靶向c-Met的CAR-NK細(xì)胞免疫治療胃癌的體外研究

[摘要] 目的 探討靶向細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）的嵌合抗原受體NK（chimeric antigen receptor-NK，CAR-NK）細(xì)胞在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制和殺傷作用。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）、蛋白質(zhì)免疫印跡法、反轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株（MKN-45、GTL-16和NCI-N87）和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中c-Met的蛋白和核酸水平表達(dá)情況；通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-Met CAR對(duì)高表達(dá)c-Met的胃癌細(xì)胞株GTL-16的特異性識(shí)別作用；通過慢病毒載體構(gòu)建靶向c-Met的CAR-NK細(xì)胞，并應(yīng)用FCM檢測(cè)CAR-NK細(xì)胞的感染效率和細(xì)胞表型；通過乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)c-Met CAR-NK細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞株和胃黏膜上皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果 在核酸水平和蛋白水平，c-Met均顯著高表達(dá)于胃癌細(xì)胞株GTL-16和MKN-45，低表達(dá)于胃癌細(xì)胞株NCI-N87和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1。FCM結(jié)果顯示c-Met CAR-NK感染率為（14.97±0.25）%，c-Met CAR病毒感染并未影響NK-92細(xì)胞的表型。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染c-Met CAR質(zhì)粒的Lenti X-293T細(xì)胞靶向結(jié)合至胃癌細(xì)胞GTL-16周圍。LDH殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，c-Met CAR-NK相較于NK-92對(duì)高表達(dá)c-Met的胃癌細(xì)胞株GTL-16和MKN-45具有更顯著的殺傷效果（Plt;0.05）。按照效靶比10∶1時(shí)c-Met CAR-NK與高表達(dá)c-Met的胃癌細(xì)胞株GTL-16和MKN-45共培養(yǎng)時(shí)，可顯著釋放出更多的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和干擾素（interferon，IFN）-γ（Plt;0.05）。結(jié)論 本研究構(gòu)建的c-Met CAR-NK細(xì)胞具有特異性識(shí)別并靶向殺傷高表達(dá)c-Met的胃癌細(xì)胞的能力，且有較強(qiáng)的殺傷效應(yīng)功能，能釋放出更多的TNF-α和IFN-γ。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子；嵌合抗原受體NK細(xì)胞；細(xì)胞免疫治療；胃癌

[中圖分類號(hào)] R735.2" """"[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.20.008

In vitro study of CAR-NK cell immunotherapy targeting c-Met for gastric cancer

LU Huifei， MAO Liqi， WEI Guijun

Department of Gastroenterology， the First People’s Hospital of Huzhou， Huzhou 313000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigates the inhibitory and cytotoxic effects of chimeric antigen receptor-engineered natural killer （CAR-NK） cells targeting cellular-mesenchymal epithelial transition factor （c-Met） against gastric cancer （GC） cells in vitro. Methods c-Met expression at protein and mRNA levels was evaluated in GC cell lines （MKN-45， GTL-16， NCI-N87） and gastric mucosal epithelial cells （GES-1） by using flow cytometry （FCM）， Western blot， and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction. Immunofluorescence assays were conducted to confirm c-Met CAR-mediated specificity toward c-Met-overexpressing GTL-16 cells. Lentiviral vectors were utilized to construct c-Met-targeting CAR-NK cells， with transduction efficiency and phenotypic integrity verified by FCM. Cytotoxic activity against GC cells and normal epithelial cells was quantified via lactate dehydrogenase （LDH） release assays and cytokine secretion measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results c-Met exhibited significantly higher expression in GTL-16 and MKN-45 cells at both transcriptional and protein levels compared to NCI-N87 and GES-1 cells （Plt;0.05）. CAR-NK cells demonstrated a transduction efficiency of （14.97 ± 0.25）% without altering NK-92 cell phenotypes. Immunofluorescence confirmed specific binding of c-Met CAR-expressing Lenti-X-293T cells to GTL-16 targets. LDH assays revealed enhanced cytotoxicity of c-Met CAR-NK cells against c-Met-high GC cells （GTL-16， MKN-45） versus untransduced NK-92 controls （Plt;0.05）. At a 10：1 effector-to-target ratio， c-Met CAR-NK cells co-cultured with c-Met-high GC cells secreted significantly elevated tumor necrosis factor（TNF-α） and interferon（IFN）-γ （Plt;0.05）. Conclusion The c-Met CAR-NK cells constructed in this study have the ability to specifically recognize and target to kill gastric cancer cells with high expression of c-Met， and have a strong killing effect function， which can release more TNF-α and IFN-γ.

[Key words] Cellular-mesenchymal epithelial transition factor; Chimeric antigen receptor natural killer cells; Cellular immunotherapy; Gastric cancer

胃癌（gastric cancer，GC）為消化系統(tǒng)的高發(fā)惡性腫瘤，現(xiàn)階段臨床對(duì)GC仍以外科手術(shù)切除結(jié)合放化療為主要干預(yù)方案，但由于術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移頻發(fā)，多數(shù)患者的臨床結(jié)局較差、5年生存率未達(dá)預(yù)期^[1-3]。隨著基因編輯技術(shù)與免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域的突破，過繼性細(xì)胞免疫療法作為新型治療策略正受到廣泛關(guān)注^[4-6]。

嵌合抗原受體自然殺傷（chimeric antigen receptor NK，CAR-NK）細(xì)胞免疫治療是基于遺傳編輯技術(shù)對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行工程化改造，將包含特異性抗原結(jié)合域與NK細(xì)胞活化信號(hào)模塊的基因序列導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，賦予NK細(xì)胞特異性識(shí)別腫瘤表面抗原的能力，并通過激活內(nèi)源性殺傷信號(hào)通路觸發(fā)細(xì)胞毒作用，釋放穿孔素與顆粒酶素B等效應(yīng)分子介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞裂解^[7-8]。實(shí)體瘤抗原異質(zhì)性是造成腫瘤逃逸和細(xì)胞免疫治療的主要限制性因素，因此尋找合適的靶點(diǎn)對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫治療至關(guān)重要。細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）是Met基因編碼產(chǎn)生的具有磷酸酶活性的跨膜受體，已被證實(shí)在肝癌、胃癌和肺腺癌等多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，且造成腫瘤的不良預(yù)后^[9]。研究表明c-Met通路的異常激活可促進(jìn)GC進(jìn)展及導(dǎo)致GC多線耐藥，c-Met可作為胃癌免疫治療的理想靶點(diǎn)^[10]。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染方式構(gòu)建c-Met CAR-NK細(xì)胞，并利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)估其抗胃癌效果。

1 "材料與方法

1.1 "細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

胃癌細(xì)胞株（GTL-16、MKN-45和NCI-N87）、胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及X-293T細(xì)胞均由湖州市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞因子和添加劑均購自美國Gibco公司；流式抗體均購自美國Biolegend公司；c-Met單克隆抗體和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）二抗均購自美國CST公司；DAPI和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購自中國上海碧云天公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自中國武漢三鷹公司；細(xì)胞總RNA、反轉(zhuǎn)錄、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自美國Corning公司。qPCR儀器購自美國BIO-RAD公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek公司；化學(xué)發(fā)光儀器購自中國上海天能公司；共聚焦顯微鏡購自德國ZEISS公司。

1.2 "細(xì)胞培養(yǎng)

胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和X-293T培養(yǎng)基配方：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基90%，F(xiàn)BS 10%，P/S 1%；胃癌細(xì)胞株MKN-45、NCI-N87和GTL-16培養(yǎng)基配方：RPMI-1640培養(yǎng)基90%，F(xiàn)BS 10%，P/S 1%。NK-92細(xì)胞培養(yǎng)基配方：參考文獻(xiàn)[7]培養(yǎng)條件。放置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)擴(kuò)增。

1.3 "實(shí)驗(yàn)方法

胃癌細(xì)胞株及胃黏膜上皮細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參基因，以c-Met為目的基因，并按照公式算出c-Met的相對(duì)表達(dá)量。各細(xì)胞株經(jīng)WB法提取總蛋白，蛋白濃度測(cè)定后放置于金屬浴，95℃ 10min煮樣變性。將各組蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育后充分洗滌，化學(xué)曝光檢測(cè)后進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析并作圖比較。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM），各細(xì)胞株經(jīng)PBS洗滌3次后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，控制每管細(xì)胞數(shù)量為3×10⁵，并用100μl PBS重懸細(xì)胞沉淀，于各組細(xì)胞樣品中加入相應(yīng)流式抗體并放置于4℃避光孵育30min，孵育結(jié)束后經(jīng)PBS洗滌，用300μl PBS重懸細(xì)胞沉淀后細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，F(xiàn)CM儀器上機(jī)檢測(cè)并分析。

1.4 "c-Met CAR-NK細(xì)胞制備

將2×10⁵個(gè)NK-92細(xì)胞加入至提前準(zhǔn)備RetroNectin預(yù)包被的6孔板，并加入polybrene（1mg/ml）促感染試劑。按照MOI=50將c-Met CAR慢病毒感染NK-92細(xì)胞制備c-Met CAR-NK細(xì)胞，放置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將經(jīng)c-Met CAR慢病毒感染的X-293T細(xì)胞與高表達(dá)c-Met的GTL-16共培養(yǎng)12h后加入PBS浸沒漂洗，細(xì)胞經(jīng)甲醇固定、0.2% TritonX-100通透及5% BSA封閉后，滴加經(jīng)抗體說明書稀釋的c-Met一抗于4℃避光孵育過夜；次日經(jīng)PBS浸沒漂洗后滴加經(jīng)稀釋的熒光二抗，放置于37℃避光孵育1h，緩慢加入PBS浸沒漂洗3次，加入DAPI進(jìn)行核染，避光孵育10min并加入PBS緩沖液漂洗4次，包上錫紙，放置于共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.5 "c-Met CAR-NK細(xì)胞的殺傷能力檢測(cè)

靶細(xì)胞：經(jīng)離心收集MKN-45、GTL-16、NCI-N87和GES-1并調(diào)整細(xì)胞濃度后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；效應(yīng)細(xì)胞：收集c-Met CAR-NK和NK-92細(xì)胞，并按照梯度效靶比（20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1）調(diào)整細(xì)胞濃度，并將各梯度的效應(yīng)細(xì)胞加入至靶細(xì)胞中進(jìn)行共培養(yǎng)，各濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置樣本孔、高對(duì)照孔和低對(duì)照孔；效靶細(xì)胞共孵育24h；按照試劑盒說明書添加試劑后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處A值并計(jì)算細(xì)胞損傷效率。效靶細(xì)胞以固定效靶比的比例共培養(yǎng)24h，并收集各組共培養(yǎng)上清備用。采用ELISA法測(cè)定各組上清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和干擾素（interferon，IFN）-γ的濃度。

1.6 "統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和雙因素方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Graphpad Prism和ImageJ軟件進(jìn)行分析及繪圖。

2 "結(jié)果

2.1 "c-Met mRNA在胃癌細(xì)胞系的表達(dá)水平比較

與胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1比較，c-Met顯著性高表達(dá)于胃癌細(xì)胞株MKN-45和GTL-16中（F=73.573，Plt;0.05）。WB法結(jié)果顯示c-Met顯著高表達(dá)于GTL-16和MKN-45中，低表達(dá)于GES-1和NCI-N87中（Plt;0.05），見圖1。FCM結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞株（GTL-16、MKN-45、NCI-N87）和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中c-Met蛋白的表達(dá)量分別為99.6%、87.1%、26.5%和0.023%。

2.2" c-Met CAR-NK感染效率及靶向識(shí)別功能分析

c-Met CAR-NK感染效率為（14.97±0.25）%，CAR病毒感染并未對(duì)NK-92細(xì)胞表型產(chǎn)生影響。通過激光共聚焦成像結(jié)果顯示，c-Met CAR陽性細(xì)胞特異性聚集并吸附于c-Met高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株GTL-16周圍，證實(shí)本研究構(gòu)建的c-Met CAR-NK細(xì)胞具備靶向識(shí)別并共定位于腫瘤表面c-Met抗原的功能，見圖2。

2.3" c-Met CAR-NK對(duì)c-Met高表達(dá)胃癌細(xì)胞株的特異性殺傷效果分析

將效應(yīng)細(xì)胞（c-Met CAR-NK細(xì)胞組和NK-92細(xì)胞組）與靶細(xì)胞（胃癌細(xì)胞株GTL-16、MKN-45、NCI-N87及胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1）共培養(yǎng)，LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在高表達(dá)c-Met胃癌細(xì)胞株GTL-16和MKN-45中，c-Met CAR-NK具有極強(qiáng)的殺傷效果能力，且殺傷效果與效靶比呈正相關(guān)（Plt;0.05）。而在低表達(dá)或不表達(dá)c-Met胃癌細(xì)胞株NCI-N87和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中，c-Met CAR-NK細(xì)胞組與NK-92細(xì)胞組的殺傷效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。經(jīng)LDH實(shí)驗(yàn)確定固定效靶比為10：1，固定效靶后與NK-92細(xì)胞比較，c-Met CAR-NK細(xì)胞在與c-Met高表達(dá)胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，IFN-γ和TNF-α效應(yīng)因子釋放水平呈顯著提升（Plt;0.05）。

3 "討論

胃癌的臨床防治面臨多重挑戰(zhàn)，晚期胃癌患者5年生存率不足20%^[11]。當(dāng)前臨床干預(yù)仍以手術(shù)切除為核心，但約50%的患者確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，放化療及靶向治療易受腫瘤異質(zhì)性和微環(huán)境免疫抑制影響，存在應(yīng)答率低及耐藥問題^[12-13]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑客觀緩解率低，凸顯實(shí)體瘤免疫治療瓶頸，因此亟需新型療法^[14-15]。

CAR-NK細(xì)胞免疫治療作為免疫治療新方向，是近年來癌癥免疫治療領(lǐng)域的重要突破。CAR-NK通過基因工程改造技術(shù)，將帶有特定的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)活化分子轉(zhuǎn)導(dǎo)入NK細(xì)胞內(nèi)，增強(qiáng)其靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，已展現(xiàn)出顯著優(yōu)于傳統(tǒng)CAR-T療法的潛力^[16-17]。

缺乏特異性靶點(diǎn)是細(xì)胞免疫治療實(shí)體瘤的主要限制性因素，本研究采用c-Met作為治療胃癌的特異性靶點(diǎn)。c-Met是一種受體酪氨酸激酶，其配體為肝細(xì)胞生長因子^[18]。研究證實(shí)c-Met是促瘤基因，在多種實(shí)體瘤中高度表達(dá)，尤其是胃癌、肺癌、肝癌及乳腺癌，其信號(hào)通路的異常激活（如基因擴(kuò)增、突變或過表達(dá)）與多種實(shí)體瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性密切相關(guān)^[19]。本研究經(jīng)RT-qPCR、WB法和FCM實(shí)驗(yàn)，從核酸水平和蛋白水平分別驗(yàn)證c-Met在胃癌細(xì)胞株和胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平，并成功篩選c-Met高表達(dá)胃癌細(xì)胞株（GTL-16和MKN-45）、c-Met低表達(dá)胃癌細(xì)胞株NCI-N87及不表達(dá)c-Met的胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

本研究中FCM檢測(cè)CAR-NK細(xì)胞的感染效率較低，推測(cè)可能與慢病毒感染方式有關(guān)，為改善NK細(xì)胞的感染效率。本研究qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，成功構(gòu)建的c-Met CAR-NK細(xì)胞能特異性識(shí)別并靶向結(jié)合至胃癌腫瘤細(xì)胞膜表面抗原c-Met，證明c-Met CAR-NK細(xì)胞的靶向定位能力。本研究LDH細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，c-Met CAR-NK細(xì)胞在與c-Met高表達(dá)胃癌細(xì)胞（GTL-16和MKN-45）共培養(yǎng)體系中，具有更顯著的殺傷效果，證明c-Met CAR-NK的特異性靶向殺傷效率與胃癌腫瘤細(xì)胞膜表面c-Met表達(dá)水平高低密切相關(guān)。且相較于NK-92細(xì)胞，c-Met CAR-NK細(xì)胞顯現(xiàn)更顯著的殺傷效果，該結(jié)果進(jìn)一步揭示以c-Met作為胃癌的特異性靶點(diǎn)的優(yōu)越性。研究表明CAR-NK靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的過程中可分泌大量效應(yīng)性細(xì)胞因子，如IFN-γ和TNF-α細(xì)胞因子通過激活免疫細(xì)胞、調(diào)控炎癥和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡清除病原體或異常細(xì)胞，具有一定的抗腫瘤作用^[20]。本研究ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的釋放水平與c-Met表達(dá)水平呈正相關(guān)。LDH殺傷實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同揭示以c-Met作為靶點(diǎn)構(gòu)建的c-Met CAR-NK細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞株的特異性殺傷效果及在較低的感染效率下仍能展現(xiàn)顯著的特異性殺傷效應(yīng)。

本研究采用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證c-Met CAR-NK對(duì)胃癌的殺傷效率，因此缺乏克服體內(nèi)實(shí)體瘤腫瘤異質(zhì)性的有力證據(jù)。綜上，本研究構(gòu)建的c-Met CAR-NK能特異性識(shí)別并靶向殺傷高表達(dá)c-Met的胃癌細(xì)胞，且分泌大量細(xì)胞因子。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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