IRGM在結直腸癌中的表達及其與患者臨床病理特征和預后的關系

[中圖分類號]R375.34 [文獻標志碼］A

Expression of immune-related guanosine triphosphatase M in colorectal cancer and its association with clinicopathological features and prognosisLI Na，RAN Wenwen ， ZHAO Han， XING Xiaoming（Department of Pathology，School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266O71，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate theexpressioncharacteristicsof immune-related guanosine triphosphatase M（IRGM）incolorectalcancer（CRC）tisueanditsasociationwithclinicopathologicalfeaturesand prognosis.MethodsFreshtumor tissuesamplesandthecoresponding paracancerous normal tissuesamples werecollctedfrom16patientswhounderwentradical resectionfor CRCin The Afiliated Hospitalof Qingdao University，andRT-qPCR was used to measure themRNA expressionlevel of IRGM.Postoperativeparafi-embedded tumor tisue samples and thecorresponding paracancerous normal tisue samples were colectedfrom143CRCpatientswhoweretreatedinTheAfliatedHospitalofQingdaoUniversity，andimmunohistochemicalstaining wasused tomeasuretheproteinexpressonlevelofIRGM;theassociationoftheprotein expresionlevelofIRGMwithclinicopathological featuresandprognosis wasanalyzed.ResultsThemRNAexpresionlevelof IRGM in paracancerous normal tissue was significantly higher than that in CRC tumor tissue （ ）. The protein expression level of IRGM in paracancerous normal tissue was also significantly higher than that in CRC tumor tissue ?χ²=23.738，Plt;0.05? . The low expression of IRGM in CRC tumor tissue was significantly associated with lymph node metastasis and vascular tumor thrombus （ χ²=9.827，7.690 ， （20 Plt;0.05 ）.The survival analysis showed thatthe expression level of IRGMhad no significantcorrelation with overallsurvival rate or disease-free survival rate in CRC patients （ ΔPgt;0.05 ）.ConclusionThe expression level of IRGM is significantly downregulatedin CRCtissue；thelowexpressonof IRGMis closelyasociated with lymphnode metastasisandvasculartumorthrombus， whileitisnotsignificantlyassociatedwithteoverallsurvivalrateanddiseasefreesurvivalrateofptients，sugestingthat IGM may become a potential target for the treatment of CRC.

[KEYWORDs]Colorectal neoplasms; GTP-binding proteins;Lymphatic metastasis；Neoplasm invasiveness; Immunohisto chemistry;Prognosis;Pathological conditions， signs and symptoms

結直腸癌（colorectalcancer，CRC）作為全球高發的惡性腫瘤，其早期診斷和治療策略雖不斷進步，但轉移性病變的出現仍是導致患者治療失敗和死亡的主要原因[1-2]。目前，根治性切除聯合化療、放療或靶向治療是CRC的主要治療方法，然而對于轉移性CRC 患者而言，治療效果并不理想[3-4]。因此，尋找更有效的CRC治療靶點，開發新的治療策略對提高CRC患者生存預后至關重要。

IRGM基因位于人類5號染色體上，包含1個較長的第一外顯子（編碼181個氨基酸）及4個較短的推定外顯子[5]。作為GTPase蛋白家族的成員，IRGM通過N端結構域介導GTP結合與水解，C端結構域調控蛋白互作與亞細胞定位，共同協調下游信號傳導[6-8]。該蛋白具有雙重生物學功能：一方面通過單核巨噬細胞溶酶體途徑促進胞內病原體清除并參與固有免疫[9-10]；另一方面通過調控線粒體動力學、介導ULK1-Beclin1復合體組裝等途徑增強細胞自噬[11-12]。目前有研究發現，IRGM可以通過抑制NLRP3炎性小體的活化從而緩解炎癥性腸病[13-16]。IRGM在食管鱗癌細胞中高表達，并通過增強自噬在體外促進人食管鱗癌細胞增殖、遷移、侵襲[17]。然而，IRGM在CRC中的表達特征及其臨床意義尚未完全闡明。本研究旨在檢測CRC患者腫瘤組織中IRGM的表達水平，為CRC的精準診斷與潛在生物標志物的發現提供理論依據。

1資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月—2018年12月在青島大學附屬醫院行CRC根治性切除術、術前未接受新輔助治療且無其他部位惡性腫瘤的143例患者的CRC腫瘤及癌旁正常組織石蠟標本，同時收集患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小、腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、神經侵犯及脈管癌栓等方面的臨床病理特征資料，其中患者年齡、腫瘤大小按中位數分組；以電話方式進行隨訪，記錄所有患者的總體生存期（從手術開始至全因死亡的時間）和無病生存期（從手術開始至首次發生腫瘤復發/轉移或全因死亡的時間），以計算總體生存率及無病生存率。隨訪截至2023年12月1日。收集2023年5月—2023年7月于青島大學附屬醫院行CRC根治性切除術的16例患者的CRC腫瘤組織和癌旁正常組織的新鮮組織樣本。

1.2免疫組化（IHC）染色檢測CRC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中IRGM蛋白表達情況

取143例CRC患者的腫瘤組織和癌旁正常組織石蠟標本，制備成孔徑 2.0mm 、厚度 4μm 的組織芯片。再經脫蠟水化后，EDTA高壓加熱修復2min ，加人過氧化氫溶液反應 10min ，血清封閉10min 。IRGM一抗 [1：500 ，艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司，貨號 PS08476]4^°C 孵育過夜，二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號PV-6000）37°C 孵育 30min ，DAB顯色 1min ，于顯微鏡下觀察細胞的染色情況。IRGM表達評定基于顯微鏡下觀察的細胞漿/膜染色程度：棕黃色或棕褐色為高表達，無著色或淡黃色為低表達。

1.3實時熒光定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）技術檢測CRC患者腫瘤組織和癌旁正常組織當中IRGMmRNA表達水平

使用RNA提取試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司，貨號TCH022）從16例CRC患者的腫瘤組織及其配對的癌旁正常組織中提取mRNA。采用反轉錄試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司，貨號RR037Q）將mRNA逆轉錄為cDNA。最后，使用SYBRGreen試劑（北京寶日醫生物技術有限公司，貨號6210）在熒光定量PCR儀[賽默飛世爾（上海）分析儀器有限公司，貨號202232702]上進行檢測。反應程序： 60s;共40個循環。以GAPDH為內參基因，采用2^-ΔΔCT 方法計算目的基因的相對表達量。PCR 引物購買于上海吉凱基因有限公司，正向引物序列為：5^′ -CAATGGGATGTCCACCTTCAT- ?3^′ ，反向引物序列為： 5^′ -CCAGGCAGGTCCCACAAC- 3^′ 。

1.4 統計學處理

采用SPSS26.O軟件進行統計學分析。計量資料以 表示，組間比較采用配對 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗，計數資料以例（率）表示，組間比較采用McNemar檢驗；采用Pearson X² 檢驗分析CRC腫瘤組織IRGM蛋白表達水平與患者臨床病理特征的關系，使用Kap-lan-Meier法以及Log-rank檢驗進行生存分析；以Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1CRC患者腫瘤組織與癌旁正常組織中IRGMmRNA表達水平比較

RT-qPCR檢測結果顯示，腫瘤組織和癌旁正常組織中 表達水平分別為 1.92±0.41 、4.80±0.85 ，兩者比較差異有顯著性 Ω^′=2.836，Plt; 0.05）。

2.2CRC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中IRGM的IHC染色結果

IHC染色結果顯示，CRC患者的腫瘤組織以及癌旁正常組織中IRGM蛋白均定位于細胞漿和細胞膜中。143例CRC患者的腫瘤組織中，IRGM高表達者58例 （40.6%） ，低表達者85例 （59.4%） ；癌旁正常組織中，高表達者99例 （69.2%） ，低表達者44例 （30.8% ），CRC患者腫瘤組織中IRGM高、低表達者相比較，差異具有顯著的統計學意義（ χ²= 23.738，Plt;0.05） 。見圖1。

2.3腫瘤組織中IRGM蛋白表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系

CRC患者腫瘤組織當中IRGM低表達者發生淋巴結轉移和脈管癌栓的比例顯著高于高表達者（χ²=9.827，7.690 ！ Plt;0.05 ），IRGM高、低表達者在性別、年齡及腫瘤分化程度、神經侵犯情況、TNM分期及大小方面比較，差異均無顯著性 （Pgt;0.05） 。見表1。

A：癌旁正常組織中IRGM蛋白高表達；B：CRC腫瘤組織中IR-GM蛋白低表達；IHC染色，放大100倍

2.4腫瘤組織中IRGM表達水平與CRC患者預后的關系

143例CRC患者隨訪 1～60 月，隨訪中位時間35（21，52）月。在隨訪過程中，20例患者出現復發或轉移，其中共計36例患者死亡。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，CRC患者腫瘤組織中IRGM表達水平與患者總體生存率及無病生存率均無顯著相關性 （Pgt;0.05） 。見圖2。

3討論

CRC的高度侵襲性和易轉移的特性是導致患者預后不良的主要原因[18]。盡管近年來分子靶向治療和免疫治療均取得了一定進展，但治療耐藥和腫瘤復發仍是臨床面臨的關鍵挑戰[4]。因此，深入探索CRC發生發展的新機制，鑒定參與腫瘤侵襲轉移中的關鍵分子，并評估其作為預后標志物或治療靶點的潛力，對實現CRC的精準治療至關重要。

IRGM屬于干擾素誘導的GTPase超家族成員，具有促進自噬和抑制先天免疫反應的作用[19]，是近年來腫瘤研究的熱點領域。有體外研究顯示，IRGM在人肝癌細胞、人黑色素瘤細胞、人神經膠質瘤細胞中高表達，敲低人肝癌細胞中的IRGM后，細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著增加，在人黑色素瘤細胞和人神經膠質瘤細胞中過表達IR-GM后，促進了細胞的遷移和侵襲能力[20-23]。本研究的RT-qPCR技術檢測顯示結果，與癌旁正常組織相比，CRC患者腫瘤組織中IRGMmRNA相對表達水平顯著降低。免疫組化檢測結果顯示，CRC腫瘤組織中IRGM低表達比例顯著高于癌旁正常組織。進一步對腫瘤組織中IRGM蛋白表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系進行分析顯示，IRGM低表達患者中淋巴結轉移和脈管癌栓的發生比例顯著高于IRGM高表達組。淋巴結轉移和脈管癌栓形成是反映CRC侵襲轉移的關鍵指標。因此，腫瘤組織中IRGM的表達下調，可能與其促進CRC局部（淋巴結轉移）和遠處（脈管侵犯）播散相關。其他的研究結果也顯示，IRGM基因缺失導致TRAF6先天免疫信號通路過度激活，在造血干細胞和祖細胞中引發持續且過度的促炎信號傳導，最終促成del5q骨髓增生異常綜合征的發生[24]，但是關于具體機制，還需要進一步探索。

既往研究提示IRGM可作為黑色素瘤和肝細胞癌的獨立預后標志物，研究者通過建立Cox比例風險模型分析結果顯示，IRGM蛋白高表達會顯著增加患者死亡風險，致總生存期縮短，患者預后不佳[25-26]。本研究發現，CRC患者的總體生存率和無病生存率與腫瘤組織IRGM蛋白表達水平之間無顯著統計學關聯。分析原因可能是由于本研究隊列的樣本量較小及中位隨訪時間較短，從而影響了統計分析的結果，難以揭示遠期預后差異。

綜上所述，本研究顯示IRGM在CRC組織中表達下調，其低表達與淋巴結轉移及脈管癌栓形成相關，但與總體生存率及無病生存率未發現顯著相關性。該結果為揭示CRC的病理機制提供了新視角，提示IRGM可能是CRC治療的潛在靶點。然而，其確切的預后價值及作為獨立預后標志物的可行性，仍需通過更大規模的前瞻性隊列研究及深入的分子機制探索予以驗證。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL29212）。所有試驗過程均遵照《青島大學附屬醫院標準》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：李娜、再雯雯、趙涵、邢曉明參與了研究設計；李娜、邢曉明參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）