中圖分類號：Q592 文獻標志碼：A 文章編號：1000-2367（2025）04-0031-08

肺癌（lung cancer，LC）是最常見的腫瘤之一，也是一種極具威脅的惡性腫瘤，其發病率 （11.4% 僅次于乳腺癌 （11.7%） ；同時，肺癌也是全球范圍內死亡率 （18.0%） 最高的腫瘤[1].肺癌的發病機制目前尚不明確，研究發現有害氣體（吸煙、木材燃燒產生的氣體、汽車尾氣、大氣污染）的侵害是引起肺癌的主要因素[2].肺癌按照組織病理學分型可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中 NSCLC約占肺癌中的 85%^[3] .由于NSCLC的發病率及死亡率均為最高，且大多數早期NSCLC患者并無典型癥狀，被診斷出來時往往已是癌癥晚期[4，因此，肺癌的早期確診對于改善預后、提高生存率有極大的意義.目前，肺癌的診斷方法主要包括胸部X線、胸部CT、肺組織穿刺活檢、腫瘤標志物篩查等.其中，診斷的金標準是肺組織活檢，但其存在有創性、未穿刺到腫瘤、增加腫瘤遠處轉移的風險等缺點[5」.因此，為了有效篩查肺癌患者，迫切需要建立無創或微創、高靈敏度和高特異性的診斷方法.

生物標志物是一種存在于血液中的，能被客觀測量和評價，反映生理或病理過程，以及對暴露或治療干預措施產生生物學效應的指標[6].癌癥生物標志物涵蓋了多種生化分子，可應用于腫瘤的診療，為癌癥的早期診斷和精準預后提供依據[].外泌體是由細胞分泌的直徑為 30～100nm 的一種封閉的脂質雙分子層包裹的囊泡結構，其攜帶多種物質，廣泛分布于體液中，如尿液、血漿、灌洗液、漿膜積液和腦脊液等[8].研究發現外泌體可以增加腫瘤細胞的侵襲能力，促進腫瘤轉移[9].因此，外泌體可作為癌癥臨床治療的重要對象，用作癌癥患者的精確診斷和判斷預后的生物標志物[10].目前，基于質譜技術的外泌體蛋白質組學研究較為流行[1].研究發現，通過聯合使用密度梯度離心法和超速離心法可進一步提高外泌體的純度[12].但是，該方法存在樣本起始量高、回收率低、時間長、成本高等缺點.目前，一些新材料（ TiO₂ 或 Ti⁴⁺ -IMAC）已被應用于富集外泌體，具有樣本起始量低、回收率高、操作簡單快速等優勢.此外，隨著質譜技術的快速發展，液相色譜-質譜分析的方法能夠增加對癌癥生物標志物鑒定的準確性[13」.因此，采用新方法分離純化外泌體以及基于質譜技術的外泌體蛋白質組學分析方法，有望發現肺癌早期診斷新型標志物.綜上所述，本研究首次結合Ti⁴⁺ -IMAC快速分離純化外泌體的方法以及基于高分辨率質譜儀的分析技術，對肺癌患者的血漿樣本進行了系統化的血漿外泌體蛋白質生物標志物研究，探索肺癌患者血漿外泌體蛋白質的變化情況，研究結果將有助于揭示一系列潛在的血漿來源的外泌體蛋白質生物標志物，為肺癌的早期診斷和預后篩查提供支持.

資料與方法

1.1 實驗材料、儀器和研究對象

開展所用實驗儀器和材料見附錄表S1.肺癌患者和健康人的血漿樣本均由四川大學華西醫院呼吸與危重癥醫學科提供.本研究經四川大學華西醫院倫理委員會審批，所有參與本項研究的受試者均簽署書面知情同意書.

1.2 外泌體蛋白質組樣品制備及蛋白酶切

取 100μL 血漿樣品，利用 0.2μm 濾膜去除細胞碎片、死亡小體和大的囊泡等.首先，取 2mg 的 Ti⁴⁺. 1IMAC，加入 200μL 三氟乙酸（TFA，體積分數 0.1% 洗滌 5min，5 000r/min 室溫離心 2min 去除廢液，加人 200μL 磷酸鹽緩沖劑（PBS， pH7.5） 洗滌3次， 500g 離心 1min. 將過濾后的樣品用等量PBS稀釋1倍，加入含有 Ti⁴⁺ -IMAC的 1.5mL 離心管中，置于室溫旋轉混合儀上孵育 10min，4^°C 下 1000r/min 離心1min 去除廢液.加入 100μL 的PBS洗滌3次， 4^°C 下 500g 離心 1min 去除廢液，去除非特異性結合的蛋白質和分子.加入 20μL 的SDT裂解液（體積分婁 含1% 體積分數的蛋白酶抑制劑合成物）， 95°C 金屬浴 5min ，超聲 10min 提取外泌體蛋白（非接觸超聲， 4^°C ，100W，超聲7s，停 條件下 12 000r/min 離心 10min 收集得到外泌體裂解液.

將得到的外泌體裂解液轉移到 30kDa 超濾管中，加人 280μL 的 8mol/L 的尿素溶液，離心收集上清，加入 6μL 的 1mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）， 恒溫箱中孵育 ，加入 15μL 的 1mol/L 碘乙酰胺（IAM）室溫避光孵育 30min. 加入 200μL 的 8mol/L 尿素溶液洗滌一次，加入 200μL 的 50mmol/L 碳酸氫銨溶液洗滌3次， 12 000r/min 離心 10min. 加入 200μL 的 50mmol/L 碳酸氫銨溶液，按 1：50 加入胰蛋白酶， 反應過夜 .12 000r/min 離心 10min 回收肽段并定量.

1.3 液相二級質譜（LC-MS/MS）檢測分析

外泌體肽段通過 Easy-nLCl2Oo 液相聯合含有納升噴霧源的Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀（ThermoFisherScientific）進行分析.液相梯度由溶液A和溶液B構成，A液為體積分數 0.1% 甲酸水溶液，B液為體積分數 0.1% 甲酸乙腈水溶液（乙腈體積分數為 80% ）.每個多肽樣品用體積分數 0.1% 甲酸重新溶解，取 1μg 多肽通過C18色譜柱 （75μm×24cm，1.9μm 填料，Dr.Maisch）分離.液相分離梯度如下： 0～5.0min，B 液線性梯度從 3% 到 8%;5.0～69.0min，B 液線性梯度從 8%～32% 5 69.0～70.5min，B 液線性梯度從 32%～ 60%;70.5～71.0min，B 液線性梯度從 60% 到 98% ： 71.0～78.0min，B 液線性梯度維持在 98% .DIA質譜分析，檢測模式設置為正離子.一級質譜掃描范圍為 350～1500m/z ，質譜分辨率為60 O00，AGCtarget為1 000 000 ，Maximum IT為 50ms.MS2 設置6O個DIA可變采集窗口進行DIA數據采集，質譜分辨率為15000，AGC目標值為500000，MaximumIT為 22ms ，MS2 Activation Type為 HCD，Normalized collisionenergy 為 30.

1.4 質譜數據分析

Spectronaut軟件是一個專業的蛋白質鑒定及數據分析的軟件，常被用于處理DIA分析后所獲得的原始數據.所有原始數據均由 Spectronaut（Version 15，Biognosys AG）軟件進行分析，使用非冗余人UniProt-KB/Swiss-Prot蛋白數據庫（包含 20 259 個蛋白序列），其他搜庫參數均按照軟件默認設置.

1.5 統計學方法

數據分析使用Perseus[14]完成.外泌體蛋白質的顯著性閾值設置為 Plt;0.05 ，兩者的倍數變化閾值之|1.5|.篩選出的差異基因，使用ClusterProfiler 4.0^[15] 做基因本體（gene ontology）和 KEGG（kyoto encyclo-pedia of genes and genomes）分析.使用 String 進行蛋白互作分析（PPI）[16]，PPI 網絡使用 Catoscape 優化，關鍵基因使用cytoHubba插件篩選.

2 結果

2.1外泌體蛋白質組數據采集和數據解析

研究結合 Ti⁴⁺ -IMAC快速分離純化血漿外泌體方法以及無標記DIA定量蛋白質組學技術，針對5例肺癌患者和5例健康人的血漿樣本，進行了外泌體蛋白質組的系統性質譜數據采集.首先，用 0.2μm 濾膜去除細胞碎片、死亡小體和大的囊泡，減小對后續外泌體分離純化的影響.接下來，用 Ti⁴⁺ -IMAC對外泌體進行富集并洗滌非特異性結合物質.隨后，加人胰蛋白酶使外泌體蛋白質酶解完全.最終，基于Orbitrap Fusion Lu-mos 質譜儀器，完成了肽段信息的質譜數據采集，并通過 Spectronaut軟件完成了質譜數據的定性與定量分析.通過數據解析，本研究共鑒定出5020個血漿來源的外泌體蛋白質（排除了2例存在異常值的LC樣本），設定變異系數（CV）閾值為0.3對蛋白質定量數據進行質量控制，最終614個外泌體蛋白質定量數據被保留.

2.2 外泌體蛋白質組的細胞定位與功能

通過細胞定位的富集分析，鑒定到的614個血漿外泌體蛋白質主要聚焦在67個細胞組成的模塊內.這些模塊進一步歸并為15個網絡模塊，它們主要定位于如下細胞結構：皮質肌動蛋白細胞骨架、囊泡包衣、細胞內無膜細胞器、囊泡、細胞質囊泡、細胞器膜、細胞外外泌體、蛋白酶體附屬復合體、蛋白酶體復合體、膜結合細胞器、線粒體、胞內細胞器內腔、真核生物翻譯起始因子3復合體、內質網伴侶復合物、細胞-基質結合處等，如圖1（a）所示.生物學過程的富集分析結果表明，所鑒定的血槳外泌體蛋白質主要集中于151條信號通路中，并被整合為16個相似的網絡模塊.這些模塊主要與以下生物學過程有關：有機氮化合物代謝過程、核糖核苷酸代謝過程、前體代謝物和能量的產生、含蛋白質的復合體組裝、細胞組件組裝、含蛋白質的復合體組織、有機氮化合物的生物合成過程、細胞大分子代謝過程、蛋白質代謝過程、蛋白質分解代謝過程、細胞分解代謝過程、囊泡組織、內質網到高 爾基體囊泡介導的運輸、高爾基體囊泡運輸、建立蛋白質定位、膜內定位等，如圖1（b）所示.

2.3 肺癌的血漿外泌體蛋白生物標志物

為了系統全面地篩查肺癌的血漿外泌體蛋白質生物標志物，對健康人和肺癌患者的血漿外泌體蛋白質組進行了對比分析，采用 t^. -檢驗（554個外泌體蛋白質定量數據）和Wilcoxon秩和檢驗（60個外泌體蛋白質定量數據）作為主要的評估工具.與健康人群相比，肺癌患者的血漿外泌體蛋白質組中鑒定出了41個差異表達的外泌體蛋白質，其中13個呈現上調表達趨勢和28個呈現下調表達趨勢，如圖2及附錄表 S2所示.基于兩組中差異表達的血漿外泌體蛋白質，利用無監督的主成分分析（PCA）分析可知（圖 2（b））：第一主成分表征了 76.7% 的完整血漿外泌體蛋白質變量，第二主成分表征了 8.1% 的完整血漿外泌體蛋白質變量.結果表明，血漿外泌體蛋白質的差異表達可能作為肺癌早期診斷的有效指標.

2.4外泌體蛋白生物標志物的功能注釋

利用ClusterProfiler軟件，我們針對差異表達的血漿外泌體蛋白質展開了功能富集分析，其中主要參照了基因本體（GO）和KEGG的信號通路.分析結果如圖3（a）所示，差異表達的血漿外泌體蛋白質在細胞結構上，顯著富集在細胞質（cytoplasm），胞漿（cytosol），細胞核（nucle-us），細胞外外泌體（extra-cellularexosome），質膜（plasmamembrane）等結構中，主要參與了金屬離子結合（metal ion binding），鈣黏蛋白結合參與細胞-細胞黏附（cadherin bindinginvolved in cell-cell adhe-sion），蛋白質同源二聚化活性（protein homodimer-ization activity），GTPase活性（GTPase activity），ATP 結合（ATP binding）等分子功能.此外，差異表達的血漿外泌體蛋白質還參與了蛋白質轉運（pro-teintransport），細胞內蛋白質轉運（intracellular protein transport），信號轉導（signal transduction），RNA 聚合酶I對轉錄的負調控（negative regulation of transcription by RNA polymerase ⅡI），內高爾基囊泡介導的轉運（intra-golgi vesi-cle-mediated transport）等生物學過程.在KEGG信號通路（圖3（b））中，差異表達的外泌體蛋白質主要參與了剪接體（spliceosome），核質運輸（nucleocytoplasmic transport），mRNA 監測途徑（mRNA surveillancepathway），代謝途徑（metabolic pathways），肌萎縮性側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis）等信號通路.

2.5外泌體蛋白質相互作用網絡分析及典型標志物篩選

根據 String數據庫，采用蛋白質相互作用網絡（PPI）分析方法，進一步對血漿來源的差異表達外泌體蛋白質相關性進行深人分析，擬獲得具有典型代表性的外泌體蛋白質關鍵生物標志物.基于Cytoscape 軟件，采用cytoHubba插件對蛋白質相互作用網絡（PPI）進行了系統性分析，篩查獲得了7個具有典型代表性的血漿外泌體蛋白質生物標志物，主要包括HDAC3、NAPA、ELP3、HAT1、RAB5B、PDIA5、SARAF 等蛋白質（圖4（a，b））.

3討論

肺癌是一種廣泛存在的致命惡性腫瘤，其高死亡率引起了廣泛關注.早期診斷和有效治療對于提高患者的生存率至關重要.目前，臨床上常用的肺癌篩查方法包括胸部X射線、CT掃描、痰液細胞學檢查、支氣管鏡檢查等[5].在肺癌的診斷和監測中，癌胚抗原（CEA）是目前應用最廣泛的血漿生物標志物之一[17].此外，還有 CA125、NSE、ProGRP等生物標志物也被用于肺癌的診斷和疾病監測，但它們的敏感性和特異性有限[18].外泌體存在于包括血漿在內的多種體液中，憑借其豐富的內容物在細胞間通信和信號傳遞中發揮著關鍵作用，并且參與到腫瘤細胞的生長、黏附、轉移以及免疫逃逸等重要過程[19].近年來，多項研究發現肺癌患者血漿外泌體中某些特異性蛋白質或miRNA的表達水平與健康對照組相比存在顯著差異，具有潛在的診斷價值[20].SANDFELD-PAULSEN等[21]利用細胞外囊泡陣列分析肺癌患者和對照組的血漿外泌體，鑒定出CD151、CDl71和 tetraspanin 8可能是潛在的早期診斷標志物.另一項研究發現，與健康對照組相比，肺癌患者血清外泌體中miR-17-5p表達顯著上調，提示其在肺癌診斷中可能具有相當的臨床價值[22J.盡管肺癌血漿外泌體標志物研究取得了一定進展，但目前仍存在一些挑戰，如標準化外泌體分離、檢測方法和建立大樣本量的臨床驗證隊列等.未來，多中心合作的前瞻性研究有助于進一步評估和篩選出穩定、特異、靈敏度高的肺癌外泌體標志物組合，推動其在臨床應用中的轉化.因此，本研究結合 Ti⁴⁺ -IMAC對血槳中的外泌體進行分離純化，采用LC-MS/MS以及DIA定量技術，共鑒定了614個血漿來源的外泌體蛋白質，其中13個呈現上調表達趨勢和 28個呈現下調表達趨勢.在PCA分析結果（圖3（b））中，肺癌患者組（LC1、LC2、LC3）聚集在左側，而健康對照組（HC1、HC2、HC3、HC4、HC5）聚集在右側，兩組之間存在明顯的區分.這一結果表明，肺癌患者和健康對照組的血漿外泌體蛋白質表達譜存在顯著差異.此外，本實驗篩選出7個典型標志物，分別是 HDAC3、NAPA、ELP3、HAT1、RAB5B、PDIA5 和 SARAF.其中，HDAC3、NAPA、HAT1 和 PDIA5蛋白質的差異表達已被報道和肺癌相關.HDAC3在研究中被證實在Kras突變型非小細胞肺癌的腫瘤發展和治療耐藥性中至關重要[23].WANG等[24]則發現PD-L1的表達在順鉑耐藥的臨床 NSCLC 樣本中明顯增加，并與 HDAC3 的表達呈負相關.NAPA 則是一種抗凋亡蛋白，通過誘導腫瘤抑制因子p53 的降解來促進肺癌細胞對順鉑的耐藥性[25].組蛋白乙酰轉移酶1（HAT1）主要定位于細胞核，主要功能是乙酰化定位于細胞質的組蛋白H4的賴氨酸5和12以便其被轉運到細胞核[26」.近年來，HAT1引起了廣泛的關注，因其參與了癌癥，病毒感染和炎性疾病等多種病理過程[27].并且有研究顯示，與非腫瘤組織相比，HAT1蛋白在肺癌腫瘤組織中過量表達，與肺癌患者的不良預后有關，是潛在的生物標志物[28].另一項結合蛋白質組學的多組學分析發現，攜帶L858R 點突變的肺腺癌細胞中PDIA5表達升高，提示PDIA5可能在L858R突變驅動的肺癌發生發展過程中發揮作用[29].

本研究與先前肺癌研究結果的一致性證明了血漿外泌體蛋白質組研究的穩定性與可靠性.除了已報道的生物標志物外，本研究還發現了3個新的潛在生物標志物，即ELP3、RAB5B和SARAF3個血漿來源的外泌體蛋白質.ELP3是RNA聚合酶I（Pol Ⅱ）全酶的一個組成部分，參與轉錄延長，與自主神經功能障礙和某些神經性疾病相關[30].RAB5B 是膜運輸和外泌體形成的調節因子，可視作細胞外囊泡的一種標記蛋白[31]相關研究表明 RAB5B 是由 miRNA-17調控的靶基因之一，在蛋白質相互作用網絡分析中被確認為與肺癌發生發展相關的核心基因[32].SARAF是一種內質網膜常駐蛋白，在調節細胞內鈣離子的存儲含量方面發揮關鍵作用[3」].HDAC3、NAPA、ELP3、HAT1、RAB5B、PDIA5 和SARAF 與肺癌的發生發展關系值得進一步探索.綜上所述，基于非標記定量的外泌體蛋白質組研究發現了一系列肺癌臨床診斷的候選生物標志物，為該疾病的早期診斷和篩查提供了新的見解.

盡管本研究存在樣本量小等局限性，但該研究首次結合了基于 Ti⁴⁺ -IMAC快速分離純化外泌體的方法以及基于DIA定量蛋白質組學方法，證實了血漿來源的外泌體蛋白質在肺癌早期診斷標志物篩查的潛力，為肺癌早期診斷的生物標志物發現提供了新的研究方向，

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2024.01.30.0001）.

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Proteomic analysis of exosomal proteins in plasma as biomarkers for lung cancer

Zhang Yong，Yi Guanhua，Luo Haixin， Zheng Yalin，Liu Wenjing，Gu Yufan，Su Tao， Zeng Wenjuan （West China Hospital；West China Clinical Medical College，Sichuan University，Chengdu 6l0041，China）

Abstract：Lung cancer is a prevalent and fatal malignancy globally，which poses aserious threat to public health due to itshighincidenceandmortalityrates.Toimprovetheearlydiagnosisandtreatmentoutcomesoflungcancer，itisessential to establish minimall invasive，highlysensitive，and specific diagnostic methods.Exosomes areextracellar structures thatcarry biomacromolecules.Theyare widelydistributed inbodilyfluidsandplayacrucialroleinintercelularcommunication.Exosomes are significantlyinvolved inthe development，invasion，and metastasis of tumors and mayserve as animportant sourceof biomarkers for lung cancer.This study appliedlabel-fre quantitative proteomics technologywas applied to perform an in-depthanalysisoftheexosomal proteomein plasma samples fromlungcancerpatients.Theresultsidentified4lexosomal proteins in theplasma that wereeitherupregulatedordownregulated specifically in lung cancer patients，effectivelydistinguishing them fromthe healthy population.Subsequent analysis hasshown thattheparticular expresionof exosomal proteins，including HDAC3，NAPA，ELP3，HAT1，RAB5B，PDIA5 and SARAF，is significantly linked to the progresion of lung cancer. This provides crucial data to support early diagnosis and screening.

Keywords： lung cancer; plasma; exosomes; biomarkers; mass spectrometry; proteomics