蝴蚶菊發酵液對根結線蟲和斜紋夜蛾的生物活性

中圖分類號：S476+.9 文獻標志碼：A 文章編號：：1673-2871（2025）07-182-07

Biological activity of Wedelia chinensis fermentation solution against Meloidogyne incongnita and Spodoptera litura

PANG Xiaowen， XIE Qinming （FisheriesCollegeofJimeiUniversity，Xiamen36lo21，Fujian，Cina）

Abstract： Inorder to develop the application of theinvasive alienplant Wedelia chinensis incrop pestcontrol，this paper investigatedthebiologicalactivityofdifferentconcentrationsofWedeliachinensis fermentationsolutionagainst twopests （Meloidogyne incongnitaand Spodoptera litura）inthefollowing twosetsofexperiments，one testisusingdiferentconcentrationsofWedeliachinensis fermentationsolution（stock solutionFB，diluted1OtimesFB10，anddiluted1times FB100）for indoorcontact-test against root-knot nematode second stagejuvenile（J2）;theother test is using diferentconcentrationsofWedeliachinensisfermentationsolution（diluted5timesFB5，diluted15timesFB15，anddiluted45times FB45）forsoaking taro leaves andthen fed to larvae of Spodoptera litura，andthe growthand development of Spodoptera litura wasobservedandrecorded.Both twosetsofexperimentsusedsterile waterasacontrolgroup;thechemicalcomponentsofWedeliachinensis fermentationsolutionalsowereanalyzedbyLC-MSmethod.Theresultsofthetestsshowed thathe Wedeliachinensis fermentationsolutionhadsomenematicidalactivitytorot-knotnematodesJ2，whenroot-knot nematodes J2 were treated with FB for 24h ^48h and ^72h ，thecorrected mortality rates were 25.54% 24.67% ，and 24.89% ，respectively.Moreover，after 48h and 72h of treatmentwithFB10 and FB1oo，the corrected mortality ratesof root-knot nematodes J2 both were above 10% .Thecorrected mortality rateof Spodoptera litura lst instar larvae was 34.15% bytheFB.TheFB5，FB15inhibitedthegrowthand developmentofSpodopteralitura larvae，delayedtheirdevelopmental period and reduced pupal mas，but there is no significantly diference compared to the control group.Among thechemical components ofWedelia chinensis fermentation solution，proportion of betaine is 8.78% ，proportion of homogentisic acid is 5.23% ，proportionof2，3-Dihydroxybenzoic acid is 3.04% ，and proportionof D -tartaricacidis 2.53% . In conclusion，the Wedeliachinensis fermentationsolutionhascertainbiologicalactivitiesagainstroot-knotnematodeand Spodoptera lituralarvae，whichcanbeusedasareferencefor thelaterdevelopmentofplantprotectionagentsofherbalorigintargeting the preventionandcontrolofroot-knot nematodeand Spodoptera lituralarvae andother harmful organisms. Keywords：Wedeliachinensis;Fermentationsolution;Melodogyneincongnita;Spodopteralitura;Bioactivity;Copositional analysis

我國是一個農作物種植、生產大國，而病蟲害對作物的產量和品質都有較大的影響，病蟲害已成為制約我國農業生產和可持續發展的重要因素之一。番茄生產過程中容易受到有害生物如根結線蟲（Meloidogyneincongnita）、斜紋夜蛾（Spodopteralitura）等侵害，無論是單一或者疊加的病蟲害均會加劇番茄植株的生理脅迫，最終由于防治困難而導致作物的減產減質。據統計報道，我國病蟲害造成的農作物產量損失高達 30% 以上。目前我國農業生產對有害生物的防治措施主要還是使用化學藥劑，雖然化學藥劑有用量少、作用快、效率高等特點，但化學農藥一般具有高毒性、高污染性，還會使害蟲產生耐藥性。因此，尋找安全高效的生物防治措施是大勢所趨。

植物在生長發育過程中，會合成大量化學結構多樣且具有獨特機制的次生代謝活性物質，據報道已超過40萬種，如木脂素類、生物堿、黃酮、酚類、萜烯類等均有一定的生理活性，有的可以通過化感作用影響植物的生長發育，且具有抗蟲、殺蟲作用。通過深入研究這些植物次生代謝產物的結構與功能，人們可以將這些物質直接或間接應用于農業生產上。菊（Wedeliachinensis）是菊科嘭菊屬多年生草本植物，原產于美洲，20世紀70年代作為地被植物引入我國，已被列為“世界上最有害的100種外來入侵物種\"之一，也是一種廣泛分布于中國南方各省份的資源量大的植物。研究表明，該植物含有三萜類化合物、二萜類化合物、倍半萜類化合物、類黃酮、有機酸和類固醇等活性物質，具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗微生物等功能4。同時在植物保護領域也有抗蟲、殺蟲的功效，有研究表明，嘭蝶菊提取液對萵苣指管蚜幼蟲有顯著的毒殺作用， 7.5% 的濃度毒殺效果最明顯5。南美菊精油對赤擬谷盜、玉米象和綠豆象均有一定的熏蒸毒力、觸殺毒力，對綠豆象種群抑制作用最明顯，種群抑制率為 37.63%～67.86%^[6] 。因此嘭菊中的活性物質是優良的植物保護劑，具備開發利用價值，將其開發成植物源農藥，能變害為利，既可控制入侵植物的危害，又能生產出對環境安全無公害的植物源農藥產品。

目前，嘭菊發酵液對根結線蟲、斜紋夜蛾等有害生物的生物活性鮮有報道。通過微生物發酵法工藝制備菊發酵液，研究該發酵液對根結線蟲、斜紋夜蛾的生物活性，并通過LC-MS技術分析嘭菊發酵液的化學組分，以探討是何種活性成分可能對有害生物的生長發育起控制作用，以期為菊提取液對作物害蟲的防控提供參考依據。

1材料與方法

1.1材料

嘭蝶菊取自廈門地區野外，干燥后粉碎，制成干粉末（過20自篩）備用；南方根結線蟲采自廈門集美后溪鎮蔬菜種植基地；斜紋夜蛾蟲卵購于科云生物有限公司；枯草芽孢桿菌由山東蘇柯漢生物工程股份有限公司提供；微生物菌劑由沃寶生物科技有限公司提供；纖維素酶、果膠酶由正宏生物科技有限公司提供；面包改良劑為師傅300復配面包酶制劑。

1.2 方法

1.2.1發酵液的制備方法發酵液配方為： 1kg 蝴菊干粉末， 30g 面包改良劑， 2g 枯草芽孢桿菌，10g 微生物菌劑， 2g 纖維素酶， 8g 果膠酶，與 15L 水混合均勻，將混合物裝入塑料桶中發酵，發酵起始溫度為 30～40^°C ，發酵時間30～50d，即可得到蝶菊發酵液母液 （67mg?mL^-1 ，FB）。

1.2.2線蟲懸浮液的制備于2023年5月從廈門集美后溪鎮蔬菜種植基地采集帶有根結的病根，將病根沖洗干凈，在解剖鏡下用鑷子或撥針挑取根結線蟲卵囊，置于鋪有兩層面巾紙的干凈培養皿上，3～5d后收集2齡幼蟲備用。

1.2.3發酵液殺線蟲活性的生物測定按發酵液濃度設置為3個處理：母液（FB）、稀釋10倍（FB10）、稀釋100倍（FB100）。然后用移液槍吸取100μL 線蟲懸浮液（30～50條）于24孔細胞板上，再分別吸取 100μL 不同倍數稀釋液，充分混合，蓋上24孔板，置于室溫下避光。同時以加 100μL 無菌水為空白對照（CK），3次重復。在處理24、48、72h后分別觀察菊發酵液處理組和對照組線蟲的死亡情況，加入1～2滴 1% 的 ΔNaOH 溶液，如果線蟲保持不動，則認為線蟲死亡[7-8]。在顯微鏡下觀察、統計線蟲的存活數和死亡數，計算線蟲死亡率和校正死亡率。

死亡線蟲數 ×100 線蟲死亡率/%=供試線蟲數

校正死亡率 /%=

處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率 ×100 。1-對照組線蟲死亡率

殺線蟲活性強弱的五級標準：校正死亡率≤10% ，用“-\"表示，為無活性；校正死亡率 10%～30% ，用“ + ”表示，為弱活性；校正死亡率 gt;30%～50% ，用4 ⁺⁺ ”表示，為中等活性；校正死亡率 gt;50%～80% ，用《 +++ ”表示，為較強活性；校正死亡率在 gt;80% ，用4 ++++ ”表示，為強活性]。

1.2.4發酵液對斜紋夜蛾幼蟲生長發育的影響試驗于2023年9月中旬開始，對菊發酵液母液進行稀釋，分別稀釋5倍（FB5）、15倍（FB15）、45倍（FB45），并以等量無菌水為對照（CK），用對應的稀釋后的藥液浸泡芋頭葉 1min 后取出晾干，放入培養管中。每個培養管放入10頭斜紋夜蛾幼蟲，每個處理重復5次。試驗開始后每天觀察幼蟲的蛻皮情況，并記錄蛻皮蟲數，計算幼蟲的發育歷期，時間單位為d。待幼蟲化蛹后稱測蛹質量，質量單位為mg。

1.2.5發酵液成分分析2024年3月，將菊發酵液在 4^°C 解凍，解凍后渦旋 1min ，混合均勻；精確移取適量樣本于 2mL 離心管中，濃縮干燥；接著加入 500μL 甲醇溶液到干燥后的樣本管中，渦旋1min;12000r?min^-14^°C 離心 10min ，取全部上清液，轉移至新的 2mL 離心管中，濃縮干燥；加入 150μL 80% 甲醇水配制的2-氯-L-苯丙氨酸 （4mg?L^-1） 溶液復溶樣品，取上清液過 0.22μm 膜，過濾液加入到檢測瓶中，用于LC-MS檢測。

色譜條件：使用ACQUITYUPLC HSS T3（2.1×100mm，1.8μm） 色譜柱， 0.3mL?min^-1 的流速，40^°C 的柱溫，進樣量 2μL 。正離子模式，流動相為0.1% 甲酸乙腈（B2）和 0.1% 甲酸水（A2），梯度洗脫程序為： 0～1min 8% B2； 1～8min ， 8%～98% B2; 8～ 10min ， 98% B2； 10～10.1min ， 98%～8% B2; 10.1～ 12min ， 8% B2。負離子模式，流動相為乙腈（B3）和 5mol?L^-1 甲酸銨水（A3），梯度洗脫程序為：0～1min ， 8% B3； 1～8min . 8%～98% B3; 8～10min98% B3; 10～10.1min ， 98%～8% B3；10.1～12 min，8% B3。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正負離子模式分別采集數據。正離子噴霧電壓為 3.50kV ，負離子噴霧電壓為 -2.50kV ，鞘氣 40arb ，輔助氣 10arb 。毛細管溫度為 325^°C ，以分辨率70000進行一級全掃描，一級離子掃描范圍 100～1000m?z^-1 ，并采用HCD進行二級裂解，碰撞能量為 30eV ，二級分辨率為17500，采集信號前3離子進行碎裂，同時采用動態排除去除無必要的MS/MS信息。將發酵液樣本中檢測的特征峰分子質量、保留時間、二級譜圖與植物譜圖庫進行比較、匹配，實現代謝物的定性、定量鑒定。

1.2.6數據處理采用SPSS22.0軟件對試驗數據分析處理，并進行方差分析與數據檢驗，數據使用平均值 ± 標準誤（mean ?± SE）表示， plt;0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1嘭菊發酵液對根結線蟲2齡幼蟲活性的影響

嘭蝶菊發酵液對根結線蟲二齡幼蟲抑殺的生物活性結果見表1。

由表1可知， 24h 后，FB處理的殺線蟲活性為弱活性，其處理根結線蟲2齡幼蟲的校正死亡率為25.54% ，而FB10、FB100處理對線蟲抑殺作用非常弱（FB100處理的校正死亡率僅為 1.02% ），處理48，72h 后，FB10、FB100處理殺線蟲活性均有所增強，表現為弱活性。

FB處理在 48h 和 ^72h 后殺線蟲活性依然表現為弱活性，校正死亡率均在 24% 以上，且顯著高于同時間段的FB10、FB100處理，兩種稀釋液的殺線蟲效果無顯著差異。

表1菊發酵液的殺線蟲活性

Table1NematicidalactivityofWedeliachinensis fermentationsolution

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significantdifferenceatO.O5level.Thesamebelow.

2.2菊發酵液對斜紋夜蛾幼蟲生長發育的 影響

室內試驗測定結果表明，菊發酵液母液對斜紋夜蛾1齡幼蟲具有一定的觸殺作用，校正死亡率為 34.15% 。但由于母液濃度下，幼蟲無法存活到完成生長發育歷程，故在后續的試驗中摒除掉母液濃度，對其進行稀釋5倍（FB5）、15倍（FB15）、45倍（FB5），探究菊發酵液對斜紋夜蛾幼蟲生長發育的影響。

由表2可知，FB5和FB15處理斜紋夜蛾低齡表2菊發酵液對斜紋夜蛾幼蟲生長發育歷期的影響

Table2EffectsofWedeliachinensisfermentation solutions on the growth and developmental duration of the Spodopteralitura

注：幼蟲到化蛹歷經6個階段，分別為1、2、3、4、5、6齡，1-2J表示幼蟲在1齡過渡到2齡所需的天數，后面以此類推。

Note：The larva to pupation passes through six stages，namely， 1st，2nd，3rd，4th，5th，and 6th instars，and1-2Jdenotes the numberof daysrequired forthelarvato transitionfrom1stto 2nd instar，and so on thereafter.

幼蟲（1-2J階段）的發育期較CK顯著延長。在斜紋夜蛾高齡幼蟲階段（1-5J、1-6J），FB5和FB15處理的發育歷期延長，但與CK無顯著差異。

菊發酵液浸潤芋頭葉后喂食斜紋夜蛾幼蟲化蛹后，各處理的蛹質量見表3。

表3菊發酵液對斜紋夜蛾蛹質量的影響

Table3EffectsofWedeliachinensisfermentation solutionson the pupal massof the Spodoptera litura

FB5處理的蛹質量最低（為 391.71mg ，較CK降低了 8.62% ，其次是FB15處理，較CK降低了5.86% ，FB45處理對蛹質量的提高有促進的效果。故只有適宜濃度的菊發酵液才能抑制蛹質量，FB5處理抑制效果最佳，后期還需以該濃度為中心設計濃度梯度，探尋具有顯著效果的濃度。

2.3菊發酵液成分的分析

利用LC-MS測定菊發酵液母液總離子色譜（圖1）。經檢測菊發酵液共鑒定到1166種代謝物，相對含量 1% 以上的成分見表4。

由表4可知，菊發酵液的主要成分為酚類、生物堿、有機酸、萜類和苯及其取代衍生物等。其中相對含量較高的有機物為甜菜堿 8.78% ）、高龍膽酸（ 5.23% ）、2，3-二羥基苯甲酸 （3.04% ）、D-酒石酸（ 2.53% ）、乳酸內酯 A（1.79% 等。

圖1菊發酵液揮發性組分LC-MS分析的總離子色譜圖

Fig.1 Totalion chromatogram ofvolatile components ofWedeliachinensis fermentation solutionsanalyzed byLC-MS

表4菊發酵液主要代謝物及其作用

Table4MainmetabolitesofWedeliachinensisfermentationsolutior

注：“-”代表暫無文獻報道。 Note：The symbol‘-’denotesno literalure report available.

3 討論與結論

研究發現，多種植物提取物對根結線蟲都有很好的抑殺效果。萬壽菊的植物提取物在接觸線蟲24和 48h 后，對線蟲幼蟲都有殺線蟲作用，線蟲死亡率高達 60.5%^[10] 。任晶等[1研究發現，菊芋浸提液對南方根結線蟲的蟲卵孵化和2齡幼蟲的生長發育均有顯著的抑制作用，并且能夠顯著減少番茄的根結數量和土壤根結線蟲蟲口密度而不影響番茄生長。Kesba等[1]發現，不同稀釋度的一枝黃花和長春花水、乙醇提取物處理下2齡根結線蟲死亡率都很高，水提取物比乙醇提取物對2齡根結線蟲死亡率更有效。穿心蓮、金盞菊、沼菊、龍葵、馬錢子、印楝、紅甜椒、生姜、非洲刺槐豆等植物提取液均有一定的殺線蟲活性，能夠控制根結線蟲的種群密度[13]。

目前，對根結線蟲有控制作用的植物次生代謝成分的功效研究，也不斷有報道。研究表明甜瓜提取物中的葫蘆素A和葫蘆素B能夠殺死體外的根結線蟲幼蟲并降低其在野外的種群密度[1415]。薄荷提取物對根結線蟲表現出明顯的殺線蟲活性，采用色譜分析薄荷的提取物成分發現，精油中萜烯含量最高的是異薄荷酮、薄荷酮、薄荷醇、蕓香芹酮；水提取物主要含有綠原酸、丹參酸B、木犀草素-7-O-蕓香糖苷和迷迭香酸[。通過GC-MS分析具有控制線蟲潛力的芳香植物精油，發現主要化合物有乙酸肉桂酯、丁香酚甲酯、肉桂醇、乙酰丁香酚、異丁香酚、丁香酚和苯甲酸芐酯等，此外，當將苯丙素化合物與香芹酮結合時，表現出了協同殺線蟲活性[]。使用GC-MS技術鑒定出菖蒲提取液主要殺線蟲化合物有沒食子酸、丁香酸、羥基苯甲酸、綠原酸、阿魏酸、反肉桂酸和香豆酸[18]。

本試驗結果表明，菊發酵液母液的殺線活性為弱活性，稀釋液的殺線蟲效果顯著弱于母液，這表明植物提取物雖然有殺線蟲活性，但與濃度密切相關。高強等[研究發現，隨著刺角瓜提取物濃度的降低，根結線蟲的校正死亡率也會降低?？略频萚20]研究發現，當嘭菊水提取液濃度為 10% 時，殺線蟲活性為強活性，而本研究為弱活性，這可能是因為同一植物中的殺線蟲活性物質的提取效果會因提取溶劑、提取方法等不同而有所差異。通過LC-MS技術發現菊主要活性物質為甜菜堿（ 8.78% 。有研究發現，經海洋褐藻堿性提取物處理后，雌性根結線蟲的數量顯著減少，植物中的卵回收率也顯著降低，這是因為海藻提取物中甜菜堿起關鍵的作用[21]。

植物源提取物對斜紋夜蛾的控制作用報道并不罕見。Kaur等[22發現，辣木的氯仿、乙酸乙酯和己烷提取物均顯著提高了斜紋夜蛾的死亡率，其中正己烷提取物的活性最高，亞致死值為 199mg?L^-1 該植物提取物也可縮短斜紋夜蛾的整體發育周期。Kaur等[23研究土木香己烷提取物對斜紋夜蛾的生物活性，發現提取物具有拒食作用和毒性作用，在1500mg?L^-1 的質量濃度下，有中等的拒食效果，最大阻食率為 24.85% ，飼糧中添加 1500～2000mg?L^-1 的提取物，可顯著提高斜紋夜蛾幼蟲的死亡率，同時所有濃度的提取物均表現出很強的生長抑制作用，且呈劑量依賴性。Nebapure等[24對百合的不同溶劑提取物的拒食活性進行了分析，結果表明均對斜紋夜蛾有一定的拒食作用，氯仿提取物的拒食活性最好，其次是丁醇提取物，這兩種的拒食效果優于印楝素，己烷提取物效果最差。杜浩等[25研究發現，以飛機草浸提液處理的香蕉葉喂養斜紋夜蛾幼蟲，能夠延長斜紋夜蛾幼蟲和蛹的發育歷期，并使斜紋夜蛾蛹質量降低，飛機草浸提液的濃度越高其負面影響越大。

在控制斜紋夜蛾的生物活性成分的研究方面，Yooboon等[2研究表明，菖蒲、假華拔、黑胡椒的乙醇提取物對斜紋夜蛾的2齡幼蟲具有較強的毒性作用，可能是因為提取物中存在 β -細辛腦、（2E，4E，14Z）-N-異丁基-2，4，14-三烯酰胺、乙基異丁香酚、3.9-癸二烯醇-1，3-甲基-6-（1-甲基乙烯基）4-戊基-1-（4丙基環己基）1環己烯和 a -細辛腦等化合物。Ruttanaphan等[2通過HPLC分析毒性最強的野波羅蜜粗提物的化學成分，結果表明兒茶素對斜紋夜蛾的毒性最強，可能是斜紋夜蛾潛在的殺蟲劑。Sahayaraj等[2通過GS-MS檢測具有殺斜紋葉蛾幼蟲活性的苔蘚提取物，發現共有18種化合物，其中含量比較高的化合物有6-十八碳烯酸（Z） 29.7% ）、十六烷酸（ 11.31% ），這些化合物可能是導致斜紋夜蛾死亡的原因。

本研究表明嘭菊發酵液除了對斜紋夜蛾低齡幼蟲表現出一定的觸殺作用外，對斜紋夜蛾幼蟲的生長發育也有一定的影響，具體表現為隨著發酵液濃度升高，斜紋夜蛾的幼蟲發育歷期呈延長趨勢，蛹質量也降低。在本研究設置的濃度范圍內，低濃度菊發酵液FB45處理對斜紋夜蛾幼蟲的發育歷期的影響較小，反而對其蛹質量有促進作用，而高濃度的發酵液才能夠延長幼蟲發育歷期，并且抑制蛹質量的增加。本研究中嘭菊發酵液中相對成分 1% 以上的化合物有13種。研究表明甜菜堿可以降低根結線蟲的卵回收率[2]，龍膽酸具有抗菌功效[29]，二氫咖啡酸是綠原酸的主要代謝物，而綠原酸對黏蟲具有致死作用，亞致死濃度也會損害幼蟲的生長和發育[30]。菊發酵液對根結線蟲的殺線蟲活性以及對斜紋葉蛾幼蟲生長發育的抑制作用可能與上述的化合物有關，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，菊發酵液（ 67mg?mL^-1 對南方根結線蟲2齡幼蟲有一定抑殺活性（校正死亡率24% 以上），且稀釋10倍和100倍的菊發酵液在 48h 后和 72h 后也表現出弱殺線蟲活性（校正死亡率均達 10% 以上）。菊發酵液對斜紋夜蛾1齡幼蟲的校正死亡率為 34.15% ，嘭蝶菊發酵液的5倍和15倍稀釋液也具有抑制斜紋夜蛾幼蟲的生長發育、延緩其發育歷期、降低蛹質量的效果。菊發酵液中主要含有甜菜堿、高龍膽酸、二氫咖啡酸等揮發性物質，這些植物次生代謝產物都具有在農業種植業中進行開發利用的潛能。菊發酵液對根結線蟲和斜紋夜蛾均具有一定的生物活性，可為后期開發針對根結線蟲和斜紋夜蛾等有害生物防控的中草藥源植物保護劑提供參考。

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