid sequence analysis， subcellular localization，and expression profile of the CnCOR41O gene in response to cold，drought，and salt stress were conducted. The results showed that the coding sequences （CDS）of the CnCOR410 gene was 765 bp in length，encoding 254 amino acids，with a molecular weight of 7504.48 Da and an isoelectric point of 4.87.The CnCOR41O protein was a hydrophilic and non-transmembrane protein，and its secondary structure was mainly random coil，accounting for 61.42% . The CnCOR41O contained the conserved domain of dehydrin and belonged to the LEA family. The amino acid sequence similarity between CnCOR41O and wheat （Triticum aestivum L）was the highest at 93.44% ，and the protein was located in the cytoplasm. The RT-qPCR results showed that CnCOR41O was expressed in the root，stem，and leaf tissues of C .nutans，with the highest expression in the leaves. Moreover，the expression of CnCOR410 was regulated by cold，drought，salt stress， and ABA （ Plt;0.05 .The results of this study laid a foundation for further clarifying the mechanism of

CnCOR410 regulating the abiotic stress adaptation of C . nutans. Key Words：Campeiostachys nutans Griseb. ;Dehydrin;CnCOR410;Gene cloning;Expression analysis; Xizang

低溫、干旱、鹽漬化作為全球農業生產中嚴重的非生物逆境，限制植物的正常生長和發育。在缺水和低溫條件下會導致植物脫水和細胞損傷，而鹽脅迫會引起植物滲透變化、抑制根系水分吸收，并最終損害植物細胞[1]。垂穗披堿草（CampeiostachysnutansGriseb.）營養價值高、根系發達、抗逆性強，該草種作為青藏高原特色鄉土草本植物，在退化生態系統治理與人工牧草地建植中具有重要的應用價值[2]。經過長期自然選擇的西藏野生垂穗披堿草居群已經進化出對極端低溫、干旱、鹽堿等逆境較強的適應性，開展其適應低溫、干旱和鹽堿等逆境的分子機制研究，對于充分利用西藏野生垂穗披堿草野生種質資源的優良抗性基因遺傳改良其近緣物種具有重要意義[3-5]

脫水素（Dehydrin，DHN）是植物中重要的逆境響應蛋白[6]，具有高度親水性、易溶性，屬于胚胎晚期豐富蛋白（Lateembryogenesisabundant，LEA）家族成員，并被歸類為LEAⅡ蛋白。它包含三個植物LEA蛋白家族的保守片段（Y，S，K）序列[8-10]DHN具有酶冷凍保護、膜保護和針對活性氧的保護功能，在植物應對干旱、鹽堿等非生物脅迫時起到重要保護作用[1]。DHN一直被認為是實現離子結合功能的輔助因子，可作為冷凍保護劑并幫助清除自由基，通過非特異性結合使其與相關抗逆基因相互作用，降低非生物脅迫過程中大量活性氧物質對細胞造成的傷害12。最近研究發現脫水素也可以通過調節應激反應基因參與調控植物的非生物脅迫響應[13]。CORs（Cold-regulated genes）基因被認為是冷脅迫反應中關鍵的調節基因，在提高植物耐寒性和保持水果采后質量方面具有關鍵作用[14]。ICE-CBF-COR 信號傳導是目前已知調節植物低溫脅迫的重要調節因子， CBFs 通過激活觸發各種 CORs 基因在植物耐寒機制中發揮關鍵作用[15]。在擬南芥（Arabidopsisthaliana）上的研究表明，脫水素基因 AtCOR47 同時響應脫落酸（Abscisicacid，ABA）低溫和干旱脅迫[16]。溝葉結縷草中（Zoysiamatrella）也報道了 ZmCOR410 作為一個酸性脫水素基因響應低溫脅迫[17]。然而，目前對于垂穗披堿草脫水素基因 CnCOR410 調控植物非生物脅迫應答的機制尚不明晰。

本研究從當雄野生垂穗披堿草中克隆了CnCOR41O基因的編碼序列（CodingDNAsequence，CDS），并對其進行生物信息學、基因表達模式和亞細胞定位分析，為深入地解析 CnCOR410 基因調控西藏野生垂穗披堿草的抗逆功能提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

本研究以西藏當雄縣 （30^°28.535^′N ， 91^° 06.246^′E） 采集的野生垂穗披堿草種子為材料，篩選飽滿種子，種子經 2.5% 次氯酸鈉溶液消毒 15min 后無菌水沖洗，于 22^°C/18^°C，12000lx（16h/8h 光周期）條件下培養28d對西藏野生垂穗披堿草幼苗進行 4^°C 低溫處理 （0，12，24，48，72，120h） ；剪除葉片后于培養箱內脫水進行干旱脅迫 （0，2，4，8h） ：0.01mmol?L^-1 ABA處理 （0，2，4，8h）;150mmol?L^-1 NaCl鹽脅迫 （0，2，4，8h） 。所有處理均設立3次獨立生物學重復，按照預設時間節點取樣。取樣后立即置于液氮固定，隨后轉移至一 80^°C 超低溫冰箱中保存，確保樣本完整性以滿足后續qRT-PCR試驗要求。

1.2 RNA提取及反轉錄

利用莊盟生物總RNA提取試劑盒KKFastPlantTotalRNAKit（ZP405K）從西藏野生垂穗披堿草中提取RNA，采用酶標儀檢測提取RNA的質量并迅速保存于一 80^°C 冰箱；采用HiScriptⅡ第一鏈cDNA合成試劑盒（諾唯贊，R211-01）進行反轉錄，產物于一 20^°C 保存備用。

1.3基因克隆與連接

以西藏野生垂穗披堿草cDNA為模板，采用2× PhantaMaxMasterMix超保真酶 50μL 體系進行目的基因PCR擴增，反應體系包含：cDNA模板2μL， 正反向引物（表1）各 2μL 、 2× PhantaMaxMasterMix超保真酶 25μL ，無酶水補足至 50μL 。PCR程序：預變性 95^°C 持續 3min ，變性 95^°C 持續 10s， 退火 58^°C 持續 30s. 延伸 72^°C 持續 90s ，最后徹底延伸 72^°C 持續 3min ，循環共35個。PCR產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用ZP2O4DNA純化試劑盒（莊盟生物）回收目的片段。隨后，以pCAMBI1302為載體，構建35S：CnCOR410-GFP融合表達載體。載體經EcoRI（Thermol品牌）酶切20μL 反應體系： 1μg 載體， 2μL 酶， 4μL Buffer，其余體積用無酶水補足，放人PCR中 37^°C 反應 15min 后 85^°C 滅活 15min ，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗酶切載體質量。采用ClonExpressII一步克隆試劑盒（C112，諾唯贊）， 20μL 反應體系： 0.03pmol 載體，0.06pmol片段， 4μL Buffer，2μL酶，無酶水補足，進行連接反應。將反應體系放入PCR中 37^°C 孵育 30min 后轉化 DH5α 感受態細胞， 37^°C 培養 12～16h 。挑取單克隆菌落，利用菌檢引物（表1）進行菌落PCR驗證，陽性克隆經擴大培養后提取質粒送擎科生物測序，最終獲得35S：CnCOR410-GFP重組載體。

1.4 生物信息學分析

利用在線軟件InterPro預測了CnCOR410蛋白保守結構域；使用SOPMA在線軟件預測了蛋白二級結構；利用在線工具Novopro分析了蛋白親疏水性；使用在線軟件Expasy分析了CnCOR410編碼氨基酸數量、不穩定系數、脂肪族系數等；利用在線軟件SWISS-MODEL預測蛋白質三級結構；利用在線軟件NCBI-Blast進行多序列對比；利用Megal1軟件分析CnCOR410蛋白與其他植物COR410蛋白的進化關系并繪制neighbor-joining系統進化樹；利用在線軟件Espript繪制氨基酸序列對比圖；利用TMHMM在線軟件進行蛋白跨膜區分析。

1.5 qRT-PCR定量分析

利用諾唯贊ChamQSYBRqPCRMasterMix（Q311-02/03）試劑盒進行qRT-PCR定量分析，加人 2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10μL ，引物各 0.4μL ，加人 50× ROX Reference Dye 0.4μL 垂穗披堿草cDNA加人量不超過 2μL ，以Tubulin作為內參基因。采用 2^-ΔΔCt 計算 CnCOR410 基因的相對表達量。引物序列見表2。

1. 6 亞細胞定位

經菌落PCR驗證正確的 γCAMBI1302：35S CnCOR4IO–GFP 融合載體轉化農桿菌GV3101感受態細胞，在LB培養基中過夜培養后離心收集菌體，配置新鮮的滲透液 （0.2mmol?L^-1Z 酰丁香酮，10mmol?L^-1MgCl₂ 10mmol?L^-1 MES溶液），利用滲透液重懸菌，調整菌液濃度至 OD₆₀₀≈0.6，28^°C 避光活化 3h ，將活化菌液注射至4周齡本氏煙草葉片中進行瞬時轉化實驗。 28^°C 培養2d，利用研究型顯微鏡觀察亞細胞定位。

1.7 數據分析

數據采用IBMSPSSStatistics27軟件進行單因素方差分析，在 Plt;0.05 顯著性水平下，采用Duncan法進行多重比較檢驗。

2 結果與分析

2.1 CnC0R410基因克隆

以垂穗披堿草葉片RNA為模板反轉錄合成cDNA，經PCR擴增獲得約 500～750bp 的特異性條帶。經過測序確定片段大小為765bp（圖1）。

2.2 CnCOR410基因生物信息學分析

利用DNAMAN9軟件預測CnCOR410氨基酸序列，發現CnCOR410編碼254個氨基酸（圖2A）。利用InterPro在線軟件分析，CnCOR41O蛋白含有脫水素保守結構域（圖2B）。利用Expasy在線軟件分析發現COR410編碼氨基酸中谷氨酸（Glu）含量最高為 16.9% ，其次為賴氨酸（Lys）14. 2% 和丙氨酸（Ala）為 8.7% ，分子式為 C₁₂₀₇H₁₉₆₂N₃₃₈O₄₁₅S₃ ，不穩定系數為57.82，脂肪族系數為61.81。利用SOPMA在線網站預測蛋白質的二級結構（圖2C），分析顯示：CnCOR410蛋白以無規卷曲 （61.42% ）為主導構象，同時含有 37.01% 的 α 螺旋以及 1.57% 伸展鏈利用Novopro在線軟件分析疏水性為一1.083，表明該蛋白為親水蛋白（圖2D）。利用SWISS-MODEL完成蛋白三級結構（圖2E），與二級結構預測基本一致。利用TMHMM在線工具軟件進行蛋白質跨膜區分析，結果表明所有氨基酸均位于細胞膜外，不存在跨膜結構（圖2F）。上述結果證明CnCOR410屬于非跨膜蛋白，含有脫水素保守結構域。

2.3 CnCOR410多序列對比及進化樹分析

根據CnCOR410的氨基酸序列利用NCBI-Blast在線軟件分析表明， CnCOR410 蛋白與多種禾本科植物COR410蛋白序列具有高度相似性：與二粒小麥（Triticumdicoccoides）相似度為 93.44% ，小麥（Triticumaestiuum）相似度為 92.37% ，烏拉爾圖小麥（Triticumurartu）相似度為 89.55% ，大麥（Hordeumvulgaresubsp.vulgare）相似度為91. 89% ，二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）相似度為 72.62% 。基于Megal1構建的鄰近系統進化樹顯示（圖3A），CnCOR410與大麥COR410蛋白的進化關系最為接近。進一步通過Espript3.0進行的多重序列比對分析表明，CnCOR410與其他禾本科植物的COR410蛋白具有高度一致的氨基酸序列特征，均含有一段K片段和一段S片段，即KRK-KKKGLKEK序列和SSSSSSSSS序列（圖3B）。

2.4 蛋白亞細胞定位

采用農桿菌瞬時侵染煙草葉片技術，分析了

CnCOR410的亞細胞定位情況，發現CnCOR410：：eGFP熒光主要定位于細胞質中（圖4）。

2.5 CnC0R410表達模式分析

利用qRT-PCR技術檢測西藏野生垂穗披堿草CnCOR410基因的組織特異性表達。結果顯示，該基因在根、莖、葉組織中均檢測到表達，其中葉片中的表達量顯著高于其他組織 （Plt;0.05） （圖5A）。為進一步明確 CnCOR410 基因的表達調控特征，對西藏野生垂穗披堿草分別進行了低溫、ABA、鹽和干旱處理。低溫處理后 CnCOR410 基因表達量呈現先增加后降低趨勢，在低溫處理 24h 時表達量最高（圖5B）。ABA處理初期CnCOR410基因表達量呈現先上升趨勢，處理4h后表達量達到峰值，隨后表達量出現下降（圖5C）。干旱和鹽處理也能夠誘導 CnCOR410 基因表達快速上調（圖5D-E）。上述研究結果表明垂穗披堿草CnCOR410參與ABA、鹽、干旱和低溫誘導的脅迫響應。

3 討論

干旱、鹽漬、冷害等非生物脅迫會導致植物體內水分失衡，光合能力下降，對植物生長發育乃至作物產量形成的不利影響越來越明顯，嚴重影響了農業正常生產[18-19]。西藏野生垂穗披堿草是一種廣布于高寒地帶的優良牧草，具有適應性強、抗寒、抗旱、耐鹽堿等優點，可作為解析植物非生物脅迫適應機制的理想實驗材料[20]。前期轉錄組分析表明，脫水素基因 CnCOR410 在西藏野生垂穗披堿草響應非生物脅迫過程中發揮重要調控功能[21]

本研究從西藏野生垂穗披堿草中克隆了CnCOR41O的CDS序列，進化樹分析發現CnCOR410與二粒小麥、小麥、烏拉爾圖小麥、大麥、二穗短柄草等禾本科植物蛋白相似度在 70% 以上，推測 CnCOR410 基因與這些植物在進化中具有高度保守性，這與垂穗披堿草為麥類作物野生近源種一致[22]； CnCOR410 在垂穗披堿草的根、莖、葉中均有表達，與Abdul等[23]在擬南芥中的發現結果一致。COR蛋白作為一種富含親水性氨基酸，能夠維持生物大分子及膜系統的穩定性，具有增強植物細胞抗凍、抗脫水等功能[24]。許多發現植物在干旱、高鹽、低溫脅迫下脫水素表達量顯著增加，脫水素表達量與植物的抗凍能力和滲透平衡調節能力呈正相關[25]。低溫脅迫下冬小麥（Triticum aestiuumL）和大麥（Hordeumvulgare）中脫水素積累，冬小麥WCS120和大麥DHN5的相對脫水素積累與冬季作物存活呈正相關[26]。與之相似，本研究發現低溫、干旱、鹽脅迫能夠誘導CnCOR410基因迅速表達，這與前人在擬南芥（Arabidopsisthaliana）水稻（Oryzasativa）枳（Citrustrifoliata）和檸檬（Citruslimon）等植物上的研究結果一致[27-32]。Puhakainen等[33]在擬南芥中研究發現脫水素有助于提高植物的耐凍性。Sena等在白云杉（Piceameyeri）中研究發現10種脫水素基因在干旱脅迫后轉錄水平顯著提高[34]。在大麥中發現HDhns基因在嚴重干旱時被大量誘導表達[35]。此外研究發現MsDhn1可以正向調節紫花苜蓿（MedicagosatiuaL.）缺水的耐受性[36]，這為脫水素提高植株耐旱性提供了科學依據。在本研究中，干旱脅迫誘導 CnCOR4IO 基因的表達迅速增加，這與脫水素具有高度親水性，能夠減少干旱脅迫下植物的水分流失的這一功能密切相關。鹽脅迫下藜麥（Chenopodiumquinoa）胚中脫水素表達量顯著增加[7]。Kirungu等[38]通過敲除脫水素基因進一步證實了DHN有利于提高植物的耐鹽性。綜合上述研究表明垂穗披堿草脫水素 CnCOR410 可能作為一個候選基因應用于抗旱、耐寒和耐鹽牧草和麥類作物新品種（系）育種工作中。本研究為深入探究CnCOR410基因調控垂穗披堿草適應西藏獨特的氣候條件（極端低溫、干旱和鹽堿）奠定基礎。

許多研究表明脫水素基因參與響應一系列激素信號并在植物非生物脅迫應答中協同發揮調控作用[39]。不同類型的脫水素對ABA信號的敏感性存在差異，本研究發現外源ABA處理能夠誘導CnCOR410基因表達，表明CnCOR410可能是ABA依賴型脫水素，推測脫水素CnCOR10與ABA信號相互作用調控西藏野生垂穗披堿草適應低溫、干旱和鹽脅迫應答。在小麥中研究發現脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、赤霉素（GA）和水楊酸（SA）等均可誘導脫水素的表達[40]，這些研究成果與本試驗結果一致。

已有研究表明脫水素中的K段可以形成兩親性 α 螺旋可以與各種其他蛋白質的部分脫水表面以及生物膜表面相互作用同時一種DHN蛋白中的K偏段可以形成束，以增強它們在蛋白質-蛋白質或蛋白質-生物膜相互作用中的兩親性特性從而增強植物的保護功能[41]。Wang等42研究發現脫水素中的S片段可以對煙草亞細胞定位結果產生影響而K片段不影響其定位情況。本研究發現CnCOR410蛋白定位在細胞質中，具有脫水素保守結構域，與Candat等43的研究成果相一致。經氨基酸多序列對比發現CnCOR410含有K片段和S片段。綜上研究表明CnCOR410參與調控垂穗披堿草響應低溫、干旱、鹽等非生物脅迫，且該脫水素蛋白主要在細胞質發揮作用。

4結論

本研究成功克隆了 CnCOR410 的編碼序列，長度為 765bp ，編碼254個氨基酸。CnCOR410蛋白屬于LEA家族，定位于細胞質，為親水性蛋白、非跨膜蛋白，含有K片段和S片段，與二粒小麥、小麥、烏拉爾圖小麥、大麥、二穗短柄草等禾本科植物具有高度相似性。CnCOR410在垂穗披堿草根莖葉中均有表達，且低溫、干旱、鹽和ABA能夠誘導該基因表達。本研究結果為深人解析 CnCOR4IO 基因調控垂穗披堿草的非生物脅迫應答機制提供科學依據。

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（責任編輯付宸）