產(chǎn)香真菌長枝木霉QF-1的篩選分離及其 用于煙用香料制備

中圖分類號(hào)：TS45；S572 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract：A novel aroma-producing fungal strain QF-1 was isolated from fresh tea leaves and demonstrated significant ability to generate tea-like freshness and floral aroma during the fermentation of tobacco extract concentrate. The strain was systematically identified through morphological characterization and molecular phylogenetic analysis.Fermentation conditions of waste tobacco leaf extract concentrate using QF-1 were optimized via sensory evaluation， and the resulting fermented flavoring agent was incorporated into cigarettes for gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） analysis of smoke components. The results showed that the fragrance producing strain was identified as Trichoderma longibrachiatum.Optimal fermentation parameters were determined as $3 0 ＼mathrm { ～ ＼textC ～ } ， 1 ＼%$ inoculum dose，and 3-day incubation period.Sensory evaluation revealed that cigarettes containing QF-1 fermented flavoring exhibited enhanced organoleptic properties characterized by pronounced sweet aroma，ful-bodied fragrance，and pleasantly sweet aftertaste. GC-MS analysis demonstrated substantial increases in both variety and quantity of aroma-active compounds in cigarette smoke，particularly alcohols，aldehydes，ketones，and phenolics，compared to untreated and control samples.

Key words：Trichoderma longibrachiatum ; fermentation; sensory evaluation; tobacco waste; aromacomponents

0 引言

外加香料是提升煙葉品質(zhì)、彰顯產(chǎn)品風(fēng)格的重要技術(shù)手段1.相較于化學(xué)合成香料，天然香料、尤其是源自煙草本身的香料與卷煙香氣協(xié)調(diào)性更好，更符合消費(fèi)者追求天然植物產(chǎn)品的消費(fèi)需求.由于煙葉原料緊缺，近年來開始以卷煙生產(chǎn)中產(chǎn)生的煙葉碎片、煙末等廢棄物作為原料制備煙用香料，不僅降低了煙草源香料的生產(chǎn)成本，也有利于實(shí)現(xiàn)煙草廢棄物的資源化利用[2-4].然而，受自身香氣物質(zhì)和化學(xué)成分所限，直接以煙草廢棄物為原料制備的香料通常存在香氣類型單一、刺激性大等問題[5]，其增香效果與企業(yè)需求尚存在較大差距.

微生物在生長和代謝過程中可產(chǎn)生多種香味物質(zhì)，應(yīng)用微生物發(fā)酵可再生原料生產(chǎn)香料具有綠色、環(huán)保、高效等多種優(yōu)點(diǎn)，已成為香料生產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).煙葉中含有豐富的糖類和蛋白質(zhì)，可為微生物生長提供充足的碳源和氮源，應(yīng)用產(chǎn)香菌株發(fā)酵煙草廢棄物可增加香味物質(zhì)種類、減少刺激性，是提高煙用香料品質(zhì)的重要途徑.朱大恒等8以煙末、煙秸桿、頂芽等為發(fā)酵底料，產(chǎn)香菌發(fā)酵5天后經(jīng)萃取、濃縮得到煙用香料，該香料與煙香諧調(diào)，可顯著改善卷煙的香氣質(zhì)量；郭林青等9從水果表面篩選得到產(chǎn)香酵母YG-4，該菌株發(fā)酵煙末提取液中醇類、雜環(huán)類等香味物質(zhì)含量較對照顯著提升，產(chǎn)生了區(qū)別于對照的明顯花香和甜香；葉建斌等[10]利用一株腸桿菌發(fā)酵煙草浸提液制備了具有典型的清甜香風(fēng)味的煙用香料，應(yīng)用于卷煙可提高煙氣中甜香風(fēng)味物質(zhì)含量.

當(dāng)前已報(bào)道的煙草增香微生物種類較少且主要為細(xì)菌和酵母[11]，為進(jìn)一步拓展煙草廢棄物發(fā)酵產(chǎn)香微生物資源，本研究從新鮮茶葉分離產(chǎn)香菌株并利用該菌株發(fā)酵廢棄煙末浸提濃縮液制備煙用香料，通過吸煙機(jī)捕集結(jié)合GC-MS技術(shù)分析其揮發(fā)性香氣成分系統(tǒng)評(píng)價(jià)其增香效果，旨在為微生物發(fā)酵煙草廢棄物制備煙用香料提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1材料與方法

1. 1 材料與試劑

廢棄煙末浸提濃縮液由吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司提供，其密度為 1.3g/mL ；新鮮茶葉采自福建南平茶園.

瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；LB培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白脈培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；二氯甲烷，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司； 2× TaqMasterMix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

篩選培養(yǎng)基：煙草浸提濃縮液 25g ，去離子水25g，115°C 高壓滅菌 20min

發(fā)酵培養(yǎng)基：煙草浸提濃縮液 50g ，去離子水50g，115C 高壓滅菌 20min

1.2儀器與設(shè)備

HZQ-211C落地恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DNP-9022電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LX-C35L立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；JXF-STPRP-48L小型勻漿機(jī)，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；MicroCL17高速離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；VeritiPCR儀，美國賽默飛世爾科技公司；PowerPac電泳儀，美國伯樂公司； RM20H 轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)，德國Borgwaldt-KC公司 6890GC/5973MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離純化

稱取 10g 新鮮茶葉剪碎后置于 250mL 錐形瓶中，加人 100mL0.9% （ wt%） 無菌生理鹽水，于 條件下振蕩 6～8h 后，加無菌水稀釋成 10^-1～10^-5 的濃度梯度，均勻涂布在YEPD和LB平板上，置于 30^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ^48h 觀察平板菌株的生長情況.挑取不同形態(tài)的單菌落，采用平板劃線法分離純化菌株，并編號(hào)保存.

1.3.2 菌株篩選

將初篩菌株用液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng) ^16h ，挑取菌絲或吸取菌液接種于篩選培養(yǎng)基，以不接菌篩選培養(yǎng)基為對照. 發(fā)酵 72h 后，通過嗅辨發(fā)酵液香味特征篩選出產(chǎn)香菌株.

1.3.3 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：活化產(chǎn)香菌株并接種于PDA培養(yǎng)基， 30^°C 插片培養(yǎng)至形成菌落，拍照記錄菌落形態(tài)并在顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài).

分子生物學(xué)鑒定：利用試劑盒提取微生物基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.引物為真菌鑒定通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG-3^°） 和ITS4（5’-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3'）．PCR擴(kuò)增體系 （20μL ）為：2× Taq Master Mix10μL ；上下游引物各 0.5μL ·模板 DNA2_μL;ddH₂O 補(bǔ)足至 20μL .PCR擴(kuò)增條件為： 94^°C 預(yù)變性 4min;94C 變性 30s，52C 退火 50s，72C 延伸 40s，35 個(gè)循環(huán)； 再延伸7min，4C 保存.擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）有限責(zé)任公司測序，測序結(jié)果在NCBI（Nation-al CenterofBiotechnology Information，美國國家生物信息技術(shù)中心）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對，利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定菌株.

1.3.4 發(fā)酵制備煙用香料

將產(chǎn)香菌株活化菌絲接種于試管斜面培養(yǎng)^72h ，在超凈工作臺(tái)中取適量無菌水加入斜面試管內(nèi)，刮取孢子充分混勻制備孢子懸浮液.通過血球板計(jì)數(shù)法得到孢子懸浮液濃度為 1×10⁷ CFU/mL.將孢子懸浮液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，開展發(fā)酵溫度（24C，27C，30C，33C，36C） 、接種量 （v/v） （2（ 0.2%0.0.5%0.08%.1%.1.5%.2%.2.2%） 及發(fā)酵時(shí)間 （1d，2d，3d，4d，5d） 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn).在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，以感官評(píng)吸得分為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件.正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示.

1.3.5 香味物質(zhì)檢測

將產(chǎn)香菌發(fā)酵液和對照發(fā)酵液離心、過濾，稀釋后分別向空白卷煙注射 10μL （每個(gè)處理20支），平衡后按照加拿大深度抽吸模式（HCI）上機(jī)抽吸.抽吸條件為：抽吸容量 55mL 持續(xù)時(shí)間 2s 用直徑 92mm 的劍橋?yàn)V片捕集氣溶膠并保留濾棒.抽吸結(jié)束后，分別將捕集煙氣的劍橋?yàn)V片、濾棒轉(zhuǎn)移至 150mL 的錐形瓶中，分別加入 50mL 二氯甲烷搖床震蕩 40min ，取所得萃取液加入濃縮瓶，加入 0.204mg/mL 乙酸苯乙酯（內(nèi)標(biāo)） 1mL 開始濃縮，濃縮至不足 1mL 時(shí)，用二氯甲烷定容至1mL ，過 0.22μm 濾膜于 2.0mL 的色譜瓶中進(jìn)行GC-MS檢測.

氣相檢測條件：色譜柱HP-5MS 60m× 0.25mm×0.25μm） ；進(jìn)樣口溫度 280° ；載氣為高純氦氣；柱溫箱為程序升溫，起始溫度 50° 保持1min ，以 4^°C/min 升至 148^°C 保持 1min ，以2C/min 升至 保持 1min ，以 升至280° 保持 5min ;分流比 10：1 ；流速 3.0mL/min 質(zhì)譜條件：離子源溫度 230°C ；四極桿溫度150° ；EI離子源 70eV ；質(zhì)量掃描范圍 35～ ；采用NIST20 檢索.

1.3.6 感官評(píng)吸

發(fā)酵液稀釋過濾后用微量進(jìn)樣器均勻注射到卷煙中.加香卷煙放置在溫度 、濕度 60± 2% 的恒溫恒濕箱中平衡 ^48h ，隨后由專業(yè)評(píng)吸小組（7名成員）對各樣品進(jìn)行感官評(píng)吸，設(shè)置評(píng)吸指標(biāo)包括香氣質(zhì)（10分）、香氣量（10分）、雜氣（10分）刺激性（10分）、余味（10分）、協(xié)調(diào)性（10分），總分60分，以評(píng)吸結(jié)果的平均值作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[12].

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離純化及鑒定

2.1.1產(chǎn)香菌株的篩選結(jié)果

經(jīng)過分離篩選得到12株菌株，將其分別發(fā)酵煙草浸提濃縮液，多數(shù)菌株發(fā)酵液香味與對照差異不明顯，僅QF-1菌株發(fā)酵液具有明顯花香和茶清香韻.

2.1.2 菌落形態(tài)特征

QF-1菌株在葡萄糖蛋白肺培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)第3天有白色菌絲以接種點(diǎn)為中心極速向外擴(kuò)散；培養(yǎng)第5天，菌落中心白色，周圍有黃色孢子出現(xiàn)，外圍白色菌絲向外擴(kuò)散至平板邊緣；培養(yǎng)第7天，菌落長滿整個(gè)平板，產(chǎn)生大量黃色孢子；培養(yǎng)第9天，菌落中心開始有白色絨絲狀物出現(xiàn)，菌落生長至鼎盛期，此后菌落開始衰敗，孢子顏色逐漸由明黃變成暗黃（如圖1所示）.400倍顯微觀察顯示（如圖2所示），QF-1菌株菌絲無色、有隔膜，分支角度不規(guī)則，菌絲交錯(cuò)呈網(wǎng)狀；分生孢子橢圓形，鏈狀排列于分生孢子梗頂端

2.1.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

QF-1菌株的ITS基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3所示（圖中M為Marker），在550bp處有單一、明亮且清晰的條帶產(chǎn)生，可通過基因測序進(jìn)行下一步鑒定.應(yīng)用QF-1菌株和近緣菌株ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示.QF-1菌株與長枝木霉聚為一支，結(jié)合菌落及菌絲、孢子形態(tài)，將QF-1鑒定為長枝木霉（Trichodermalongibrachiatum）.

長枝木霉屬木霉屬真菌，在植物病害生物防治[13-15]、生物肥料[16]、土壤修復(fù)[17]及廢棄物纖維素降解[18]等領(lǐng)域均有研究，但在制備香料方面的研究還未見報(bào)道.本研究首次發(fā)現(xiàn)長枝木霉QF-1菌株可發(fā)酵廢棄煙末浸提濃縮液產(chǎn)生香味物質(zhì)，為長枝木霉的應(yīng)用開辟了新的領(lǐng)域，

2.2長枝木霉QF-1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度

溫度是決定微生物生長速率和酶促反應(yīng)的關(guān)鍵因素，溫度過高或過低均顯著影響發(fā)酵效果.不同發(fā)酵溫度發(fā)酵液卷煙加香感官評(píng)吸結(jié)果如圖5所示，卷煙加香評(píng)吸得分在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)先升高后降低趨勢. 和 36^°C 發(fā)酵液香氣單薄，加香卷煙抽吸時(shí)香氣濃度不足、刺激性大，感官評(píng)分較低，可能是溫度過高或過低條件下菌株生長不良或胞外酶催化效率較低，香氣物質(zhì)合成不足所致. 發(fā)酵液較 香氣量提升顯著，清香突出，但刺激性仍偏大，可能與煙草浸提濃縮液中果膠和煙堿含量降解不完全有關(guān). 30^°C 發(fā)酵發(fā)酵液香氣質(zhì)和香氣量均較好，刺激性較小且余味甜潤干凈、舒適，感官評(píng)分最高，確定該溫度為最佳發(fā)酵溫度.

2.2.2 接種量

不同接種量發(fā)酵液卷煙加香感官評(píng)吸結(jié)果如圖6所示.接種量 1% 和 0.8% 時(shí)感官評(píng)分較高，低接種量 （0.2% 和 0.5% ）和高接種量 （1.5%.2.0% 和 2% ）發(fā)酵液加香效果均較差，接種量 0.8% 和1.0% 發(fā)酵液加香效果較好.在低接種量條件下，QF-1菌株可能優(yōu)先利用充足的碳源進(jìn)行增殖而非次生代謝19」，香氣物質(zhì)產(chǎn)生不足；同時(shí)，此條件下代謝路徑也偏向糖酵解途徑，積累丙酮酸等中間產(chǎn)物導(dǎo)致刺激性較高.接種量提高至 0.8% 時(shí)，菌株次生代謝加強(qiáng)，發(fā)酵液煙草本香膏香明顯，微有可可、堅(jiān)果香，香氣質(zhì)、香氣量明顯提升，但刺激性仍增大.接種量為 1% 時(shí)，發(fā)酵液蜜甜香明顯，兼有花香、果香，雜氣減輕，刺激性降低，余味干凈有回甜，煙氣柔順諧調(diào).隨著接種量的進(jìn)一步增加，菌體密度過高導(dǎo)致營養(yǎng)競爭加劇、溶解氧降低，QF-1提前進(jìn)入衰亡期，菌株代謝能力下降，同時(shí)釋放蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，導(dǎo)致評(píng)吸時(shí)雜氣和刺激性增加.因此，確定 1% 為QF-1最佳接種量.

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間

不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液加香感官評(píng)吸結(jié)果如圖7所示，卷煙加香評(píng)吸得分隨發(fā)酵時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高再降低趨勢.發(fā)酵1天的發(fā)酵液香氣較為淡薄，刺激性較大，分析可能是廢棄煙末提取液減壓濃縮后糖分和煙堿含量較高，QF-1菌株在接種初期需適應(yīng)高糖高煙堿的環(huán)境，生長代謝緩慢，產(chǎn)生香氣物質(zhì)較少所致.隨著發(fā)酵時(shí)間延長，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)部分降解，轉(zhuǎn)化為小分子致香成分，發(fā)酵液加香效果顯著提升.發(fā)酵2天發(fā)酵液有明顯的花香與膏香；發(fā)酵3天發(fā)酵液香氣最為濃郁，蜜甜香尤為突出，余味甘甜，煙氣諧調(diào)，透發(fā)性好.發(fā)酵時(shí)間超過3天的發(fā)酵液煙草本香減弱，刺激性增強(qiáng)，雜氣加重，這可能是過度發(fā)酵產(chǎn)生了對感官評(píng)吸有負(fù)面作用的揮發(fā)性成分所致.因此，確定3天為QF-1最佳發(fā)酵時(shí)間.

由表2可知，各因素對發(fā)酵液卷煙加香感官評(píng)吸效果影響的主次順序?yàn)椋航臃N量 （B）gt; 發(fā)酵溫度 （A）gt; 發(fā)酵時(shí)間（C）.當(dāng)發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間分別為A2、B2和C3時(shí)，評(píng)吸分?jǐn)?shù)最高，即發(fā)酵時(shí)間為3天，發(fā)酵溫度為 30°C ，接種量為 1% 時(shí)，增香效果最好.卷煙加香后蜜甜香突出，香氣飽滿，余味甘甜，抽吸品質(zhì)顯著改善.

三組試驗(yàn)卷煙（空白卷煙，未加香；QF-1卷煙， 注射QF-1發(fā)酵香料；對照卷煙，注射未加菌發(fā)酵 液）煙氣致香成分如圖8和表3所示.

QF-1卷煙煙氣中香氣物質(zhì)含量顯著高于空白和對照卷煙，較空白和對照卷煙分別提高 172.8% 和 42.8% .就香味物質(zhì)種類而言，QF-1卷煙煙氣中醇、醛、酮、酚等主要香味物質(zhì)含量均顯著高于空白和對照卷煙.醇類物質(zhì)中2-呋喃甲醇與對照相比增加 138.5% ，其具有輕微的甜味和芳香氣味；反式香葉醇和橙花醇則有清新、甜美的花香[20].醛類物質(zhì)對照相比共增加 100.4% ，其中5-甲基-2-呋喃甲醛具有香仁、堅(jiān)果、烤香、煙熏香等甜香味，可能對QF-1發(fā)酵液的突出甜香有所貢獻(xiàn).酮類物質(zhì)大多具有花香、果香，可以改善卷煙吃味，并能與煙香協(xié)調(diào)，QF-1卷煙DDMP和環(huán)戊烯酮類物質(zhì)含量均有提高，且新增3-乙基-2-環(huán)戊烯-1-酮等3種酮類物質(zhì)，這些物質(zhì)可能是烤甜香的重要來源[21].酚類物質(zhì)中QF-1卷煙新增了4-甲基愈創(chuàng)木酚，有研究表明4-甲基愈創(chuàng)木酚是化學(xué)合成制備煙用香原料香蘭素的重要原料之一[22]，也是濃香型白酒的重要風(fēng)味化合物[23].

目前，應(yīng)用微生物發(fā)酵煙葉或其提取物產(chǎn)香的研究較多[24]，但尚未對其產(chǎn)香機(jī)制進(jìn)行深入研究.煙草浸提濃縮液中多糖含量豐富，而長枝木霉可分泌纖維素酶、木聚糖酶等多種水解酶[25]，這些水解酶可降解多糖產(chǎn)生呋喃酮等中間產(chǎn)物，可能在2-呋喃甲醇、5-羥甲基糠醛及5-甲基-2-呋喃甲醛香味物質(zhì)的合成中起重要作用.未來可應(yīng)用代謝組、轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)全面比較QF-1發(fā)酵液與對照發(fā)酵液化學(xué)成分及不同發(fā)酵條件菌株差異表達(dá)基因[26]，進(jìn)一步解析QF-1發(fā)酵產(chǎn)香的代謝機(jī)制.

感官評(píng)吸是評(píng)價(jià)煙用香料加香效果的核心指標(biāo).煙用香料在卷煙抽吸中經(jīng)揮發(fā)、熱裂解轉(zhuǎn)移至煙氣，其揮發(fā)物組分較添加前變化顯著，因此對卷煙煙氣中香味物質(zhì)的檢測可能更利于煙用香料增香作用的解析.葉建斌等[27采用熱裂解-氣相色譜質(zhì)譜對涂布發(fā)酵浸提液的再造煙葉樣品進(jìn)行了熱裂解分析，發(fā)現(xiàn)裂解過程中增加了 γ 丁內(nèi)酯、2，3-二氫-5-甲基呋喃、糠醛等特征煙氣致香組分.

本研究將長枝木霉QF-1菌株發(fā)酵煙草浸提濃縮液制備的香料添加到卷煙中，通過吸煙機(jī)抽吸和GC/MS對不同樣品的總粒相物致香成分進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)QF-1卷煙煙氣中的反式香葉醇、DDMP、環(huán)戊烯酮類等花香、烤甜香香氣成分含量顯著高于對照和空白卷煙，這與結(jié)果與感官評(píng)吸結(jié)果一致，表明這些物質(zhì)可能是QF-1發(fā)酵香料提升卷煙感官質(zhì)量的關(guān)鍵組分.

3結(jié)論

本研究從新鮮茶葉中分離、篩選得到一株可產(chǎn)生明顯茶清香和花香的產(chǎn)香菌株QF-1，經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定為長枝木霉.經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化，產(chǎn)香菌株QF-1發(fā)酵廢棄煙末浸提濃縮液的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度 30°C ，接種量 1% ，發(fā)酵時(shí)間3天.添加最佳發(fā)酵條件下制備的煙用香料后，卷煙蜜甜香突出、香氣飽滿、余味甘甜，抽吸品質(zhì)顯著改善.與空白卷煙和加煙草浸提濃縮液對照相比，添加QF-1發(fā)酵香料卷煙煙氣中的醇類、酮類、醛類及酚類物質(zhì)種類和含量均明顯增加.本研究首次將長枝木霉應(yīng)用于煙草廢棄物發(fā)酵產(chǎn)香，后續(xù)可進(jìn)一步對發(fā)酵香料提取和制備工藝進(jìn)行深人研究，為其在煙草源煙用香料制備和應(yīng)用中提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

參考文獻(xiàn)

[1]謝劍平.煙草香料技術(shù)原理與應(yīng)用[M.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

[2]陳興，張?zhí)鞐潱噰e，等.紅大煙花香料揮發(fā)性成分分析及其在卷煙中的應(yīng)用［J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，33（4）：663-668.

[3]鄭雪聰，李源源，鄭路，等.國外煙草多用途領(lǐng)域的專利布局現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)化態(tài)勢[J].煙草科技，2023，56（4）：62-72.

[4]張博，王新惠，孔波，等.基于煙草廢棄物的水熱反應(yīng)香料制備及卷煙加香應(yīng)用研究[J].輕工學(xué)報(bào)，2024，39（3）：72-79.

[5]葉建斌，齊曉娜，張婷婷，等.紅茶菌發(fā)酵制備特色酸香型煙草浸膏[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2021，40（10）：104-111.

[6]莊以彬，吳鳳禮，殷華，等.芳香族香料化合物生物合成研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2021，37（6）：1998-2009.

[7] Wang F，Jiang X L，Zhang G，et al. Tobacco as a promisingcropfor low-carbon biorefinery[J].TheInnovation，2024，5（5）：100 687.

[8]朱大恒，韓錦峰，周御風(fēng)，等.利用產(chǎn)香微生物發(fā)酵生產(chǎn)煙用香料技術(shù)及其應(yīng)用[J].煙草科技，1997（1）：28-29.

[9]郭林青，樸永革，朱春陽，等.煙草產(chǎn)香酵母YG-4的篩選鑒定及香氣成分分析[J].輕工學(xué)報(bào)，2019，34（5）：27-31.

[10]葉建斌，齊曉娜，楊宗燦，等.腸桿菌發(fā)酵對煙草浸膏化學(xué)成分及卷煙品質(zhì)的影響[J].食品與機(jī)械，2021，37（5）：33-38.

[11]孫福艷，楊雪鵬，楊成，等.煙草增香生物技術(shù)研究進(jìn)展[J].云南化工，2023，50（2）：9-14.

[12］毛多斌.卷煙配方和香精香料[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

[13]李瑞，李惠霞，謝丙炎，等.長枝木霉菌株TL16防治南方根結(jié)線蟲的作用機(jī)理[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2020，47（2）：384-393.

[14]邵學(xué)輝，張樹武，徐秉良.長枝木霉代謝物對極細(xì)鏈格孢產(chǎn)毒抑制機(jī)制解析[J].果樹學(xué)報(bào)，2024，41（1）：133-142.

[15]LuoN，JiaoYM，LingJ，etal.Synergisticeffectoftwopeptaibols from biocontrol fungus Trichoderma longi-brachiatum strain 40418 on CO-Induced plant resistance[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2024，72（38）：20 763-20 774.

[16]蔣仙，祝靜，于存.2種木霉菌肥對馬尾松幼苗生長及抗立枯病的影響[J].西部林業(yè)科學(xué)，2021，50（6）：103-109.

[17］鄭爽.施用長枝木霉菌與廢棄資源對礦山廢棄地基質(zhì)的改良研究[D].阜新：遼寧工程技術(shù)大學(xué)，2022.

[18」李子婧，劉帆，湯勝，等.纖維素降解菌長枝木霉菌（Trichodermalongibrachiatum）ZJ-1O的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2022，48（5）：614-624.

[19]AdnanM，ZhengWH，IslamW，etal.Carbon cataboliterepression in filamentous fungi[J]. International JournalofMolecularSciences，2017，19（1）：48.

[20]楊雪，王靜，胡月朦，等.基于HS-SPME/GC-MS/O分析滇綠茶特征香氣物質(zhì)[J].分析測試學(xué)報(bào)，2024，43（4）：555-565.

[21]張啟東，劉俊輝，柴國璧，等.主流煙氣粒相物水溶性組分中烤甜香成分分析[J].煙草科技，2014（6）：54-59.

[22]Wang S，LiC，ShangRJ，etal.Co-Pd alloy nanoparticlessupported onactivated carbon for high-efficiency produc-tion ofvanillin from 4-methylguaiacol[J].Applied Catal-ysisA：General，2023，668：119468.

[23]閆如毓，郝慧宜，苗子健，等.濃香型白酒發(fā)酵過程中4-甲/乙基愈創(chuàng)木酚的代謝規(guī)律分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2023，49（11）：41-46.

[24韓晗，趙思宸，件潔，等.用于發(fā)酵廢次煙葉的酵母菌篩選及增香效果研究[J].中國煙草科學(xué)，2024，45（6）：91-98.

[25］董妙音.重離子束誘變選育高產(chǎn)長枝木霉菌株及其產(chǎn)纖維素酶機(jī)理和應(yīng)用研究[D].北京：中國科學(xué)院大學(xué)，2021.

[26]張樹武.基于代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的長枝木霉T6菌株殺線機(jī)理研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[27］葉建斌，王璐，楊峰，等.類芽孢桿菌發(fā)酵原料浸提液提升再造煙葉品質(zhì)[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2019，25（1）：33-38.