神經炎癥、血管風險和阿爾茨海默病生物標志物之間的相關性分析

[中圖分類號] R745.7 [文獻標志碼］ A

Association between neuroinflammation， vascular risk， and biomarkers in Alzheimer’s disease CHEN Yanming，HU Heying，CUI Ruiping，HU Hao，TAN Chenchen，TAN Lan （Qingdao Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the asociation between neuroinflammation，vascular risk，and biomarkers in Alzheimer’sdisease（AD）.MethodsAtotalof1O79individualswithoutADwereselectedassubjectsfromtheChinaAlzheimer's Biomarkerand Lifestyle studycohort，andFramingham General CardiovascularRisk Score（FGCRS）was used toassessthe vascularriskofthe subjects.Themultiplelinearregressionmodelwasusedtoinvestigate thecorelationofFGCRS withADbio markers in cerebrospinal fluid（CSF） （ β- amyloid 42 [Aβ₄₂] ， β? amyloid 40[Aβ₄₀] ，phosphorylated tau[P-tau]，total tau[T-tau]， Aβ₄₂/Aβ₄₀ ratio，T-tau/ Aβ₄₂ ratio，and P-tau/Aβ₄₂ ratio]，neuroinflammatory factors in CSF（soluble triggering receptor expressednmyeloidcels 2[sTREM2]and progranulin[PGRN]），andperipheralblood inflammatorycells（whitebloodcelcount [WBC]，neutrophil count[NEU]，lymphocyte count[LY]，monocyte count[MONO]，and neutrophil-to-lymphocyteratio [NLR]）.Mediation models wereconstructed with sTREM2 and PGRNas mediators toinvestigate the mediating efect of neuroinflammatory factors between vascular risk and ADbiomarkers.ResultsFGCRS was positivelycorelated withthe levels of Aβ₄₂ ， Aβ₄₀ ，P-tau，and T-tau in CSF ， and it was also positively correlated with the levels of sTREM2 and PGRN in CSF and the levels of WBC，NEU，NLR，and MONO in peripheral blood （β=0.120-0.228，t=3.285- （20 5.705，Plt;0.05 .PGRN and sTREM2 mediated the association between FGCRS and AD biomarkers in CSF （ A{β₄₀ ，P-tau，T-tau， and Aβ₄₂ ），with a mediation ratio of 26.75%-81.82% for sTREM2 and 9.66%-31.03% for PGRN. ConclusionThe increase in vascular riskmayinfluence thelevelsofADbiomarkers inCSFbyincreasing thelevelsof neuroinflammatoryfactors in CSF， thereby promoting the development and progression of AD.

[KEY WORDs]Alzheimer disease；Inflammation；Risk factors；Vascular risk；Amyloid;Progranulins；Bloodcellcount; Cerebrospinal fluid; Soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 2； Biomarkers

阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）是一種神經退行性疾病，其突出的病理改變是 β -淀粉樣蛋白（Aβ）在神經細胞外沉積形成神經炎性斑塊和過度磷酸化的tau蛋白在神經細胞內聚集形成的神經原纖維纏結[1]。血管風險因素例如高血壓、吸煙、糖尿病等是目前比較被認同的AD的可干預致病因素[2]，但血管風險（高血壓、糖尿病等）與AD的病理改變是否存在相關性，目前尚無統一定論[3-5]。此外，血管風險也可以引起低水平的、持續的炎癥反應[6-7]，而外周血炎癥細胞和腦脊髓液神經炎癥因子可通過直接或間接途徑加劇AD的病理改變[8-9]。本研究納入的研究對象及其相關指標數據均來源于中國阿爾茨海默病生物標志物和生活方式（CA-BLE）研究隊列[10]，該隊列是一項針對中國北方漢族非AD人群的獨立隊列研究。本研究根據弗雷明漢一般心血管風險評分（FGCRS）原則對研究對象的血管風險進行綜合評分，探究FGCRS和腦脊髓液AD生物標志物、腦脊髓液神經炎癥因子和外周血炎癥細胞計數等之間的相關性，以及血管風險影響AD病理改變的可能機制，為AD的臨床靶向治療和干預措施的制定提供新思路。

1資料與方法

1.1 研究資料

從CABLE研究隊列中選取研究對象，納入標準： ① 漢族者； ② 年齡 40～90 歲者。排除標準： ① 患有中樞神經系統感染、癲癇、多發性硬化癥、帕金森病等神經系統疾病者； ② 嚴重精神系統疾病（如抑郁癥）者； ③ 有家族性遺傳病史者； ④ 臨床資料和實驗室數據不全及確診為認知障礙者。從CABLE隊列中納入1079例研究對象，基于FGCRS評分原則，采用性別特異性多變量因素算法得出研究對象的FGCRS，以心血管疾病事件10年風險發生率的20% 為界限[1]，將所有研究對象分為高風險組 （? 20%）495 例和低風險組 （lt;20%）584 例。

從CABLE研究隊列中收集研究對象的年齡、性別、教育年限、吸煙狀況、飲酒狀況、高血壓史、血壓、降壓藥物使用情況、糖尿病史、降糖藥物使用情況、簡易精神狀態檢查表（MMSE）評分以及外周血中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平、總膽固醇（Total-C）水平、外周血載脂蛋白 基因攜帶狀態等臨床資料；收集所有研究對象的空腹外周血炎癥細胞[白細胞計數（WBC）、中性粒細胞計數（NEU）、淋巴細胞計數（LY）、單核細胞計數（MONO）、中性粒細胞與淋巴細胞計數比值（NLR）」、腦脊髓液中AD生物標志物 淀粉樣蛋白 42（Aβ₄₂ ）、 Aβ₄₀ 、磷酸化tau蛋白（P-tau）、總tau蛋白（T-tau）、 Aβ₄₂/Aβ₄₀ 、T-tau/ Aβ₄₂ 、P-tau/ Abeta₄₂^- 一以及腦脊髓液神經炎癥因子［可溶性髓系細胞觸發受體2（sTREM2）、顆粒蛋白前體（PGRN）]等資料。

1.2 統計學處理

采用R4.2.1軟件對數據進行統計和圖形繪制。連續變量以 表示，組間比較采用 Ψ_t 檢驗；分類變量以例（率）表示，組間比較采用Pearson χ² 檢驗。以FGCRS為自變量，腦脊髓液 Aβ₄₂、Aβ₄₀ 、P-tau、T-tau、 Aβ₄₂/Aβ₄₀ 、T-tau/ Aβ₄₂ ！ P-tau/Aβ₄₂ 、sTREM2、PGRN以及外周血中WBC、NEU、LY、MONO、NLR為因變量，構建線性多元回歸模型分析FGCRS與腦脊髓液AD生物標志物、外周血炎癥細胞及腦脊髓液神經炎癥因子之間的相關性，以教育年限和ApoEε4攜帶狀態作為協變量對回歸模型進行調整，并且將FGCRS分別與性別亞組（男性亞組、女性亞組）和年齡亞組（老年亞組 ?65 歲、40歲 ? 中年亞組 lt;65 歲）進行交互作用分析。對每項血管風險因素（收縮壓、糖尿病、Total-C、HDL-C、吸煙）與腦脊髓液AD生物標志物的相關性進行多元線性回歸分析，并繪制熱圖。線性回歸模型中因變量的取值采用R軟件中的car包進行歸一化處理。以sTREM2、PGRN作為中介變量，以FGCRS為自變量，以AD生物標志物為因變量構建中介模型，采用R軟件中的 lm 、medium、BruceR、car包，通過10000次自舉迭代檢驗顯著性。中介模型中的3條路徑均需滿足線性相關，并且以教育年限和APoEε4 攜帶狀態作為協變量進行調整。以 Plt; 0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1低風險組和高風險組研究對象的基本臨床特征比較

低風險組和高風險組研究對象的腦脊髓液神經炎癥因子、外周血炎癥細胞、腦脊髓液AD生物標志物比較差異均無顯著性 （Pgt;0.05） 。見表1。2.2FGCRS與腦脊髓液AD生物標志物、腦脊髓液神經炎癥因子、外周血炎癥細胞的相關性多元線性回歸分析結果顯示，FGCRS與腦脊髓液中的 Aβ₄₂ 、 Aβ₄₀ 、P-tau、T-tau 蛋白水平呈正相關中 ?Plt;0.05） ，與腦脊髓液中的神經炎癥因子 P-tau/ Aβ₄₂ 、 Aβ₄₂/Aβ₄₀ 無顯著相關性 （Pgt;0.05） 。FGCRS與腦脊髓液sTREM2、PGRN水平呈正相關（ Plt; 0.05），與外周血WBC、NEU、NLR、MONO呈正相關 ?Plt;0.05） 。見表2。

進一步分析各種血管風險因素與AD生物標志物的相關性，結果顯示，腦脊髓液中 Aβ₄₀?T-tau，P- tau、T-tau/ Aβ₄₂ 與收縮壓水平呈正相關 （β=0.089～ 0.169，Plt;0.05） ， Aβ₄₂/Aβ₄₀ 與收縮壓水平呈負相關（β=-0.083，Plt;0.05） 。腦脊髓液中T-tau、P-tau與外周血Total-C呈負相關 （β=-0.074，-0.098 Plt;0.05） ，與糖尿病呈正相關 （β=0.190，0.249 Plt;0.05） ，腦脊髓液中 Aβ₄₂、Aβ₄₀ 水平則未被發現與外周血Total-C或糖尿病呈現顯著相關性（ Pgt; 0.05）。見圖1。分別將FGCRS與性別和年齡亞組進行交互作用分析，結果顯示，在中年亞組當中，FGCRS與腦脊髓液 Aβ₄₀.Aβ₄₂/Aβ₄₀. sTREM2 水平具有顯著相關性 （β=-0.127～0.246，Plt;0.05） ，在老年亞組中無顯著相關性 （Pgt;0.05） ；FGCRS與性別亞組的交互作用沒有發現有顯著相關性（ Pgt; 0.05）。

2.3腦脊髓液 sTREM2、PGRN在 FGCRS 和 AD生物標志物之間的介導作用

中介模型分析結果顯示，FGCRS與腦脊髓液中AD生物標志物 Aβ₄₀ 、P-tau、T-tau 和 Aβ₄₂ 之間的關聯由sTREM2和PGRN部分介導，其中sTREM2的介導比例為 26.75%～81.82% ，PGRN的介導比例為 9.66%～31.03% 。詳見圖 2A～H 。外周血炎癥細胞WBC、NEU、LY、NLR、MONO在FGCRS和腦脊髓液AD生物標志物之間的關聯中未發現有介導作用 （Pgt;0.05） 。

3討論

血管風險是AD發生的較重要危險因素之_[12-13]，其具體影響機制尚不明確，關于血管風險對AD的病理改變的影響，現有研究結論存有較大分歧。例如，一項隊列研究顯示，隨著血管風險因素種類的增加，腦內神經細胞外 Aβ 沉積明顯增加，但該結論具有人種特異性[14]。另有前瞻性縱向隊列研究結果顯示，沒有明確的證據表明較高的血管風險評分會影響大腦內 Aβ 沉積過程[3]。因此本研究主要目的是探究漢族人群中血管風險和AD生物標記物間是否存在相關性。2024年美國國家老齡化和阿爾茨海默病協會將腦脊髓液中 Aβ₄₂ 和P-tau作為AD體液核心生物標志物[15]。本研究基于FGCRS評分原則，對研究對象的血管風險進行綜合評價，選擇腦脊髓液中 Aβ₄₂ 、 Aβ₄₀ 、P-tau、T-tau、 Aβ₄₂/Aβ₄₀ 、T-tau/Aβ₄₂ 、 P-tau/Aβ₄₂ 作為AD生物標志物，通過多元線性回歸模型探究FGCRS和腦脊髓液AD生物標志物的相關性。

本研究結果顯示，FGCRS與腦脊髓液中P-tau、T-tau蛋白水平呈正相關，提示血管風險可能是通過影響AD的tau病理改變參與AD的發病過程。AD發病過程中，過度磷酸化的tau蛋白脫離微管，在腦組織中形成細胞內聚集的神經原纖維纏結，同時過度磷酸化的tau蛋白釋放到腦脊髓液中，引起P-tau升高[16]。研究顯示腦脊髓液中 Aβ₄₂ 水平的降低和 AD發病風險升高相關[17-18]。但在本研究人群中，結果顯示腦脊髓液中 Aβ₄₂ 和FGCRS呈正相關，提示隨著血管風險的增加，腦脊髓液中 Aβ₄₂ 水平升高，該結果與流行病學調查中血管風險會增加AD發病風險的結果不一致[19]。本研究為橫斷面研究，數據均是來源于CABLE研究隊列，目前該隊列所納入的研究對象數量比較有限，因此血管風險與腦脊髓液中 Aβ₄₂ 的相關性，還需要后續更多研究進一步明確。

血管風險可通過誘導內皮細胞凋亡、促進促炎細胞因子表達等途徑引發外周和中樞神經系統低度炎癥[20-22]。在AD的發病過程中，除大腦中的 Aβ 和tau病理改變外，大腦中慢性、持續的炎癥反應也是AD的主要病理特征[23-24]。TREM2是一種先天免疫受體，在中樞神經系統中，TREM2主要存在于小膠質細胞膜表面[25]。sTREM2是TREM2受體水解后的可溶性結構，對小膠質細胞參與炎癥反應起到關鍵調控作用，可反映小膠質細胞代謝水平[26-27];PGRN是一種多功能分泌型糖蛋白，通過抑制促炎通路、調節小膠質細胞功能，在神經炎癥中發揮關鍵作用，腦脊髓液中PGRN濃度的動態變化可以間接反映神經炎癥的活躍程度[28-29]。本研究結果顯示，FGCRS與腦脊髓液中PGRN和sTREM2水平呈正相關。有研究表明，神經炎癥和外周血炎癥細胞都會影響AD 的病理過程[30-31]。基于此本研究通過中介效應分析神經炎癥因子和外周血炎癥細胞是否影響了血管風險與腦脊髓液AD生物標志物間的關聯，分析結果表明，腦脊髓液中sTREM2和PGRN介導了FGCRS與腦脊髓液當中AD生物標志物 Aβ₄₀ 、P-tau、T-tau 和 Aβ₄₂ 之間的關聯，其中sTREM2介導比例為 26.75%～81.82% ，PGRN介導比例為 9.66%～31.03% 。可能由于樣本人群原因，本研究所有外周血炎癥細胞未發現與FGCRS有顯著相關性，不滿足構建中介模型條件，未能對外周血炎癥細胞的介導作用進行驗證。有研究顯示，外周血炎癥細胞可以誘導小膠質細胞活化并表達神經炎癥因子[30]，引起神經細胞外 Aβ 沉積增加[32]，因此，關于外周血炎癥細胞在血管風險與腦脊髓液AD生物標志物關聯中的作用仍需進一步研究。

綜上所述，本研究結果顯示，隨著血管風險的升高，腦脊髓液中 Aβ₄₂Ω，Aβ₄₀Ω，P-tau，T-tau 的水平升高，同時伴隨腦脊髓液中神經炎癥因子sTREM2和PGRN的表達上調；sTREM2與PGRN在血管風險與AD生物標志物間發揮關鍵介導作用。這些可能是血管風險導致AD發病風險增加的機制之一，提示針對血管風險的早期干預和神經炎癥的靶向治療可能是AD臨床治療的另外一種策略。但本研究也存在一定的局限性，如缺乏腦血管影像學資料，關于血管風險可能通過增加腦血管事件發生率間接影響AD病理改變的機制還需進一步深人探討。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過市市立醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號KTLL202306153）。所有試驗過程均遵照《臨床試驗質量管理規范指導原則》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：陳彥明、胡禾穎、譚辰辰、譚蘭參與了研究設計；陳彥明、崔瑞萍、胡浩參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）