高粱抗蚜反應中糖代謝途徑基因的表達模式分析

中圖分類號：S514 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）05-1242-07

0 引言

【研究意義】高梁（Sorghumbicolor（L.）Moench）是重要的糧食作物，也是飼用、工業(yè)和能源開發(fā)的重要原料。高梁對高溫、低溫、干旱、洪澇和鹽堿等不利條件具有獨特的抗性，因此，相較于其他主要糧食作物，高梁適合種植的區(qū)域更為廣泛[1-3]。高梁蚜（Melanaphis sacchari）是威脅我國高粱產(chǎn)區(qū)的主要害蟲之一，高梁上附著大量的蚜蟲為害其生長和結(jié)實，造成減產(chǎn)[4.5]。糖代謝是植物體內(nèi)能量供應的重要途徑，在植物的生長發(fā)育和抵御逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[。高粱在有效防御蚜蟲脅迫的同時，維持較為穩(wěn)定的糖代謝水平，將對保證植株逆境條件下的正常生長具有重要意義。【前人研究進展】初生代謝是生物共有的代謝途徑，底物經(jīng)三大代謝途徑即糖酵解、檸檬酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑，最終氧化生成糖類、脂類、蛋白質(zhì)和核酸等[7]。糖代謝是幾類生物代謝途徑的中心環(huán)節(jié)，當植物受到逆境脅迫時，正常的糖代謝途徑就被打亂，從而引起代謝失衡。細胞壁是植物應對外界逆境脅迫的第一道防線，其成分中 90% 為多糖[8]。可溶性糖作為細胞內(nèi)重要的信號分子，在植物應對逆境脅迫時也發(fā)揮著非常重要的作用[9，10]。研究發(fā)現(xiàn)，煙草（Nicotianatabacum）植株葉片中較低濃度的葡萄糖和果糖會導致玉帶天蛾（Manducasexta）數(shù)量的增加，而茉莉酸依賴性的糖消耗會使得植株更易遭受玉帶天蛾取食[1]。玉米（Zea mays）接種玉蜀黍黑粉菌（Ustilagomaydis）6h后，體內(nèi)大量與病原體觸發(fā)免疫（PTI）機制相關(guān)的多糖或鞭毛蛋白基因被顯著誘導，隨后導致糖代謝、糖酵解/糖異生和抗性基因表達，說明糖轉(zhuǎn)運在玉米對玉蜀黍黑粉菌的抗病反應中發(fā)揮著重要作用[12]。利用高通量RNA 測序技術(shù)對水稻（Oryzasativa）抗性BPH15滲入系和敏感受體植物進行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，糖代謝途徑差異表達基因（DEGs）在敏感植物中顯著下調(diào)，但在抗性植物中只有低幅度的變化，表明在敏感植物中褐飛虱（Nilaparvatalugens，BPH）取食抑制了糖代謝途徑相關(guān)基因的表達[13]。【本研究切入點】RMES1是從高粱抗蚜品種HN16中新分離出來的抗蚜基因[14]，其是否通過調(diào)控糖代謝基因的表達變化來參與高梁抗蚜，目前尚不清晰。需在揭示HN16通過調(diào)節(jié)糖代謝基因表達參與高梁抗蚜的作用機制。【擬解決的關(guān)鍵問題】以HN16和感蚜突變體asm1作為材料，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選2材料在蚜蟲取食過程中的糖代謝途徑DEGs，并選取部分基因?qū)ρ料x取食過程中基因的表達模式進行分析，為防治高粱蚜及高粱抗蟲育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇高粱抗蚜品種HN16（野生型WT，包含抗蚜基因RMES1）和感蚜突變體asm1（RMES1基因突變）作為材料，在花盆中種植，待植株長至2葉1心期進行接蚜處理。平均每株幼苗接蚜10只，接蚜0、24、48、72和 96h 后，剪取葉片進行RNA提取及基因的表達模式分析。植物培養(yǎng)條件為 16h 光照， ^8h 黑暗，溫度范圍為 28～30^°C ，相對濕度 60% ，所有試驗均在光照培養(yǎng)箱中進行。

1. 2 方法

1.2.1 RNA提取

采用TransZol試劑（transgen）進行總RNA的提取。稱取 0.1g 高粱葉片，利用組織研磨儀充分研磨后，加入 1mL TransZolUP，充分震蕩混勻，室溫靜置 5min 。加人 200μL 預冷的RNAExtractionAgent，充分振蕩 15s ，室溫孵育 3min 后，離心 15min 。吸取水相層，再加入 500μL 異丙醇，混勻，室溫孵育 10min 后，離心 10min 。去上清。加人 75% （ σ_V/σ_V ）乙醇（DEPC水配制）1mL ，充分震蕩，對RNA進行洗滌提純，重復2次，離心后棄上清，倒置晾干，加入適量RNA溶解液溶解。

1.2. 2 cDNA的合成及質(zhì)量檢測

以提取的RNA樣品為模板，使用TransScriptOne - Step gDNA Removal and cdna Synthesis Su-perMix試劑盒（transgen），在同一反應體系中，進行cDNA的合成和 gDNA 的去除，反應體系總體積為 20μL 。反應條件為： 65°C，5min ，冰浴2min ; 42% ， 30min ： 85°C ，5s，反轉(zhuǎn)的總體系為20μL 。反轉(zhuǎn)完成后產(chǎn)物保存至 -20% 備用。表1

以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用內(nèi)參基因sbActin的特異性引物進行PCR擴增，擴增得到的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

Tab.1 Thesystemofreverse transcription

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3. 1 基因篩選及熱圖

利用實驗室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[15]，篩選蚜蟲取食過程中HN16和asm1間0、24和 ^48h 差異表達的糖代謝途徑基因，篩選條件為顯著性水平（Padjust lt;0.05 ），上下調(diào)差異倍數(shù)（ FC? 2和 FC?0.5 ），以WT為對照組，asm1為試驗組，并將這些基因數(shù)據(jù)整理后利用在線繪圖工具Chiplot（https：//www.chiplot. online/# Heatmap ）繪制表達模式熱圖。

1.3.2 引物查找與驗證

利用qPCR數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https：//biodb.swu.edu.cn/qprimerdb）查找相應引物，利用PCR驗證大小符合預期，且條帶特異的引物，通過熒光定量PCR篩選出溶解曲線為單峰，且CT值良好的引物用于下一步試驗。

1.3.3 實時熒光定量PCR

使用的儀器為AppliedBiosystems7500型熒光定量PCR儀，采用TBGreenPremixExTaqI（TliRNaseHPlus）試劑盒（Takara）對基因的表達量進行驗證。熒光定量PCR體系為：TBGreenI 5μL 、正反向引物 0.5μL?CDNA2μL?ddH₂O 補足至 10μL 。反應條件：采用兩步法擴增，共40個循環(huán)。反應程序為： 95^°C 30s .95^°C 5s 60^°C 34s，95^°C15s，60^°C1min，95^°C15s 。以Sbactin作為內(nèi)參，以 ΔWT0h 作為對照，利用 2^-ΔΔCT 的方法分析基因的表達量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖代謝途徑差異表達基因（DEGs）的篩選研究表明，篩選蚜蟲取食0、24和 ^48h ，HN16和asm1中糖代謝途徑的DEGs，共篩選出17個相關(guān)基因，其編碼產(chǎn)物包括半乳糖醇合酶，木聚糖-∝- 葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶，半乳糖醛糖基轉(zhuǎn)移酶， ∝ -L-巖藻糖苷酶，蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶，葡聚糖內(nèi)切-1，3-葡糖苷酶，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶蛋白，酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切葡聚糖酶。表2

表2 糖代謝相關(guān)基因信息

Tab.2 Genetic information related toglucosemetabolism

與蚜蟲未取食（ 階段相比，蚜蟲取食24和 ^48h 后，在HN16和asm1中基因sbGATL1、sb-FUCO1、sbXTH27、sbGUAA2和sbBGL22的表達呈下調(diào)趨勢，其余基因的表達均呈上調(diào)趨勢。蚜蟲的取食改變了HN16和asm1中糖代謝途徑基因的表達。圖1

圖1 糖代謝途徑相關(guān)基因的表達量 Fig.1Expression analysis of genes related to glucose metabolism pathway

注（Notes）：H：HN16；B：asml

2.2 糖代謝途徑DEGs的表達量驗證

2. 2.1 RNA及cDNA質(zhì)量檢測

研究表明，將HN16和asm1進行接蚜處理0、24、48、72和 96h 后，收集葉片提取總RNA。將提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA的28S、18S和5S條帶完整，無降解。將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以合成的cDNA作為模板，利用sbActin擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳，擴展條帶清晰明亮，cDNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗。圖2

圖2RNA（A）和cDNA（B）的質(zhì)量檢測 Fig.2 QualitydetectionofRNAandcDNA

2.2.2 基因的引物設計及驗證

研究表明，共獲得12對引物，擴增條帶單一，特異性較佳，且利用DNA和cDNA作為模板的擴增大小均符合預期，即 、sbGATL9、sbXTH30、sbXTH27、sbGUX2、sbE1314、sbB-GL22、sbISOA3sbGUAA2、sbCHLA。圖3

篩選出6個基因的6對引物，擴增的溶解曲線單峰，并且具有良好的CT值。表2～3

圖3 引物驗證的凝膠電泳 Fig. 3 Gel electrophoresis image ofprimervalidation

2.2.3 糖代謝途徑基因的表達量驗證

研究表明，6個基因的表達量變化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本吻合。其中，基因sbGOLS2和sbCHIT3，在HN16中，當葉片被蚜蟲取食后基因的表達量在短時間內(nèi)（ 24h） ）急劇上升，隨后下降，基因 sb BGL22在蚜蟲取食 24～72h ，表達量持續(xù)上升，后期趨于穩(wěn)定；而在asm1中，在蚜蟲取食過程中3個基因的表達則持續(xù)上升，且在蚜蟲取食后期（72～96h ）基因的表達顯著高于HN16。3個基因在HN16抗蟲過程中通過快速反應來抵抗昆蟲，而在感蚜突變體asm1中則持續(xù)反應，造成了自身能量的消耗，導致植株的死亡。

基因sbGUAA2、sbGUX2和sbISOA3，蚜蟲的取食會促進HN16中基因表達量的升高，且總體變化幅度較小，而在asm1中隨著蚜蟲的取食，3個基因的表達量均顯著下降，且在蚜蟲取食過程HN16中的表達量大多高于asm1，蚜蟲的取食會促進這3個基因在HN16中的表達，并抑制其在asm1中的表達。可見，在遭遇蚜蟲后，在HN16中3個基因可以較為穩(wěn)定的維持自身的表達，從而保證高梁初生代謝的穩(wěn)定性，而在感蚜突變體asm1中，則無法保證這幾個基因的正常表達，3個基因在HN16的抗蟲反應中，維持正常糖代謝水平上發(fā)揮了較大作用。圖4

表3 引物序列信息

Tab.3 Primerssequenceinformation

注（Notes）：A：sbGOLS2；B：sbCHIT3；C：sbBGL22；D：sbGUAA2；E：sbGUX2；F：sbISOA3

圖4糖代謝相關(guān)基因的表達模式分析

Fig.4Analysis of expression patterns of genes related to glucose metabolism

3討論

3.1高粱是世界范圍內(nèi)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物[16]。糖代謝是生物代謝途徑的中心環(huán)節(jié)，當植物受到病毒、病原體、昆蟲等生物脅迫時，體內(nèi)正常的糖代謝途徑會被打亂，引起代謝失衡，最終影響植物的生長和發(fā)育[17]。研究發(fā)現(xiàn)，病毒等生物脅迫可直接導致植物體內(nèi)糖類積累減少，生長發(fā)育減緩。木薯（Manihotesculenta）普通花葉病毒（Cottonleafworm，CsCMV）感染引起木薯源葉中淀粉和麥芽糖含量降低，蔗糖與淀粉比例顯著增加 24.7% ），導致木薯塊莖產(chǎn)量降低[18]。綠色桃蚜（Myzuspersicae，GPA）侵染擬南芥（Arabi-dopsisthaliana）后，野生型植物的局部和全身葉片中果糖、半乳糖和葡萄糖均被高度下調(diào)；然而，在谷氨酸受體GLR3.3和GLR3.6的glr3.3和glr3.6突變體中，這些糖在局部葉片中類似地下調(diào)，而在系統(tǒng)葉片中，果糖和半乳糖上調(diào)，葡萄糖僅輕微下調(diào)；而蔗糖在野生型植物感染的局部和系統(tǒng)葉片中適度增加，在敲除GLR3.3和GLR3.6植株葉片中蔗糖含量高度升高。可見，谷氨酸受體GLR3.3和GLR3.6通過調(diào)節(jié)糖代謝介導擬南芥對昆蟲的系統(tǒng)抗性[19]。

3.2王雪[20]在研究大豆胞囊線蟲（Heteroderaglycines，SCN）對大豆（Glycinemax）的影響時發(fā)現(xiàn)，抗性品種接種后根內(nèi)可溶性糖的含量大大提高，且無論是否接種，抗性品種根內(nèi)可溶性糖含量均高于感病品種，表明較高的糖含量有利于抵御胞囊線蟲的入侵。研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選高梁抗蚜品種HN16和感蚜突變體（asm1）在蚜蟲取食過程中的糖代謝途徑DEGs，共篩選到17個基因，說明蚜蟲的取食改變了HN16和asm1中糖代謝途徑基因的表達。這些基因在HN16的抗蟲反應中作用有所不同，其中基因sbGOLS2、sb-CHIT3和sbBGL22通過快速反應來抵抗昆蟲，避免消耗過多的能量；而sbGUAA2、sbGUX2和sbI-SOA3，在蚜蟲取食過程中通過維持較為穩(wěn)定的表達，保證高梁糖代謝的穩(wěn)定性。水稻對BPH的防御反應中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，BPH取食過程中，糖代謝途徑DEGs在敏感植物中顯著下調(diào)，但在抗性BPH15滲入系中只有低幅度的變化，表明抗性植物在BPH的取食過程中維持了糖代謝基因較為穩(wěn)定的表達[13]。后續(xù)研究中，可進一步檢測蚜蟲取食過程中HN16和asm1體內(nèi)可溶性糖類的變化，揭示HN16通過調(diào)節(jié)糖代謝途徑參與高粱抗蚜中的作用機制。

4結(jié)論

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選蚜蟲取食過程中，HN16和asm1中糖代謝途徑的DEGs，共篩選出17個相關(guān)基因，蚜蟲取食改變了HN16和asm1中糖代謝途徑基因的表達。基因sbGOLS2、sbCHIT3和sbBGL22，通過快速反應來抵抗昆蟲，而基因sb-GUAA2sbGUX2和sbISOA3，在蚜蟲取食過程中在HN16中始終維持較為穩(wěn)定的表達。蚜蟲取食過程中，HN16通過調(diào)節(jié)糖代謝途徑基因的表達，維持體內(nèi)較為穩(wěn)定的糖代謝水平，以抵御蚜蟲的為害。

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Analysis of expression patterns of glycometabolic pathway genes in sorghum anti - aphid response

HAO Le，LIU Yuan，HAN Ruxue，WANG Zhenjie，SHAO Yutao （School of Life Science and Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou Inner Mongolia 014010，China）

Abstract：【Objective】 Analysis of expression patterns of glycometabolic pathway genes in sorghum anti - aphid response.【Methods】The aphid resistant variety HN16 and its sensitive aphid mutantasml were used as research materials and the transcriptomic database of sorghum was used to screen the diferentially expressed genes （DEGs）of the two materials in the feeding process of aphids.In the end，a total of 17 genes were screened. These results suggested that feeding by aphids changed the expression of glycometabolic pathway genes in HN16 and asml. Six pairs of specific primers of six genes （sbGOLS2，sbGUX2，sbCHIT3，sbBGL22， sbISOA3） were selected by PCR and qPCR for gene expression verification and analysis.【Results】 The results showed that the expression patterns of these 6 genes were basically consistent with the transcriptome data，and they played different roles in the anti -insect response of HN16.Among them，the genessGOLS2，sbCHIT3 andsbBGL22 were resistant to insects through rapid response to avoid excesive energy consumption. sbGUAA2， sbGUX2 andsbISOA3 ensured the stability of glycometabolic metabolism of sorghum by maintaining relatively stable expression during aphid feeding.【Conclusion】 In summary，during the feeding process of aphids， HN16 maintains a relatively stable glycometabolic metabolism level by regulating the expresion of glycometabolic metabolism pathway genes to resist the harm of aphids.

Key words：sorghum；sorghum aphid;insect resistance;glycometabolism