豬繁殖與呼吸綜合征病毒的逆轉錄重組酶介導等溫擴增熒光檢測方法的建立及應用

中圖分類號：S828 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）05-1286-07

0 引言

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinere-productiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的，可導致母豬嚴重繁殖障礙和所有年齡段的豬呼吸窘迫[1]。PRRSV 的暴發是由于該病毒發病迅速，傳播速度快，仔豬發病率和死亡率高[2]。由于快速準確的檢測PRRSV是預防和控制PRRS的關鍵因素之一，因此需要建立一種靈敏度高、特異性強、成本相對較低、適合現場的檢測方法，降低PRRSV傳播的風險。【前人研究進展】PRRSV基因組的全長為 15.4kb 左右，包含有11個已知的開放閱讀框，PRRSVGP4是由ORF4所編碼的[3]，ORF4編碼的結構蛋白GP4參與病毒感染，高度糖基化，帶有4個N連接糖基化位點，是一個相對保守的高糖基化的結構蛋白[4]GP4蛋白與 GP2a，GP3 這三個N-糖基化蛋白形成三聚體包膜蛋白復合物，參與病毒的組裝[5.6]GP4是PRRSV復制和轉化的關鍵，且GP4和PRRSV的主要受體之一CD163能夠互相作用[7]，在病毒組裝和釋放過程發揮重要作用[8]，因此GP4蛋白對于PRRSV檢測都有著舉足輕重的作用。重組輔助擴增（recombinase-aidedisothermal amplifi-fication，RAA）作為一種等溫核酸擴增的新技術，資源要求低，只需四種酶在恒溫 37～42^°C 下短時間15～30min 即可完成擴增[9]。近年來，基于實時熒光技術的RAA/RT-RAA已成功用于SARS-CoV-2^[10] 、鴨圓環病毒[]、豬流行性腹瀉病毒[12]、豬瘟病毒[13]等多種病毒的快速檢測。【本研究切入點】PRRS是世界范圍內最重要的豬類疾病之一，PRRSV感染也會使豬容易被其他病原體繼發感染[14]。由于目前還沒有有效的方法和藥物來防治PRRSV，因此研究出有效的防控策略是非常重要和迫切的。早期診斷對于PRRS預防和控制至關重要，所以開發一種用于PRRSV檢測的快速、簡單和準確的現場診斷測定仍然是必要的。【擬解決的關鍵問題】基于ORF4基因建立熒光RT-RAA檢測PRRSV的方法，為PRRSV的快速檢測提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1. 1.1 病毒

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine respiratoryandreproductive syndromesvirus，PRRSV）TJM-F92株、R98株、NADC30株、豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）C株、偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）Bartha-K61株、豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）LJX株、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissi-ble gastroenteritisvirus，TGEV）Purdue株均保存于海南省農業科學院畜牧獸醫研究所海南省熱帶繁育與疫病研究重點實驗室。

1. 1.2 臨床樣本

180份血清樣本采集自海南省海口市、臨高縣、瓊中縣等地豬場，由海南省農業科學院畜牧獸醫研究所海南省熱帶繁育與疫病研究重點實驗室保存于 - 80^°C 備用。

1. 1.3 試劑

RT-RAA核酸擴增試劑購自杭州眾測生物科技有限公司;FastPureViralDNA/RNAMiniKit試劑盒購自諾唯贊（Vazyme）公司； ExTaq（2×） ：dNTPMixture、Recombinant RNase Inhibitor、Re-verse TranscriptaseM-MLVDL2，OOO DNAMark-er均為TaKaRa公司產品。

1.2 方法

1. 1 核酸的提取

依照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒的操作說明，提取病毒及臨床樣品的核酸，并于 -80^°C 保存備用。

1. 2 引物及探針的設計與合成

從NCBI的Genbank數據庫下載PRRSVCH-1a株（AY032626）、JXA1株（EF112445）、XH-GD 株（EU624117）、10GZ-GD 株（JX192633.1）、NADC30株（JN654459）、R98株（DQ355796.1）和GM2株（JN662424）等的GP4基因序列通過MegAlign進行對比，針對基因序列的保守區域，應用Oligo7.0軟件設計特異性引物和探針，并在線對設計的引物和探針進行BLAST分析。設計探針時，探針長度在 46～52nt 之間，共有四個修飾位點，中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點，THF位點的上游標記一個熒光基團，下游標記一個淬滅基團。送生工生物工程（上海）有限公司合成。上述引物對序列為RAA-ORF4-F：5’-TTCGGACAT-CAAAACCAACACCACCG -3’ ;RAA -ORF4 -R：5’- ACTCATCTCGGAAGCATAGAAAAGGCAAG-3';RAA-ORF4探針序列為：5’-TCCCTGGT-GGTCGACCATGTGCGGTTGC（HEX -dT） C（THF）A（BHQ1 - dT） TTCATGACACCTG - C3 Spacer - ，擴增產物長度為 130bp 。

1.3 RAA擴增體系的建立

按照熒光RT-RAA核酸擴增試劑盒使用說明配制反應體系進行擴增，在反應管中加入ABuffer 25.0μL ，上下游引物（ 10μmol/L ）各2μL ，探針 （10μmol/L）0.6μL ，DEPC 水 19μL 混合均勻后加至有反應干粉的檢測單管中，加入5.0μL 模板，再向每個檢測單元管蓋上加入5μL BBuffer，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10s，將上述反應管放置于熒光定量PCR儀中， 39^°C 反應 20min ，實時觀察檢測結果。

1.4 反應體系優化

為了優化反應體系內引物濃度、探針濃度、樣品添加量及反應溫度，在 50μL RAA反應體系內以PRRSVR98的基因組RNA為模板（濃度為52ng/μL） ，以試劑盒推薦的引物及探針濃度10μmol/L ，將引物對的終濃度配制為 0.3、0.4、0.5 10.6μmol/L 進行熒光RT-RAA反應，以確定最佳引物濃度；待確定最佳引物濃度后，將探針終濃度配制為 0.1、0.2、0.3 和 0.4μmol/L 進行熒光RT-RAA反應，以確定最佳探針濃度；待確定引物及探針濃度后，確定最適樣品添加量；全部確定后，以37、39、41和 43^°C 進行熒光RT-RAA反應，確定最佳反應溫度，以DEPC水作為陰性對照。

1.5 敏感性試驗

將PRRSVR98的基因組RNA（濃度為 54ng/ μL ），進行5倍梯度稀釋，用作熒光RT-RAA敏感性測試的模板，以DEPC水作為陰性對照，以確定熒光RT-RAA方法的最低檢測限。

1. 6 特異性試驗

以提取PRRSV、TGEV、CSFV、PEDV、PRV等病毒核酸為模板，應用建立的RAA方法進行擴增，同時以DEPC水做為陰性對照，評價該方法的特異性。

1.3 數據處理

提取臨床樣本RNA，檢測建立的PRRSV熒光RT-RAA方法，同時將樣本RNA反轉錄得到cDNA用普通PCR方法檢測臨床樣本中PRRSV感染情況，并比較兩者的檢測結果。

2 結果與分析

1 反應體系優化

研究表明，探針終濃度為 0.3μmol/L 的擴增曲線最早出峰;進一步對熒光RT-RAA反應體系的引物濃度進行篩選，引物終濃度為 0.5μmol L起峰最快，熒光值最高；進一步對樣品添加量進行優化，樣品添加量為 364ng 起峰最早，擴增效率最高；對反應溫度進行優化，反應溫度為 41^°C 起峰最快，達到閾值的時間最短。圖1～4

注：1：探針終濃度為 0.lμmol/L;2 ：探針終濃度為 0.2μmol L；3：探針終濃度為 0.3μmol/L;4 ：探針終濃度為 0.4μmol/L;5 陰性對照

圖1 PRRSV熒光RT-RAA方法探針濃度優化

Fig.1Optimisationofprobe concentrationforPRRSVfluorescent RT-RAAmethods

注：1：引物終濃度為 0.3μmol/L;2 ：引物終濃度為 0.4μmol L；3：引物終濃度為 0.5μmol/L;4 ：引物終濃度為 0.6μmol/L;5 陰性對照

圖2 PRRSV熒光RT-RAA方法引物濃度優化

Fig. 2Optimisation of primer concentration forPRRSVfluorescentRT-RAAmethod

注：1：總RNA量為 156ng;2 ：總RNA量為 260ng;3 ：總RNA量為 364ng;4 ：總RNA量為 ：陰性對照Notes：1：156ng oftotalRNA;2： 260ng of totalRNA;3：364ng of total RNA；4：468ngof total RNA；5：negative control

圖3PRRSV熒光RT-RAA方法樣品添加量優化

Fig.3Optimisation of sample addition forthePRRSVfluorescenceRT-RAAmethod

2 敏感性試驗

研究表明，以PRRSVR98的基因組RNA5倍梯度稀釋液為模板進行檢測熒光RT-RAA方法的靈敏度，隨著稀釋度的降低，出峰時間逐漸延長，熒光值梯度降低，最低可以檢出 0.0864ng 總RNA量，而陰性對照熒光信號無明顯變化，該方法具有較高的靈敏度。圖5

圖4 PRRSV熒光RT-RAA方法反應溫度優化

注：1：反應溫度為 37% ；2：反應溫度為 39% ；3：反應溫度為41% ；4：反應溫度為 43% ；5：陰性對照

Notes：1：reaction temperature was 37^°C ；2：reaction temperature was 39^°C ；3：reaction temperature was 41^°C ；4：reaction temperature was 43^°C ；5：negative control

Fig. 4Optimisation of reaction temperature forPRRSVfluorescentRT-RAAmethod

注：1：總RNA量為 54ng;2 ：總RNA量為 10.8ng;3 ：總RNA量為 16ng;4 ：總RNA量為 0.432ng;5 ：總RNA量為0.0864ng;6 ：陰性對照

Notes：1：54ng of total RNA;2：1O.8ng of total RNA;3：16 ng of total RNA;4：0.432ng of total RNA;5：0.086，4ng of total RNA;6：negative control

圖5 PRRSV熒光RT-RAA方法敏感性試驗

Fig. 5 PRRSVfluorescentRT-RAA methodsensitivitytest

3 特異性試驗

研究表明，用建立的熒光RT-RAA方法對PRRSVNADC3O株、PRRSVTJM-F92株、PRRSVR98株、TGEVPurdue株、CSFVC株、PEDVLJX株、PRVBartha-K61株的核酸為模板進行特異性試驗，只有PRRSV收集到特異性熒光信號，其他病毒核酸和陰性對照均無熒光曲線，表明建立的方法特異性良好。圖6

圖6 PRRSV熒光RT-RAA方法特異性試驗結果

注：1：PRRSVNADC3O株；2：PRRSVTJM-F92株;3：PRRSVR98株;4-8：分別為：TGEVPurdue株、CSFVC株、PEDVLJX株、PRVBartha－K61株、陰性對照Notes：1：PRRSV NADC3O strain;2：PRRSV TJM-F92 strain;3：PRRSV R98 strain; 4-8：TGEV Purdue strain，CSFV C strain，PEDVLJX strain，PRV Bartha-K61 strain，negative control，respec-tively

Fig.6PRRSV fluorescent RT-RAA methodspecificitytestresults

研究表明，熒光RT-RAA方法和普通PCR的陽性/陰性樣品分別為76/104和73/107。通過熒光RT-RAA方法檢出76份樣本為陽性而普通PCR結果卻顯示僅有73份樣本為陽性，檢出104份樣本為陰性而普通PCR結果卻顯示有107份樣本為陰性。兩種方法之間的符合率為98.3% ，熒光RT-RAA方法檢測PRRSV可應用于臨床。表1

表1熒光RT-RAA方法與PCR方法檢測臨床樣本的比較

Tab.1 ComparisonofRT-RAA-LF andPCRmethodsforthedetection of clinical samples

3討論

3.1PRRSV屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，是一種有包膜的單鏈RNA病毒，基因組大小約為15.4kb^[15] 。根據其遺傳特征，PRRSV可分為兩種基因型：1型（PRRSV-1）和2型（PRRSV-2）[16]。針對 PRRSV 的商業疫苗目前提供的保護有限，變異率最高[17]。此方法有可以縮短獲得準確結果所需的時間，有助于發現早期感染PRRSV的豬群，可以更好地制定有效的隔離措施，從而切斷傳播途徑，更好的進行治療。

3.2研究針對PRRSVORF4基因序列設計特異性引物和探針，建立了熒光RT-RAA檢測方法，進行了條件優化以及特異性試驗和敏感性試驗。熒光RT-RAA檢測可在 41^°C 下用引物和探擴增20min ，通過熒光定量PCR儀實時觀察結果，實現了對PRRSV的快速高效的可視化檢測。該方法具有較高的靈敏度和較強的特異性，最低可以檢出 0.0864ng 總RNA量，與其他豬病原體也無交叉反應。

3.3近年來，開發出了基于等溫擴增技術的PRRSV快速檢測方法。與已發表的王方洲等[18]建立的實時熒光RPA檢測美洲型PRRSV方法相比熒光RT-RAA方法的溫度更低更好實現。與已發表的孫鳳萍等[19]建立的RT-LAMP檢測PRRSV方法相比，熒光RT-RAA方法的檢測時間更短，且不需要設計復雜的引物。與張森豪等[20]建立的LF－RPA 檢測 PEDV 相比，熒光RT-RAA方法使用病毒RNA即可直接進行檢測，不需要反轉錄成cDNA。此外，反應條件和特異性與其他RAA研究相似[2I-23]，表明RAA有望成為病原體檢測的通用技術。

4結論

建立的熒光RT-RAA法具有一定的準確性、良好的特異性和較高的敏感性，其結果可通過熒光定量PCR儀進行實時觀測。

參考文獻（References）

[1]曹宗喜，焦培榮，譚樹義，等．基于DNA-launched的豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳操作系統的建立［J].動物醫學進展，2016，37（11）：1-8.CAOZongxi，JIAO Peirong，TAN Shuyi，etal.Establishment ofDNA-launched reverse genetics system of PRRSV[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2016，37（11）：1-8.

[2］曲麗靜．淺談豬繁殖與呼吸綜合征的預防與治療［J]．中國動物保健，2023，25（8）：27-28.QULijing. An introduction to the prevention and treatment ofporcinereproductiveand respiratorysyndrome[J].ChinaAnimalHealth，2023，25（8）：27-28.

[3］付寧寧，周露佳，陳夢莉，等．豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP4 蛋白的原核表達及多克隆抗體的制備 JOL] ．中國動物傳染病學報，2023：1-9.（2023-08-07）．https：//kns.cnki. net/KCMS/detail/detail. aspx？ filenameZSJB20230804001amp;dbname Σ=Σ CJFDamp;dbcode CJFQ.FUNingning，ZHOULujia，CHENMengli，etal.ProkaryoticExpression of Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirusGp4 Proteinand Preparation of Polyclonal Antibodies J OL].China Industrial Economics，2023：1-9. （2023-08-07） https：//kns. cnki. net/KCMS/detail/detail. aspx？filename Σ=Σ ZSJB20230804001amp;dbname τ=τ CJFDamp;dbcode τ=τ CJFQ.

[4］袁慶．豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP4蛋白單克隆抗體制備與抗原表位篩選［D]．哈爾濱：東北農業大學，2015.YUAN Qing.Preparation of monoclonal antibody to porcine repro-ductive and respiratory syndrome virus GP4 proteinandscreeningof antigenic epitopes[D]. Harbin：Northeast Agricultural Univer-sity，2015.

[5]Das P B， Dinh P X，Ansari I H， et al. The minor envelope gly-coproteins GP2a and GP4 of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus interact with the receptor CD163[J]. Journal ofVirology，2010，84（4）：1731-1740.

[6]Wissink EHJ，Kroese MV，van Wijk HAR，et al.Envelopeprotein requirements for the assembly of infectious virions of por-cinereproductiveand respiratory syndrome virus[J].Journal ofVirology，2005，79（19）： 12495-12506.

[7］陳旭，湯德元，曾智勇，等．豬繁殖與呼吸綜合征病毒結構蛋白和非結構蛋白研究進展［J]．動物醫學進展，2023，44（9）： 76-81.CHEN Xu， TANG Deyuan， ZENG Zhiyong，et al. Progress onstructural and nonstructural proteins of porcine reproductive andeespiratory syndrome virus[J]. Progress in Veterinary Medicine，2023，44（9） ： 76-81.

[8]王旭，王志，徐華，等．單個氨基酸取代改變HP-PRRSV 糖基化蛋白4的抗原性[J]．病毒學報，2016，13（1）：129.WANG Xu，WANG Zhi，XU Hua，et al. Single amino acid sub-stitutions alter the antigenicity of HP-PRRSVglycosylated pro-tein 4[J].Chinese Journal ofVirology，2016，13（1）：129.

[9］張娟，綦艷，嚴家俊，等．重組酶介導擴增技術在生物安全檢測中的應用研究[J]．中國釀造，2022，41（11）：14－19.ZHANG Juan，QI Yan，YAN Jiajun，et al.Aplication ofrecombinase-aid amplification technologyin biosafety detection[J]. China Breuing，2022，41（11）： 14-19.

[10]Wu T，Ge YY，Zhao K C，et al.A reverse-transcriptionrecombinase-aided amplification assay for the rapid detection ofN gene of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2（SARS-CoV-2）[J].Virology，2020，549：1-

[11]LiXY，WangCG，ZhangZS，etal.Fast detectionof duckcircovirus by real - time fluorescence -based recombinase -ai-ded amplification[J].Poultry Science，2022，101（3）：101707.

[12]Wu XH，LiuYJ，Gao LG，et al.Development and ap-plication of areverse-transcription recombinase-aided amplifi-cation assay for porcine epidemic diarrhea virus[J].Viruses，2022，14（3）：591.

[13]TuF，YangXT，XuSK，etal.Development ofafluorescentprobe-based real-time reverse transcription recombinase-ai-ded amplification assay for the rapid detection of classical swinefever virus[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2021，68（4）：2017 -2027.

[14］馬佳鎂，鐘植文，范悅軒，等．2株豬繁殖與呼吸綜合征病毒海南株的ORF5基因分析［J]．新疆農業科學，2023，60（12）：3049-3056.MA Jiamei， ZHONG Zhiwen，FAN Yuexuan，et al.ORF5 geneanalysis of two porcine reproductive and respiratory syndrome vi-russtrains from Hainan province[J]. Xinjiang Agricultural Sci-ences，2023，60（12）：3049-3056.

[15］曹宗喜，師志海，林哲敏，等．PRRSV的病毒蛋白研究進展[J]．廣東農業科學，2013，40（16）：134-137.CAO Zongxi，SHI Zhihai，LIN Zhemin，et al. Research progressonthe viral proteinsof PRRSV[J].Guangdong Agricultural Sci-ences，2013，40（16）：134-137.

[16］陳旭，湯德元，曾智勇，等．豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染對宿主細胞信號轉導通路影響的研究進展[J].中國預防獸醫學報，2023，45（6）：654-661.CHENXu，TANG Deyuan，ZENG Zhiyong，et al. Research pro-gress on the ffcts of porcine reproductive and respiratory syn-drome virus infection on signal transduction pathways in host cell[J]．Chinese Journal ofPreventive Veterinary Medicine，2023，45（6）： 654 -661.

[17］范悅軒，馬佳鎂，黃春媛，等．PRRSVHNHK3-2021毒株的ORF5和ORF7序列分析［J]．新疆農業科學，2024，61（5）：1292-1300.FAN Yuexuan，MA Jiamei，HUANG Chunyuan，et al. Sequenceanalysis of ORF3 and ORF5 of PRRSV HNHK3-2021 strain i-solated inHainan[J].XinjiangAgricultural Sciences，2024，61（5）：1292-1300.

[18］王方洲，孫普，張婧，等．美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光重組酶聚合酶擴增技術（RPA）檢測方法的建立及其應用［J]．病毒學報，2023，39（1）：161－173.WANG Fangzhou， SUN Pu， ZHANG Jing，et al.Developmentand application ofAreal-timeRPAmethod fordetection of A-merican genotype of porcine reproductive and respiratory syn-drome virus[J]. Chinese Journal of Virology，2023，39（1）：161 -173.

[19］孫鳳萍，高駿，劉成倩，等．豬繁殖與呼吸綜合征RT-LAMP檢測方法的建立和初步應用[J]．上海畜牧獸醫通訊，2018（1） ：2-5.SUN Fengping，GAO Jun，LIU Chengqian，et al. Establishmentand preliminary application of RT-LAMP assay for porcine re-productive and respiratory syndrome[J].Shanghai Journal ofAnimal Husbandryand VeterinaryMedicine，2018（1）：2-5.

[20］袁嘉康，李林岳，龐俊增，等．豬流行性腹瀉病毒RPA-LFD檢測方法的建立［J]．中國獸醫學報，2023，43（6）：1127 -113YUAN Jiakang，LI Linyue，PANG Junzeng，et al. Establishmentof RPA-LFD method for detection of porcine epidemic diarrheavirus[J]. Chinese Journal of Veterinary Science， 2O23，43（6） ：1127 -113

［21］岳懷寧，李艷蕊，張亞楠，等．非洲豬瘟病毒可視化重組酶輔助擴增檢測方法的建立與初步應用[J]．中國獸醫雜志，2023，59（5）：19-25.YUEHuaining，LI Yanrui，ZHANG Yanan，et al.Establish-ment and preliminary application of visual recombinase aided am-plification method for detection of African swine fever virus[J].Chinese JournalofVeterinaryMedicine，2023，59（5）：19-25.

[22］陳偉月，呂蕎，李玉瑩，等．豬圓環病毒4型實時熒光RAA 檢測方法的建立[J]．中國獸醫學報，2023，43（3）：442 - 447.CHEN Weiyue，LYU Qiao，LI Yuying，et al.Establishment of areal-time fluorescence RAA detection method forporcine circo-virustype4[J].ChineseJournal ofVeterinary Science，2023，43（3）：442-447.

[23］陳素貞，馬佳鎂，黃春媛，等．基于豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF2a基因的RT-RAA-LF檢測方法的建立［J]．中國獸醫科學，2023，53（10）：1249-1253.CHENSuzhen，MA Jiamei，HUANG Chunyuan，et al.Develop-ment ofRT-RAA-LF assay to detect PRRSV based on ORF2agene[J].Chinese Veterinary Science，2023，53（10）：1249-1253.

Establishment and application of a fluorescent assay for reverse transcription recombinase - mediated isothermal amplification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

ZHANG Ziwei1，2，HUANG Chunyuan2，YU Na^1，3 ，ZHENG Jiaxin2， ZHANG Yan2，LIU Guangliang12，CAO Zongxi1，2，3.4

College of Animal Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830ooo， China; Key Laboratory of Tropical Animal Breeding and Epidemic Disease Research / Haikou Observation Experimental Station of National Data Center of Animal Health，Hainan Province/Institute of Animal Husbandryand Veterinary Medicine，Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 5711OO， China; 3. Tarim Animal Epidemic Disease Diagnostic and Prevention and Control Engineeing Laboratory of Xinjiang Production and Construction Corps， Faculty of Animal Science and Technology， Tarim University，Aral Xinjiang 8433Oo，China; Samya Research Institute， Hainan Academy of Agricultural Sciences （Hainan Research Centre of Laboratory Animal），Sanya Hainan 572000，China）

Abstract：【Objective】 There is a need for the development of a clinically rapid，simple，and accurate method for the detection of PRRSV.【Methods】 This study aims to establish a method based on reverse transcription recombinase -mediated isothermal amplification fluorescence detection of PRRSV. The method was developed by designing specific primers and probes against the PRRSV ORF4 gene sequence. 【Results】 The fluorescent RT-RAA assay could be amplified with primers and probes at 41% for 20min ，and the results could be observed in real time bya fluorescence quantitative PCR instrument. The method had high sensitivity and strong specificity，and no cross-reactivitywith other porcine pathogens.【Conclusion】The fluorescent RT- RAA and PCR used to test 18O samples showed the compliance rate between the two methods was 98.3% （20

Key Words：porcine reproductive and respiratory syndrome virus； ORF4； RAA;rapid detection