小麥TaTPI基因的克隆及其對非生物脅迫的響應

中圖分類號：Q785；Q786 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）10-0029-07

隨著全球氣候變暖的加劇，極端天氣事件如高溫[1]、干旱[2]等正變得越來越頻繁和劇烈。我國小麥種植尤其是冬小麥越冬期間極易遭到低溫脅迫，影響其萌發、生長甚至產量[3]。此外，我國小麥主產區河南部分地區存在土壤鹽漬化[4]等問題。這些極端氣候、環境條件對小麥的生長、種植和發育構成極大的威脅與挑戰，已成為小麥高產穩產的主要制約因素之一。目前，小麥生產上防控逆境脅迫主要采取3種策略：一是選育和推廣抗逆境品種[5-6]；二是優化栽培管理措施，如適期晚播以避開春季倒春寒等低溫時期，或是改良土壤等[7-9]；三是應用植物生長調節劑調控與逆境相關的激素水平[10]。然而，由于缺乏理想的抗性基因資源，生產上真正具有顯著抗性的品種較少。同時，化學抑制劑的使用不僅成本高、操作繁瑣，還可能造成環境污染，難以在生產實踐中大面積推廣應用。因此，克隆小麥抗逆相關基因并深人研究其功能，對于加快小麥利用基因工程技術培育抗逆品種具有重要的理論和實踐意義。

磷酸丙糖異構酶（TPI，編號EC5.3.1.1）是一種催化磷酸二羥丙酮（DHAP）和3-磷酸甘油醛（GAP）可逆轉化的關鍵酶[11-12]。該酶參與糖酵解、卡爾文循環、脂肪酸生物合成等多個代謝途徑，在種子萌發、碳代謝和非生物脅迫響應中發揮重要的調控作用[13-14]。TPI 主要以同源二聚體形式存在，每個亞基由1條多肽鏈組成，蛋白分子量約27.5ku 。不論細菌還是哺乳動物，該酶幾乎在所有生物中都普遍存在[15]。植物體內存在2 種亞細胞定位的TPI，包括參與糖酵解的胞質型TPI（cTPI）和參與卡爾文循環的質體型 。盡管TPI催化的可逆反應長期以來未受到足夠重視，但近年來的研究表明該酶在植物生長發育中具有不可替代的作用。近期國內外對TPI的生物學功能研究日益深人[17-21]。自1986年 Marchionni 首次從玉米中分離出TPI相關基因以來[22，該基因相繼在水稻、燕麥、菠菜、擬南芥等植物中被克隆并進行了初步功能研究。Dorion等研究發現，抑制cTPI表達的轉基因馬鈴薯根系表現出顯著增強的碳代謝和脂質合成能力，根系生長速率明顯快于野生型[23]Sharma等的研究表明，在低溫、過氧化氫和甲基乙二醛脅迫下，水稻OscTPI的轉錄水平上調1.5～2倍[24]。Ito等的研究表明，TPI是氧化脅迫條件下調控糖酵解和三羧酸循環效率的關鍵酶之—[25]。

筆者所在課題組前期通過小麥蛋白組學鑒定到1個在吸漲 ^48h 的籽粒中高表達的胞質型TPI蛋白，推測其可能在非生物脅迫中發揮重要的調控功能。鑒于目前國內外關于小麥TPI的研究較少，本研究以已獲得的TPI部分序列為基礎，通過小麥基因組數據庫比對結合逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術克隆該酶的編碼基因，并系統分析其在不同組織各種非生物逆境[高溫、低溫、高鹽、干旱和脫落酸（ABA）]脅迫下的表達特征，以期為深入闡明該基因在逆境下的生理生化功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料與處理

試驗所用小麥品種為百農207，該品種由筆者所在課題組保存。試驗于2022—2023年在河南農業大學人工氣候室進行。篩選生長狀態一致的小麥種子，經過表面滅菌后置于滅菌水中浸種，室溫下 22～26^°C 吸脹 24h 后進行試驗處理：（1）取部分萌動種子，待其發芽10d后移入土壤中生長直至成熟，期間依次取根、葉片、幼穗、旗葉、莖、花后 25d 的籽粒，作為時空表達分析用材料；（2）另取剩余籽粒，挑選生長狀態一致的小麥種子放入發芽床，用1/2霍格蘭氏（Hoagland's）營養液進行水培養（每2d更換1次營養液），并置于光周期為光照 12h 、黑暗 ^12h ，溫度 25°C 的光照培養箱中培養，2葉1心期后一部分小麥分別放人提前配制的含有100mmol/LNaCl （高鹽） .20% PEG-6000（干旱）、100μmol/L 脫落酸（ABA）的溶液中進行處理；（3）取其余均勻一致的樣品置于溫度為 42，4‰ 的光照培養箱（其余生長條件不變）中，分別作高溫和低溫處理。以正常生長條件下（以1/2霍格蘭氏營養液培養且在正常溫度下生長，無逆境脅迫）的幼苗為對照。分別剪取正常生長條件下（對照）和經歷0.5、1、2、6、12、24、48、72h 脅迫處理的根系，作為表達分析用材料。

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成參照賽默飛公司的Cells-to -CT^TM 試劑盒說明書提取小麥組織總RNA，用新配制的 0.8% 非變性瓊脂糖凝膠檢測小麥總RNA的完整性（是否降解）。用紫外分光光度計測定其在 260.280nm 處的吸光度，濃度達標的樣品才可進行下一步操作。逆轉錄反應參照Invitrogen公司M-MLV逆轉錄試劑盒使用說明進行，將RNA轉化為cDNA。

1.2.2小麥TaTPI基因cDNA編碼框的克隆以篩選所得目的基因部分序列為種子序列，在小麥基因組數據庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）中進行序列比對，根據比對結果在其預測的編碼框兩端用PrimerPremier5.O軟件設計特異性引物F1：5^′ -CCAACCCGATCCGATCTCC-3'和R1： 5^′ -TCCACCACAAAATTACTAGCATAG- 3^′ ，進行PCR擴增。PCR擴增結束后將所獲得的PCR產物回收并測序比對，驗證克隆基因準確性。

1.2.3 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR） 根據熒光定量PCR引物設計原則設計引物， TaTPI-3AS 基因引物F2： 5^′ -ATGGGAGAATCAAGCGAGTT -3^′ 和 R2：5^′ -GTTCGTAAGCGACAAC

CTCA-3'; TaTPI-3BS 基因引物F3：5'-CTGGGTCATTCTTGGACACTCT -3^′ 和R3： 5^′ -CCAGTCCTTGATCTTGCCTGT- ?3^′ TaTPI-3DS 引物 F4：5^′ - TTGTCGCTGAACAGACAAAAGC- 3^′ 和 - CTGTGCCTGAGCCGGTGA -3^′ 。設計小麥看家基因 β -actin（GenBank登錄號：AB181991）引物 F5：5^′ -CCAAGGCGGAGTACGATGAGTCT -3^′ 和 R5：5^′ -TTCATACAGCAGGCAAGCACCAT- 3^′ ，設置3次生物學重復。qRT-PCR反應體系及程序參照SYBRGreenqPCR試劑盒（品牌：TaKaRa）說明書進行。結果計算采用相對定量方法：讀取每個處理相應的 C_T 值后，采用 方法計算[26]

1.2.4生物信息學分析使用DNAstar軟件分析并預測TaTPI基因蛋白序列，利用美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫進行同源性比對;通過NCBI提供的核心生物信息學工具BLAST將克隆基因的cDNA、氨基酸序列與已知的TPI基因進行同源性比對；在NCBI上分析保守結構域；利用MEGA7.0軟件的neighbor－joining算法對不同物種TPI家族基因的親緣關系進行分析。

2結果

2.1小麥TaTPI基因完整編碼框序列的克隆及序列分析

為獲得小麥TPI基因完整編碼序列，以筆者所在課題組前期獲得的部分cDNA序列為種子序列，檢索小麥基因組數據庫。根據比對結果在預測的完整編碼框兩側設計特異性引物F1和R1，以小麥開花后20d的籽粒cDNA為模板進行PCR擴增。擴增結果（圖1）顯示，1、2泳道均在 750～1 000l p區間擴增出長度為 914bp 的特異性條帶。將目標條帶回收并進行轉化，測序結果證實所克隆的片段為目標序列。使用DNAMAN軟件與已知序列比對，獲得3條高度同源的cDNA序列。通過URGI數據庫（https：//wheat-urgi.versailles.inra.fr/）比對分析發現，克隆獲得的TPI基因定位于小麥第3染色體短臂上，據此將這3條序列分別命名為TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS。

序列分析顯示（圖2），TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS的cDNA全長分別為91O、908、910bp 。其中 5^′UTR （非翻譯區）長度分別為35、31、34bp，3'UTR長度分別為113、115、114bp，均含有1個長度為 762bp 的開放閱讀框（ORF），編碼253個氨基酸。預測的蛋白質分子量分別為26.77、 ，理論等電點分別為5.57、5.38、5.38，均屬于酸性蛋白。通過NCBI保守結構域分析顯示，這3個基因均屬于TIM超家族。DNAMAN序列比對分析顯示，3條cDNA序列的一致性為97.27% 。其中，編碼區序列相對保守，僅存在單核苷酸多態性（SNP）差異；而在 5^′UTR 和 3^′ UTR存在多處堿基的缺失或插入。

2.2小麥TaTPI編碼的氨基酸序列分析

使用DNAMAN軟件對克隆獲得的3條TaTPI基因編碼的氨基酸序列，并進行比對分析（圖3）。結果顯示，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS蛋白在8個位點存在差異，分別位于第2、54、142、152、153、161、203、223位氨基酸殘基。保守結構域分析表明，TaTPI-3AS與TaTPI-3BS編碼的蛋白的保守區域存在5處差異， TaTPI-3BS 與TaTPI-3DS編碼的蛋白的保守區域存在8處差異。通過NCBIBLAST分析比較克隆獲得的小麥TaTPI蛋白序列與已知TPI蛋白的同源性。結果顯示，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS蛋白與二穗短柄草（ XP-OO3568647.I） 的相似度分別為 91.34% ！90.12% （204號 90.94% ，與大麥（ ?KAE876802I.I） 的相似度分別為 94.49%.94.07%.93.70% 。這些結果進一步證實克隆獲得的基因為小麥TPI基因。上述結果表明，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS這3個同源蛋白之間存在一定的氨基酸序列差異，這種差異可能導致它們在小麥基因表達過程中采用不同的調控方式。

2.4小麥TaTPI的表達特性分析

2.4.1小麥TaTPI的時空表達特性為探究TaTPI基因在小麥生長發育階段不同組織中的表達模式，選取小麥的根、葉片、幼穗、旗葉、莖、花后25d的籽粒進行qRT-PCR分析。結果（圖5）表明，3個同源基因在所檢測的組織中均可檢測到表達，且呈現相似的表達模式：TaTPI-3BS、TaTPI-3DS均在幼穗中相對表達量最高，其次為旗葉和莖，葉片、根中也有一定表達，而在籽粒中的表達量相對較低，表明該基因具有明顯的組織特異性表達特征。進一步分析發現，3個基因的表達水平存在差異。幼穗中，TaTPI-3DS的相對表達量顯著高于TaTPI-3BS、TaTPI-3AS。

2.4.2小麥TaTPI在不同脅迫處理條件下的表達特性分析為了進一步明確TaTPI在轉錄水平上對高溫、低溫、高鹽、干旱、ABA等逆境條件的響應特征，利用qRT-PCR分析了TaTPI在上述條件下的表達模式。結果（圖6）表明， 100μmoL/L ABA處理下， TaTPI-3AS，TaTPI-3BS 均在處理 0.5h 后表達水平迅速上調， ¹h 后快速下調，之后維持在一個相對平穩的水平； TaTPI-3DS 表達水平表現出相類似的變化趨勢，但該基因下調速率相對滯后，在處理1h后才開始下降。TaTPI基因在ABA處理過程中，相對表達量均明顯低于對照，說明該基因可能是依賴于ABA調控的基因。

在極端溫度 （4，42‰ ）處理下，TaTPI基因在小麥根系中表現出明顯的誘導表達特性。但不同基因之間有些許差異。在整個脅迫處理過程中，除TaTPI-3BS在低溫下表達無特異性外， TaTPI 表達水平整體上呈先下調后上調的趨勢， 4，42^°C 處理下，TaTPI-3AS在 2h 后開始上調，TaTPI-3DS在^1h 后開始上調，在 42°C 處理下TaTPI-3BS表現為在 6h 后開始上調。雖然表達水平在脅迫中后期有所波動，但3個基因表達水平均低于對照，表明該基因可能在脅迫初期應對極端溫度保護中起著重要的調控作用。

在100mmoL/LNaCl處理下，TaTPI基因在對照和處理中的表達均呈現先下降后上升再維持相對較高表達的變化趨勢，即在脅迫 0.5h 后表達下調至極小值后， 6h 后又開始上調并維持一個相對較高的表達水平。在整個脅迫處理過程中，TaTPI基因的表達量明顯低于對照。

在 20% PEG6000處理下，小麥根系中TaTPI基因表達水平呈現出與NaCl處理類似的變化趨勢。TaTPI-3AS，TaTPI-3BS，TaTPI-3DS 相對表達量均在脅迫 0.5h 時達到較高水平后下調，至 ¹h 達到最低值后開始上調并在處理后期維持一個相對較高的水平，但在表達量上存在差異。在整個脅迫處理過程中， TaTPI-3AS，TaTPI-3BS 表達水平始終低于對照，而TaTPI-3DS在脅迫處理的12、48、^72h 高于對照，表明3個基因可能在干旱脅迫后期的脫水保護中起著不同的調控功能。

3結論與討論

植物對環境脅迫的感知和調節機制非常復雜，涉及許多脅迫響應相關基因的表達與調控。TPI家族蛋白的生物學功能研究一直備受關注，但現有研究主要集中在動物系統，而在植物生長發育方面的研究相對有限。TPI家族在植物的新陳代謝中發揮著重要作用，幾乎所有涉及三糖磷酸酯的代謝途經（如糖酵解、糖異生、戊糖磷酸途徑、脂肪酸生物合成等）均有TPI 酶的參與[27-28]，并且有研究表明TPI基因在響應植物逆境方面發揮著重要的作用[29-31]。為此，為了驗證其功能，本研究從普通小麥中成功克隆了3個TPI同源基因的完整編碼序列。序列分析表明，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS的cDNA全長分別為910、908、910bp，它們均包含762bp的開放閱讀框（ORF），序列間存在38個單核苷酸多態性（SNP）位點。氨基酸序列分析顯示，這3個基因均編碼253個氨基酸殘基，但在第2、54、142、152、153、161、203、223位等8個位點存在氨基酸差異，提示這些同源基因可能在小麥生長發育過程中參與不同的調控過程。

熒光定量PCR分析發現，3個TaTPI同源基因在不同組織中的表達模式基本一致，在根、葉片、幼穗、旗葉、莖、花后25d的籽粒中均有表達，其中幼穗中表達量高于其他組織。前人的研究表明，馬鈴薯葉片在快速生長期間TPI活性增強[23]，這與本研究試驗結果一致。為進一步闡明TaTPI基因在抵抗逆境中的作用，通過施加脅迫（高溫、低溫、高鹽、PEG 模擬干旱、添加ABA）推測其對脅迫的響應強度。結果表明，與對照相比，除PEG處理外，TaTPI-3AS、TaTPI-3BS、TaTPI-3DS在逆境脅迫整個時期均表現為下調； TaTPI-3DS 在PEG處理下前期也表現為下調，在PEG處理 12，48，72h 表現為上調。這些結果表明，TaTPI基因的表達與植物逆境抗性密切相關，且相似的表達模式提示這3個同源基因在植物響應逆境脅迫過程中可能起著相似的調控作用。

然而，TaTPI基因在逆境響應過程中的具體作用機制尚需進一步研究，包括探究TaTPI基因與其他調控因子的互作關系，驗證其在植物逆境抗性形成中的因果關系，闡明3個同源基因功能分化的分子機制等。這些研究將為培育逆境抗性小麥品種提供重要的理論基礎。

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