金頂側(cè)耳磷酸葡萄糖變位酶(PGM)基因克隆與生物信息學(xué)分析

關(guān)鍵詞金頂側(cè)耳;磷酸葡萄糖變位酶；克隆;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 1007-7731（2025）15-0108-06

DOI號(hào)10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.15.026

Cloning and bioinformatics analysis of phosphoglucomutase（PGM） in Pleurotus citrinopileatus

IUI Xiangyun SHI WuqianTANG Hao ZHOU Song LI Yuntao LYU Chaotian LI Huan （School of Food and Bio-engineering，Bengbu University，Bengbu 23303o， China）

AbstractTo explore the characteristics and structure of the phosphoglucomutase （PGM） gene in Pleurotus citrinopileatus，the studywas based on the genomic data of Pleurotus citrinopileatus.The PGM gene wascloned by RT-PCR technology，and the encoded protein was analyzedby bioinformatics，including physicochemical properties， hydrophobicity，secondary and tertiary structures，etc.The results showed that the full length sequence of the PGM （204號(hào) gene in P .citrinopileatus was 1 797 bp，encoding 598 amino acids，with a molecular weight of 66.35 kDa. The isoelectric point of the protein was 5.98，the average hydrophilicity was -0.278 ，and the instability indexwas 29.54， indicatingthat it was anacidic，hydrophilicand stable protein.The protein had no signal peptide，no cleavage site， and no transmembrane helices，belonging toanon-secreted and non-transmembrane protein.There were conserved domains in the amino acid sequence regions，belonging to the PTZoo15O gene family，with 81 phosphorylation sites， located in the cytoplasm.The secondary structure mainly includes α -helices （43.14%） ，irregular curls （35.79% ） extended chains （14.72%） ，and β -folds （6.35% ）; the tertiary structure is mainly composed of alpha helices and irregularcoils，and thestructure isrelatively stable.Theresultsof homologyand phylogenetictree analysis showed that thesimilarityofPcPGMwith Pleurotusostreatus，Pleurotuspulmonarius，Hypsizygusmarmoreusand Lyophyllum shimeji was 78.04% ， 79.7% ， 71.33% and 67.50% ，respectively，and it was most closely related to P . ostreatus and P pulmonarius，both belonging to the Auriculariaceae family.There were6proteins that might interact with the PcPGM protein， including hexokinase 1 （HXK1）， glucose-6-phosphate isomerase （GPIC）， α -glucan phosphorylase 1 （ α GP1）， （20 α GP2，UTP-glucose-1-phosphateuridylyltransferase1（UGP1）and UGP2，all of which were related to sugar metabolism.This study provides areference for further exploration of the biological functionandmedicinal value of the PGM gene in P .citrinopileatus.

Keywords Pleurotus citrinopileatus;phosphoglucomutase; cloning;bioinformatic

金頂側(cè)耳（Pleurotuscitrinopileatus）是一種珍貴的食、藥用真菌，主要分布于云南、廣西、四川等地1。其憑借高蛋白、低糖、低脂的營(yíng)養(yǎng)特性，在膳食結(jié)構(gòu)中占據(jù)重要地位。Zhang等2研究表明，金頂側(cè)耳具有較高的藥理活性，其子實(shí)體多糖具有免疫增強(qiáng)作用。王沛等3通過(guò)液體搖瓶培養(yǎng)技術(shù)提取的菌液，有效促進(jìn)了小鼠體液免疫與細(xì)胞免疫功能的提升。隨著食用菌全基因組序列的解析，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段調(diào)控其多糖合成途徑中的關(guān)鍵基因，已成為提升多糖產(chǎn)量的重要策略之一[4-6]。

磷酸葡萄糖變位酶（Phosphoglucomutase，PGM）的核心功能是催化葡萄糖-6-磷酸與葡萄糖-1-磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化。其中，葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入分解代謝過(guò)程以產(chǎn)生能量，而葡萄糖-1-磷酸是糖核苷酸的前體，被細(xì)胞用于合成各種多糖。PGM在細(xì)胞壁和多糖生物合成中具有重要功能7。例如，在靈芝中過(guò)表達(dá) α-PGM ，可顯著增強(qiáng)PGM及磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平及相關(guān)酶活性，從而提高靈芝多糖含量。目前，研究人員已在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、玉米（Zeamays）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）[o、廣東蟲(chóng)草（Cordycepsguangdongensis）[等植物和真菌中克隆出PGM基因。然而，有關(guān)金頂側(cè)耳PGM基因的相關(guān)研究較少。為此，本研究以金頂側(cè)耳全基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過(guò)特異性引物對(duì)PGM基因進(jìn)行克隆與生物信息學(xué)分析，為其在食、藥用方面的應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

金頂側(cè)耳由蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院提供。取健康菌絲放于離心管中，液氮速凍并于-80° 冰箱保存，用于總RNA提取。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 收集金頂側(cè)耳新鮮菌絲，取 50～90mg 放入滅菌研缽中，加液氮研磨成粉末狀，按照總RNA快速提取試劑盒（EasyPlantRNAExtractionKit）說(shuō)明書(shū)提取金頂側(cè)耳總RNA，并按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 20μL ，即 1μL 金頂側(cè)耳總RNA;4μL 5× PolestarRTMasterMix（withdsDNase）; 14μL Rnase Free H₂O;1μL （204 20× OligodT（25）amp;RandomPrimer_?O 合成的cDNA稀釋3倍于 -20°C 冰箱保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2PGM的克隆與鑒定 根據(jù)金頂側(cè)耳基因組中已獲得的PGM基因序列，設(shè)計(jì)引物PGM-F： ATGGATTCCTTGCGCCCATTGG;PGM-R：TCAAGGCTTTCCAAGGGAGTGT，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為 25μL （表1）。PCR反應(yīng)體系： 95^°C 預(yù)變性3min ;95℃變性 15s;54.5°C 退火 15s;72^°C 延伸30s，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳。目的基因膠回收采用北京百泰克生物科技有限公司柱式ColumnDNABack試劑盒，后連接 π_pMD 19-T載體并轉(zhuǎn)化Escherichiacoli DH5α 。挑取陽(yáng)性克隆凝膠電泳后，測(cè)序鑒定目的片段。

1.2.3生物信息學(xué)分析 采用DNAMAN軟件進(jìn)行基因片段拼接與氨基酸同源性多重比對(duì);Expasy-ProtParam在線工具分析PcPGM蛋白的理化特性；ProtScale在線程序分析親疏水性；TMHMM軟件分析蛋白跨膜域；SignalP軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；NetPhos3.1軟件預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn);ProtComp9.0軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；SOPMA軟件進(jìn)行PGM基因編碼氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；SWISSMODEL軟件預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);String軟件預(yù)測(cè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1PGM的克隆與鑒定

以金頂側(cè)耳逆轉(zhuǎn)錄后稀釋的cDNA為模板，采用PGM-F/R引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 1% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在 1800bp 處出現(xiàn)單一的目標(biāo)條帶（圖1）。進(jìn)一步的測(cè)序分析得到的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為 1 797bp 。表明已成功克隆了PGM基因的cDNA全長(zhǎng)，并命名為 PcPGM 。

2.2 理化性質(zhì)

由表2可知，PcPGM基因編碼的蛋白質(zhì)由598個(gè)氨基酸組成，分子量為 66.35kDa ，等電點(diǎn)為5.98，是一種酸性蛋白質(zhì)。其中帶正電荷的氨基酸殘基（天冬氨酸 + 谷氨酸， Asp+Glu ）為73，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（精氨酸 ⁺ 賴氨酸， Arg+Lys 為63。親水性（GRAVY值）平均值為-0.278，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為29.54，預(yù)測(cè)該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

2.3親水性、信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)

由圖2A可知，該蛋白中第98位氨基酸親水性最強(qiáng)，得分為-2.933，第112位氨基酸疏水性最強(qiáng)，得分為2.133；親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，且該蛋白部分區(qū)域的氨基酸疏水值小于0，有些甚至小于-2.0，因此推測(cè)該蛋白為親水性蛋白，這與ProtParam預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。由圖2B可知，SignalP-5.0預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽，無(wú)剪切位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白為非分泌蛋白。利用TMHMM分析蛋白跨膜區(qū)域，其跨膜螺旋數(shù)為0，為非跨膜蛋白。

（A）（B）分別為蛋白的親疏水性和信號(hào)肽。

2.4功能結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位和磷酸化位點(diǎn)

由圖3A可知，PcPGM在氨基酸序列1～598的區(qū)域間存在保守結(jié)構(gòu)域，且屬于PTZ00150基因家族。由圖3B可知，PcPGM共含有PKA、CKII、PKC、cdc2、DNAPK和p38MAPK等81個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨 酸磷酸化位點(diǎn)27個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)19個(gè)，酪氨 酸磷酸化位點(diǎn)8個(gè)。ProtComp預(yù)測(cè)結(jié)果顯示， PcPGM定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性較大。

（A）（B）分別為蛋白的功能結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)。

2.5 PcPGM蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

由圖4可知，PcPGM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中 ∝- 螺旋包含258個(gè)氨基酸，占總氨基酸的 43.14% ，無(wú)規(guī)則卷曲包含214個(gè)氨基酸，占總氨基酸的 35.79% ，延伸鏈包含88個(gè)氨基酸，占總氨基酸的 14.72% ，β-折疊包含38個(gè)氨基酸，占總氨基酸的 6.35%_o

2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)

利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)PcPGM基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，共構(gòu)建出4個(gè)PcPCM蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型圖，由圖5A可知，其序列與蟲(chóng)擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispora strain B）M2QNP8_CERS8（PGM）蛋白的結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，序列一致性達(dá) 70.39% ，表明PcPGM的三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬的結(jié)果具有較高的可靠性。進(jìn)一步分析顯示，PcPGM蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由 α- 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。三級(jí)結(jié)構(gòu)模型評(píng)估結(jié)果顯示， 95.3% 以上的氨基酸殘基位于可信區(qū)域內(nèi)（圖5B），Ramachandran異常值為1.01% ，證明了其空間結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。

2.7PcPGM蛋白的序列同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

由表3可知，金頂側(cè)耳與平菇、秀珍菇、真姬菇和玉蕈離褶傘的相似性在 67.50%～78.04% ，說(shuō)明該基因的保守性較高。使用MEGA11軟件中的鄰接法（Neighbor-joiningmethod，NJ）構(gòu)建了PcPGM的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖6可知，11個(gè)PGM氨基酸序列匯聚為兩大支，其中，金頂側(cè)耳與平菇和秀珍菇的親緣關(guān)系較近，處于同一分支，同屬側(cè)耳科。玉蕈離褶傘和真姬菇同屬白蘑科，香菇和磚紅小香菇同屬香菇屬，處于進(jìn)化樹(shù)的同一分支。

2.8蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

由圖7可知，String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析共獲得7個(gè)節(jié)點(diǎn)和36條互作關(guān)系，與PcPGM蛋白可能存在互作關(guān)系的蛋白質(zhì)共有6個(gè)，包括己糖激酶1（Hexokinase-1，HXK1），葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（Glucose-6-phosphate isomerase，GPIC）， α- 葡聚糖磷酸化酶1（Alpha-glucan phosphorylase 1，αGP1 ），αGP2，utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶1（UTP-glucose-1-phosphateuridylyltransferase1，UGP1）和UGP2這些蛋白均是糖代謝相關(guān)的重要酶類，說(shuō)明PcPGM在金頂側(cè)耳糖代謝中具有重要作用。

3結(jié)論與討論

多糖是自然界中廣泛存在的物質(zhì)，是維持生命活動(dòng)不可或缺的成分，主要為生物體提供碳源和能量。金頂側(cè)耳是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的食用菌，因其較高的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用價(jià)值而備受關(guān)注。宋澤文2研究表明，金頂側(cè)耳子實(shí)體、菌絲體或發(fā)酵液中均含有豐富的多糖，且其能夠治療尾部懸吊大鼠所致的肌肉萎縮。PGM是糖代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，其活性對(duì)碳水化合物代謝、能量平衡以及細(xì)胞的整體功能具有重要影響。相關(guān)研究表明，不同真菌PGM基因序列存在一定的差異性，如茯苓PGM與繡球菌PGM、靈芝 PGM 、血紅栓菌 PGM 、冬生多孔菌PGM的同源性分別為 87%.85%.85% 、84%^[13] 。本研究中的同源序列分析表明，不同真菌間PGM基因序列的保守性相對(duì)較高；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析可知，不同真菌PGM蛋白的功能在進(jìn)化上是較為保守的，金頂側(cè)耳與秀珍菇、平菇在進(jìn)化上處于同一分支上，與金頂側(cè)耳親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)同屬香菇屬的香菇和磚紅小香菇也處于同一分支，這些均與分類學(xué)結(jié)果一致。

Li等[14研究表明，細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)以多聚體形式存在，并在細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)功能。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析是從網(wǎng)絡(luò)層面研究蛋白質(zhì)功能及其相互作用的有效方法[15]。本研究利用 String在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，有6種蛋白質(zhì)與PGM互作。其中，己糖激酶不僅在糖代謝中起重要作用，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞能量平衡和感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外糖濃度。此外，己糖激酶1作為一種糖感受器，調(diào)節(jié)與糖代謝相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)路徑[16。葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶是糖酵解和糖異生途徑中的關(guān)鍵酶，催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)化；該酶在能量代謝中發(fā)揮重要作用，幫助細(xì)胞有效利用葡萄糖[17]。 ∝- 葡聚糖磷酸化酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，其通過(guò)催化 α-1，4- 糖苷鍵的磷酸解反應(yīng)，可將葡聚糖鏈中的葡萄糖單元逐步釋放為葡萄糖-1-磷酸[I8]。UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶可將葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖，在細(xì)胞代謝途徑中作為葡萄糖基供體發(fā)揮核心作用[19]。這些蛋白均是糖代謝的重要酶類，表明PcPGM在金頂側(cè)耳糖代謝中扮演著重要角色。

綜上，本研究成功利用金頂側(cè)耳克隆出PGM基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)其進(jìn)行多角度分析。結(jié)果表明，金頂側(cè)耳PGM基因序列全長(zhǎng)為 1 797bp ，編碼598個(gè)氨基酸，為穩(wěn)定、親水性、非分泌蛋白、定位于細(xì)胞質(zhì)；屬于PTZ00150基因家族，具有PGM保守結(jié)構(gòu)域，空間結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，進(jìn)化較為保守；在糖代謝中具有重要作用。本研究為金頂側(cè)耳的糖代謝機(jī)制及其育種與應(yīng)用提供參考。

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（責(zé)任編輯：胡立萍）