植物單倍體育種研究進展

單倍體育種的概念最早可追溯至20世紀初，Buchholz等[在曼陀羅花中首次發現了天然單倍體，此后單倍體的研究一直是學術界的研究熱點。然而，由于自然條件下單倍體形成的概率極低，其實際應用受到限制，單倍體的發展變得十分緩慢。直到Guha等[2-3]通過對曼陀羅花進行花藥離體培養并成功誘導單倍體植株，單倍體育種才成為可行的技術，此研究成果為單倍體育種提供了新的思路。中國科學家也在該領域作出了開創性貢獻，我國首次培育出的單倍體植株是由中國科學院遺傳研究所通過小麥花藥離體培養而成，也是在國際上率先培育出的第一株小麥花粉單倍體植株，這一研究成果一經發出引起世界的廣泛關注。近年來，隨著基因組學、組織培養技術以及基因編輯技術的發展，單倍體育種在作物遺傳改良和生物學研究中得到廣泛應用。單倍體育種不僅能夠顯著縮短育種周期，還可以通過染色體加倍快速獲得基因型純合的雙單倍體（DH，Doubledhaploid）植株[5]。通過配子胚胎發生產生單倍體和雙單倍體，從雜合親本一步發展為完整的純合子系，為優質作物新品種選育提供了一條高效途徑[。回顧單倍體育種的百年歷程，從早期天然單倍體的偶然發現，到花藥離體培養技術的關鍵突破，再到如今多學科技術的深度融合，這項技術不斷突破發展瓶頸。本文將從理論基礎、技術方法、應用現狀及未來發展方向對單倍體育種進行系統綜述。

1單倍體的產生

單倍體在自然條件下的形成極為罕見，如圖1所示，主要通過以下途徑實現，

1.1 自然途徑

1.1.1孤雌生殖孤雌生殖是指卵細胞不經過受精而自主發育成胚胎的生殖方式，該現象在自然界中廣泛存在。在昆蟲、蜥蜴和魚類等動物中尤為常見，在植物中大多以雌雄異株植物為主，尤其是大麻屬、山靛屬、菠菜屬和蓖麻屬植物，還有一些具有雌雄單性花的雌雄同株植物，例如玉米。孤雌生殖現象最早由Bonnet于1745年在蚜蟲中發現，而在植物中，Smith于1841年在大戟科植物山桿麻中首次發現，該植物無需花粉即可產生正常種子，這一發現被認為是無性繁殖的第一個證據[7-8]。我國對孤雌生殖的研究也作出了重要的貢獻，例如在甘藍型油菜中，1976年四川大學植物遺傳實驗室首次報道了甘藍型油菜誘發孤雌生殖的初步結果，并在后續20年間進行了一系列研究[]。

圖1植物單倍體和雙單倍體產生途徑

1.1.2孤雄生殖孤雄生殖是指卵核在精子入卵后即發生退化和解體，在卵細胞質內發育成只含雄配子染色體組的單倍體胚的生殖方式。根據植物性別表現的不同，孤雄生殖可分為兩大類：完全孤雄生殖以及部分孤雄生殖。完全孤雄生殖通常指所有植物個體中有些是完全雌性，而有些則是雌雄同體，或以某些雄性器官表現為主要特征，這種生殖方式在植物群體中較為常見，尤其是自花授粉的物種中[10]。部分孤雄生殖則是指植物體內雖然存在雄性生殖器官，但在某些特定的環境條件或發育階段，某些個體會表現為部分雌性或雄性生殖特征。這種現象通常與植物的適應性演化緊密相關，通過不同的性別表現形式幫助植物種群在動態環境中保持較高的繁殖成功率[11]。不同的作物品種和基因型對孤雄生殖的響應可能不同。因此，在進行孤雄生殖育種時，需要選擇對孤雄生殖敏感的作物品種和基因型。通過選擇合適的品種和基因型，可以提高孤雄生殖的效率[12]

1.1.3無配子生殖植物的無配子生殖是一種廣義的單性生殖，是維管（束）植物中配子體卵細胞以外的細胞單獨分裂和發育產生孢子體的現象，這種方式在蕨類植物群體中表現尤為突出。例如金粉蕨的配子體僅產生精子器，不形成頸卵器，屬于專性無配子生殖，其配子體生長點下方的細胞經分裂形成無配子生殖胚，最終發育成孢子體[13]。與有性生殖相比，無配子生殖具有較高的效率和適應性，尤其在環境條件嚴苛或配子發生不利的情況下。然而，盡管無配子生殖的研究逐漸深入，但其機制、調控和生態適應性仍然是當前植物學研究的前沿領域。

總的來說，由于自然單倍體形成的概率低（ lt;0.1% ），難以滿足育種需求。

1.2人工誘導單倍體相較于自然途徑產生的單倍體，人工誘導單倍體產生的效率較高。人工誘導單倍體主要包括誘變以及離體培養的方式。目前離體培養是獲得大量單倍體最高效的方法。離體培養主要包括花藥培養、花粉培養、胚珠培養以及直接從母體植株中提取細胞，通過人為創造環境誘導形成單倍體。隨著研究的深入，基因編輯技術也逐漸成為誘導單倍體的主要方法（圖1）。

2單倍體育種的技術方法

2.1花藥培養技術花藥培養技術是通過體外培養植物花藥，誘導花粉發育成單倍體植株的一種方法。該技術在植物育種和遺傳研究中具有重要意義，能夠縮短育種周期、提高育種效率，并為遺傳改良提供純合的遺傳材料。花藥培養的核心在于將處于特定發育階段的花藥在適宜的培養基上培養，誘導其中的小孢子（花粉母細胞）由配子體發育途徑轉向孢子體發育途徑，最終形成單倍體植株。這些單倍體植株經過染色體加倍處理，可獲得純合的二倍體植株，廣泛應用于育種實踐中。

花藥培養的成功率受多種因素影響，包括以下幾點：（1）基因型依賴性。不同植物種類和品種對花藥培養的響應存在顯著差異。例如，小麥的花藥培養效果受基因型影響顯著[14]。（2）培養基成分。培養基中的激素種類和濃度、碳源類型、礦質元素等都會影響花藥的脫分化和再分化過程。研究表明，適當的激素組合有助于提高愈傷組織的誘導率和再生能力[15]。（3）培養條件。溫度、光照、pH值等環境條件對花藥培養的效果也有重要影響。例如，適宜的溫度和光周期有助于提高花藥的再生效率。

2.2花粉培養技術花粉培養技術的核心挑戰在于維持花粉的活力和胚性分化能力。研究表明，預處理溫度（通常為 4～10^°C ）顯著影響花粉的胚性誘導效率。例如，在小麥花藥培養中，低溫預處理可明顯提高花粉愈傷組織的數量[]。此外，培養基中碳源種類對花粉培養的成功率也有重要影響。在辣椒花藥培養中，碳源的選擇直接影響胚狀體的誘導與植株再生[17]。與花藥培養相比，花粉培養直接將花粉粒培養成單倍體胚，省略了花藥分離過程，但對花粉粒的活力要求更高。因此，優化預處理條件和培養基成分對于花粉培養至關重要

2.3胚珠培養技術胚珠培養是一種通過離體培養未受精胚珠，誘導其發育為單倍體植株的技術。該方法在植物育種中具有重要意義，尤其適用于花藥培養難以成功的物種。胚珠培養的核心在于利用未受精的胚珠，通過適當的培養條件，誘導其發生雌核發育，直接形成胚狀體，進而發育成單倍體植株。這一過程避免了受精步驟，使獲得純合基因型的單倍體成為可能。不同物種對胚珠培養的響應存在顯著差異。例如，在黃瓜的研究中，不同基因型的胚珠培養成功率差異明顯[18]。胚珠的發育時期直接影響培養效果。通常，選擇胚囊發育至八核至成熟階段的胚珠進行培養，成功率較高。適當的預處理（如低溫處理）有助于提高胚珠的培養效率。在小麥的研究中，低溫預處理顯著提高了胚珠的愈傷組織誘導率[19。培養基中的碳源、激素種類和濃度對胚珠培養至關重要。在南瓜屬蔬菜的研究中，培養基中添加適量的生長素和細胞分裂素可提高單倍體植株的誘導效率[20]。胚珠培養已成功應用于多種作物的單倍體誘導，如油菜、黃瓜、甜瓜等。通過該技術，可加速育種進程，縮短育種周期，獲得純合的雙單倍體植株。盡管胚珠培養在單倍體誘導中具有獨特優勢，但其成功率仍受多種因素影響，且不同物種間存在差異。未來的研究應致力于優化培養條件，深入理解胚珠發育機制，以提高胚珠培養的效率和穩定性。

2.4基因編輯技術通過CRISPR/Cas9系統對孤雌生殖相關基因進行編輯，可以人工誘導單倍體形成。CRISPR/Cas9技術的興起為單倍體誘導提供了新的可能性。通過編輯關鍵調控基因（如孤雌生殖相關基因），可以顯著提高單倍體的誘導率[21]

2.4.1基因編輯改造CENH3基因創制單倍體誘導系CENH3（Centromere-specific histone 3variant）即著絲粒特異組蛋白H3變異體，在真核生物中對著絲粒的形成和功能發揮至關重要[22]。它是細胞分裂時染色體分離所必需的，決定著絲點的定位。2010年Ravi等[23]報道了通過在著絲粒組蛋白H3（CENH3）中引人單一基因改變，可以有效地誘導產生單倍體植物。這一研究成果的發表是單倍體研究的一項重大突破，也為基因編輯創制單倍體提供了新思路。

基于CENH3基因的單倍體誘導系在玉米中有一定的應用。如利用CRISPR/Cas9創制CENH3突變雜合子（+/cenh3），通過與野生型植株正反交誘導單倍體[24]。此外，利用基因編輯突變CENH3基因創制單倍體誘導系在擬南芥、大麥和甜菜中也有相關報道[25]。

在植物中，單倍體胚誘導是一種強大的植物育種工具，但其應用目前僅限于極少數作物。通過對著絲粒組蛋白H3（CENH3）進行基因編輯，可構建基于種子的單倍體系統，該系統能夠產生父本單倍體胚。結合有關將玉米母本單倍體誘導能力轉化至小麥和水稻的研究，成功實現了父本單倍體胚胎的產生。這一創新性系統為單倍體胚胎誘導提供了新途徑，打破了以往單倍體誘導系的局限性，為植物育種拓展了更多可能性[26]

2.4.2MTL/PLA1/NLD介導的單倍體誘導MTL/PLA1/NLD（磷脂酶AI）是在玉米中發現的一個關鍵基因，它在單倍體誘導中起著重要作用[27]。目前的研究表明，該基因功能缺失能夠介導單倍體誘導。具體來說，通過對ZmPLA1突變體花藥進行綜合的多組學分析，包括轉錄組、代謝組、定量蛋白質組和蛋白質修飾數據的整合，發現與氧化應激反應相關的分子實體的功能類別顯著富集或差異豐富，這表明活性氧（ROS）爆發在單倍體誘導中起著關鍵作用。進一步的研究發現，用ROS試劑對花粉進行簡單的化學處理可以誘導單倍體產生。

由于MTL/PLA1/NLD基因家族的成員比較常見，在單子葉植物中的序列相似性高，功能類似，可以作為創制單倍體誘導系的候選基因。在水稻研究中利用CRISPR/Cas9編輯水稻中OsPLA1的同源基因，成功創制了第一個水稻單倍體誘導系，誘導率為 2%～6%^[28] 。在小麥中CRISPR/Cas9系統編輯小麥TaMTL基因，結果顯示：TaMTL-4A和TaMTL-4D 的雙敲除突變系的單倍體誘導率為 10% ，而TaMTL-4A、TaMTL-4B和TaMTL-4D三敲除突變系的單倍體誘導率為11.8%～31.6%[29]。

雖然磷脂酶基因ZmPLA1已在水稻、小麥等植物上成功應用并獲得了單倍體，但是在雙子葉植物中的進展仍然十分緩慢。在雙子葉植物中，此基因的序列變異大，表達效果多樣，功能也不完全相同。這就需要對該基因在雙子葉植物中的表達進行更深的研究，了解其在雙子葉植物中的作用機制。

2.4.3DMP介導的單倍體誘導 Zhong等[30]率先克隆了首個非誘導系Stock6來源的玉米單倍體誘導關鍵基因ZmDMP，該基因編碼一個DUF679（DOMAINOFUNKNOWNFUNCTION679）結構域的膜蛋白，在花粉發育后期高度表達，通過基因編輯手段敲除ZmDMP基因可以獨立誘導產生單倍體，單倍體誘導效率為 0.1%～0.3% ，與MTL基因不同， DMP 在某些單子葉植物和大多數雙子葉植物中具有保守性，為在雙子葉植物中應用這種單倍體誘導系統提供了可能性。Zhong等[3]利用基因編輯技術對擬南芥中與ZmDMP同源的AtDMP8和AtDMP9進行了編輯，構建的誘導系誘導效率為2.1%±1.1% ，并且開發了一種種子特異表達的RFP標簽以加快單倍體種子的篩選。隨后在番茄、苜蓿、油菜、馬鈴薯和西瓜等雙子葉植物中相繼報道出DMP基因可以誘導產生單倍體[32-36]。Zhao等[37]克隆了一個在花粉中高表達的甘藍基因BoC03.DMP9，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對其功能進行了研究，發現boc03.dmp9功能敲除突變體自交或作為父本進行雜交，均能夠誘導產生母本單倍體，誘導率為 0.41%～2.35% ，沒有基因型依賴性。Zhong等[38]在甘藍型油菜中鑒定到4個DMP基因，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術進行了多靶位點敲除，獲得的敲除突變體中單倍體誘導率達到 2.4% 。與此同時，Li等[34使用同樣的方法敲除了甘藍型油菜Westar的4個BnaDMP基因，在 T0.T1 和T2代的單倍體誘導率可達 2.53% 。另外，Zhong 等[38]與Li等[34都發現4個BnaDMP同源基因之間存在劑量補償效應，在二突、三突和四突中單倍體誘導率逐步提升。

2.4.4其他基因的單倍體誘導應用雖然已經發現許多單倍體誘導基因的存在，但是鑒定更多單倍體誘導基因對解析單倍體誘導遺傳機理具有重要意義。2021年中國農業大學宋偉彬課題組發現玉米單倍體誘導新基因——ZmPLD3，ZmPLD3的功能缺失突變導致單倍體誘導率與 MTL/ZmPLAl/NLD 相似，并且在MTL/ZmPLA1/NLD存在的情況下顯示出協同效應而非功能冗余，將單倍體誘導率從 1.19% 提高到 4.13% ，此外，ZmPLD3在谷物中高度保守，表明這些體內單倍體誘導系在其他重要作物中具有潛在的應用價值[39]。Jiang等[40]鑒定了全新的能誘導單倍體的基因ZmPOD65，它編碼一種精子特異性過氧化物酶，是一個控制單倍體誘導的新基因，為玉米單倍體誘導創造了一種新方法，也為加速作物育種提供了一條潛在途徑。

3染色體加倍技術

獲得單倍體后，利用染色體加倍技術將其轉變為純合體。染色體加倍是單倍體育種的核心環節，其方法主要有以下幾種。

3.1化學加倍通過使用化學藥劑（如秋水仙素、去甲基水楊酸酯等）干擾微管蛋白聚合，抑制紡錘體形成，從而阻正細胞在有絲分裂過程中染色體的正常分離，誘導加倍。Blakeslee等[41]首次報道了使用秋水仙素誘導植物染色體加倍的方法。

3.2物理加倍通過熱處理或冷處理干擾細胞周期以促進染色體加倍。Ramsey等[42論述了物理方法在多倍體形成中的作用。但由于難度較大，所以目前以此方法進行染色體加倍的應用較少。除此之外，溫度激變和射線的方法也能誘導植物多倍體的產生。

3.3其他方法目前體細胞融合法、胚乳培養法以及農桿菌介導法也逐漸成為誘導多倍體的熱門方法。隨著基因編輯技術的興起，利用CRISPR/Cas9等工具調控細胞周期相關基因（如MAD2或BUB1基因）成為誘導染色體加倍的潛在方法[43]。這種方法具有特異性高、毒性低的優勢，但目前仍處于實驗室研究階段。

4單倍體育種的應用

4.1農作物遺傳改良玉米玉米是全球重要的糧食和飼料作物。玉米單倍體育種能夠將純系的育種時間從6～7代縮短至1～2代，極大地縮短了育種進程。中國農業大學陳邵江教授團隊利用MTL/ZmPLA1/NLD基因突變，在玉米中可以產生 2% 的誘導率[30]，在國際上率先攻克了玉米單倍體誘導的難題。僅通過兩個世代就可以獲得育種所需要的純系，讓玉米育種坐上了育種的“高鐵”專列。

水稻水稻是全球主要的糧食作物之一。單倍體育種技術在水稻育種中被廣泛應用。通過花粉培養等方法，可快速獲得純合體，加速抗病、抗逆等優良性狀的選育。采用定向回交育種方法，結合分子標記輔助選擇技術和花藥培養技術，快速改良了武運粳29196的稻瘟病抗性。以粘稻品種谷梅4號為稻瘟病抗性基因Pigm（t的供體，經過連續回交和自交過程，利用與Pigm（t）緊密連鎖的InDel標記進行分子標記輔助選擇。在 BC₂F₁ 世代進行花藥培養，獲得185個雙單倍體群體（DH群體），從中篩選出82個含有Pigm（t）基因的改良株系。經過農藝性狀、稻瘟病抗性和稻米品質性狀的系統鑒定，發現改良株系DH036和DH158的綜合性狀與武運粳29196已十分相近，且稻米品質有所提升，在保持了武運粳29196豐產性的同時，稻瘟病抗性有了明顯提高[44]

4.2植物遺傳研究單倍體育種通過快速構建純合群體，為植物遺傳研究提供了重要材料，加速了基因定位、基因功能驗證、復雜性狀解析以及分子標記輔助選擇的研究進程。在基因定位方面，利用DH技術可以快速精確地定位目標基因。例如，在水稻中，采用混合線性模型的復合區間作圖方法，對水稻圭630和02428組合DH群體的谷粒外觀性狀粒長、粒寬和粒型進行了數量性狀基因定位，同時對定位的主效應和上位性進行了環境效應分析[45]。在基因功能驗證方面，單倍體育種與基因編輯技術結合，為研究提供了高效工具。例如，在玉米中，中國農業大學田豐課題組和李繼剛課題組合作研究，首次在玉米中鑒定到“智慧株型”基因ac1，揭示了光信號動態調控lac1促使玉米適應密植的分子機制，并建立了“一步成系”的單倍體誘導編輯技術體系[46。此外，復雜性狀（如產量和抗逆性）通常由多基因控制，傳統解析方法易受遺傳背景干擾，而DH技術通過提供均一的純合遺傳背景，結合數量性狀位點（QTL）分析，有效解析了復雜性狀。同樣，在現代育種中，DH技術結合MAS顯著提升了選擇效率。例如，在油菜中，通過DH技術快速純合攜帶抗病基因標記位點的植株，不僅加速了抗病品種的選育，還大幅度減少了育種周期和成本[47]。這些優勢使得單倍體育種在植物遺傳研究和分子育種中展現了廣泛應用潛力。

4.3轉基因育種利用單倍體育種技術可快速篩選轉基因植株，顯著提高轉基因作物開發效率。單倍體育種技術在轉基因作物的篩選和穩定方面具有重要應用價值。通過單倍體技術，可以快速篩選出穩定表達目標基因的轉基因植株，提高轉基因育種的效率和精準性。例如，在玉米研究中，利用單倍體誘導技術結合CRISPR/Cas9基因編輯系統敲除ZmPLD3基因，成功地在一代內獲得了純合的基因編輯植株[48]。這種方法顯著縮短了育種周期，提高了育種效率。

5 未來發展方向

5.1技術優化未來的研究將進一步優化單倍體誘導和染色體加倍技術，提高效率和穩定性，降低成本。尤其是在不同作物中，優化培養基配方和培養條件，以適應更多作物種類的需求。

5.2多樣化作物應用將單倍體育種技術推廣到更多作物中，特別是一些對經濟和生態發展重要的非主糧作物，如蔬菜、果樹和花卉等，單倍體育種技術能夠提高這些作物的育種效率和品種改良速度。

5.3與分子育種結合將單倍體育種與基因組選擇和分子標記輔助育種結合，提升精準性。將單倍體育種與分子標記輔助育種、基因組選擇等現代育種技術結合，進一步提高育種效率和精準性。這種綜合育種策略將有助于更快速、更準確地開發出符合市場需求和環境適應性的新品種。

6結論

單倍體育種作為一種革命性的育種技術，通過快速純合基因型，大幅縮短了育種周期，是現代農業遺傳改良的重要工具。它在單倍體誘導、染色體加倍和純合體選擇方面具有顯著優勢，為作物改良提供了高效的平臺。單倍體育種不僅應用于抗病、抗逆、高產等性狀的改良，還在基因功能驗證、數量性狀位點精確定位、分子標記輔助選擇等方面具有不可替代的作用。通過與CRISPR/Cas9基因編輯技術的結合，單倍體育種顯著提升了復雜性狀遺傳解析的效率和準確性。

未來，隨著技術的不斷優化，如單倍體誘導率的提高、染色體加倍效率的改進，以及高通量基因組測序技術的應用，單倍體育種將進一步降低育種成本，提高品種改良的速度和質量。此外，新方法的探索，如在多倍體作物和非模式植物中的應用，將拓展其適用范圍，為全球農業生產提供更廣泛的支持。在全球氣候變化和糧食安全挑戰日益嚴峻的背景下，單倍體育種技術有望在糧食增產、抗逆性育種及精準農業中發揮更加重要的作用，為實現農業的可持續發展提供強有力的科學依據和技術支撐。

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