蘿卜種質資源抗根腫病鑒定及QTL-seq定位

中圖分類號：S631.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）08-037-08

Identification of clubroot resistance in radish germplasm resources and QTL-seq mapping

DANG Zengqing， QIAO Huifang （KaifengProductQualityInspectionandTestingCenter，Kaifeng475o4，Henan，China）

Abstract：Clubrootdisease，causedbyPlasmodiophorabraicaeWoronin，isagloballydistributedsoil-boredisease thatseriouslythreatens thesustainabledevelopmentof the Brassicavegetable production.Toclarifytheresistance levels ofradish germplasmresources and identify resistance loci，this studysystematicall evaluated the clubroot resistanceof 40radishvarieties trough integrated fieldnatural infectionandseedling-stageartificialinoculation methods.Segregating populations constructed from resistant and susceptible parents were subjected to QTL-seq-based mapping analysis.The resultsdemonstrated thatonelocalvarietyandfour hybridsexhibitedimmunity（I），onelocalvarietyand thre hybrids showed high resistance（HR），and threelocal varietiesshowed disease resistance（R）.QTL-seq analysis identified fouresistance-associatedQTLsonchromosomes1，2，and5，withthemajor-effectlocusrs2.1locatedonchromosome2.This research sucessullyscreens multiple elite resistance sources and maps clubroot resistance loci inradish，providing crucial scientific foundations for disease-resistant breeding and gene cloning.

Key Words： Radish; Clubroot disease; Identification; QTL-seq mapping; Disease-resistant breeding

蘿卜（RaphanussativusL.）是我國重要的十字花科根菜類蔬菜，具有較高的營養價值和經濟價值，常年種植面積約120萬 hm^2[1-2] 。根腫病作為一種由蕓薹根腫菌（Plasmodiophorabrassicae）引起的土傳病害，廣泛分布于全球，主要危害蘿卜、白菜、甘藍、油菜等十字花科作物。隨著蔬菜種植面積的不斷擴大和連作年限的增加，根腫病的發生呈逐年加重趨勢，常年危害面積320萬～400萬 hm² ，產量損失 20%～30%^[3] ，已成為制約蘿卜等十字花科蔬菜產業發展的重要因素之一。蘿卜受到根腫病菌侵染后，植株生長緩慢，根部畸形腫大，口感和營養變差，產量、品質及商品價值受到嚴重影響。且該病原菌生命力頑強，可在土壤中存活多年，傳播迅速，防治難度極大[45]。因此，篩選并選育抗病品種是最經濟也是最安全的防治根腫病的方法。

鑒定蘿卜對根腫病的抗性水平、篩選高抗資源，對蘿卜抗病品種的選育與推廣意義重大。研究表明，蘿卜抗根腫病種質資源主要來自歐洲及亞洲的日本和韓國，中國地方品種普遍感病[7-8]。Yang等鑒定了349份蘿卜資源，篩選出3份免疫、5份高抗資源，其中 85.06% 的中國資源感病，而國外資源多抗病。Wang等]鑒定了95份資源，其中27份免疫，6份高抗， 82.50% 的中國資源感病， 49.0% 日本和韓國資源感病。孟玥1鑒定的55份資源中，6份表現為免疫。冉劍釗等從54份蘿卜資源中鑒定出2份免疫材料，5份抗病材料。甘彩霞等[3在湖北長陽對蘿卜根腫病進行抗性鑒定，從100份資源中篩選出抗病資源13份。

蘿卜抗原豐富，且存在免疫級別材料，但其遺傳機制研究報道較少。Kamei等[4利用 F_2：3 家系進行QTL定位，在1號連鎖群頂端區域鑒定到抗病位點Crs1，認為蘿卜抗根腫病是受單基因或緊密連鎖基因控制，也可能存在微效位點。Akaba等[15通過油菜蘿卜單體附加系對根腫病抗性進行評估，表明抗病基因存在于蘿卜的1條染色體上，不排除微效基因的影響。池鵬[利用BSA-seq方法將抗病基因定位在5號染色體 39～45Mb 物理區間內；Gan等[17]定位到5個相關QTL，位于8號和9號染色體，最高貢獻率為 31.38% 。最新研究發現，蘿卜抗病自交系GLX的抗性由顯性單基因RsCr6控制，通過BSA-seq精細定位在8號染色體 92Kb 區間（標記HB321-HB331），并結合轉錄組分析篩選出R120263140和R120263070作為候選基因[18]。根腫菌的生理小種分化現象極為普遍，種植僅依賴單一抗原的蘿卜品種面臨著較高的抗性喪失風險[19]。因此，針對更為豐富的蘿卜種質資源開展根腫病抗性鑒定工作，挖掘不同的抗病基因，進而培育出抗多個生理小種的蘿卜品種，不僅具有理論研究價值，而且在農業生產實踐中更具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1材料

根腫菌腫根采自河南省南陽市新野縣，經Williams鑒別系統鑒定為4號生理小種[20，清洗干凈后保存于 -20^°C 冰箱冷凍備用。田間抗性鑒定在新野縣開展。供試材料為市場上收集的40個蘿卜品種，其中地方品種31份，雜交種9份。

選取免疫材料北京紅丁蘿卜作為母本 （P₁） 和高感材料鄭研791作為父本 （P₂） 進行雜交獲得 F₁，F₁ 自交后獲得 F₂ 分離群體。

1.2 方法

1.2.1田間鑒定試驗于2023 年8—11月在河南省南陽市新野縣城郊鄉進行。所有試驗材料均于2023年8月20日播種，播種前噴灑防治地下害蟲藥劑高效氯氰菊酯（每 667m² 用量 50g ，對水20kg） ，施腐熟有機肥 125kg?667m^-2 和復合肥100kg?667m^-2 作為底肥。采用覆膜露地栽培方式，采用一膜2行的點播模式，株行距為 20cm× 20cm 。每穴播2～3粒，每份材料播種30穴，3次重復， F₂ 分離群體單粒播種，采用隨機區組設計。在生長過程中施肥2次，試驗期間僅防蟲不防病，噴施防蟲藥2次，其他田間管理依照常規操作進行。2023年11月5日調查發病狀況。

1.2.2 苗期人工鑒定 在苗期采用傷根灌菌法進行鑒定[2]。接種菌液制備：提前3d從 -20^°C 冰箱中取出腫根，室溫下自然腐爛以活化根腫菌。將腐爛的腫根置入組織絞碎機中，按體積比1：3加入蒸餾水絞制勻漿，先通過4層紗布過濾，再經8層紗布二次過濾。使用血球計數板測定懸浮休眠孢子液的濃度，用蒸餾水調整至 3×10⁸ 個 ?mL^-1 。接種方法：把基質裝入營養缽，澆足底水并排列在托盤上。將飽滿的種子置于墊有濕潤濾紙的培養血中，25^°C 催芽。待胚根長至 5mm 時，播于營養缽中央，并用移液器在種子周圍注射 2mL 休眠孢子液，覆土。當幼苗長至2～3片真葉時，接種 5mL 孢子液，1周后再次接種 5mL 孢子液。澆水時可用磷酸鹽緩沖溶液將自來水pH調至6.0，少量多次進行。光照時長為 16h/8h （晝/夜），溫度為 25^°C/20^°C （晝/夜）。重復鑒定2次，每次鑒定10株。末次接種5周后進行鑒定。

1.2.3抗病性評價標準田間根腫病病情分級與抗病指數計算、苗期人工接種鑒定分級標準均采用甘彩霞等[1322的方法。田間鑒定30株，3次重復；苗期鑒定10株，2次重復。病情指數 ?DI?=Σ （發病級代表值 × 各級病株數）/（調查總株數 × 最高發病級代表值） ×100 。寄主抗性等級劃分為：免疫（I）， DI= 0；高抗（HR）， 080 。

1.2.4QTL-seq定位分析對376株 F₂ 群體進行苗期人工接種鑒定，從群體中挑選40株免疫單株構建抗病混池，選取單株幼嫩葉片，利用取樣器等量混合。親本單株取2～3片幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取基因組DNA。使用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，確保其達到試驗要求。將符合要求的DNA樣品委托北京諾禾致源科技股份有限公司，利用IIlumina測序技術平臺對親本及混池進行雙端測序。

采用QTL-seq技術[23]開展全基因組測序分析。使用BWA（v2.2.1）軟件將Cleanreads比對到參考基因組 CCHX^[24] ，并使用GATK （v4.3.0.0）+ SAM-tools（v1.20）流程對親本與混池進行SNP檢測。為降低測序和比對誤差，去除子代池中SNP-index小于0.3的位點。以1Mb為窗口、 .500kb 為步長，計算窗口內SNP-index的均值，并繪制滑窗曲線圖。根據 95% 和 99% 的置信區間對計算結果進行分析，篩選候選QTL位點區域。

2 結果與分析

2.1地方品種鑒定結果分析

依據田間鑒定抗病性評價標準，在參試的31份地方品種中，1份材料表現為免疫，13份材料高抗，12份材料抗病，5份材料中抗。苗期鑒定結果顯示，免疫材料1份，高抗材料1份，抗病材料3份，中抗材料8份，感病材料11份，高感材料7份。田間鑒定病情指數平均值為27.4，苗期鑒定病情指數平均值為66.2，表明田間鑒定發病程度要比苗期鑒定發病程度輕（表1）。

綜合田間鑒定和苗期鑒定結果，共篩選到對根腫病免疫的地方品種1份，即北京紅丁蘿卜；高抗地方品種1份，即重慶紅蘿卜；抗病地方品種3份，分別為北京心里美蘿卜、河南襄縣牛腿蘿卜和云南四季蘿卜。

參試的河南地方品種共15份，占比 48.38% ，田間鑒定病情指數和苗期鑒定病情指數平均值分別為33.2和70.0，均高于全國地方品種鑒定的平均病情指數。以上結果表明，河南地方品種存在感染根腫病的風險，甚至部分品種表現高感。

表1地方品種抗性鑒定結果

Table1Resultsofresistanceidentificationoflocalvarieties

表1 （續）

2.2 雜交品種鑒定結果分析

依據田間鑒定抗病性評價標準，對9份蘿卜雜交品種進行鑒定。其中，6份材料表現免疫，3份材料表現為高抗。苗期鑒定結果表明，4份材料免疫，3份材料高抗，1份材料感病，1份材料高感。田間鑒定病情指數平均值為3.3，苗期鑒定病情指數平均值為21.2，由此可見，田間鑒定發病程度要輕于苗期鑒定（表2）。綜合田間和苗期鑒定結果，最終篩選出對根腫病免疫的雜交品種4份，分別為春長白、白玉春、新白玉和山田大根；高抗材料3份，分別為櫻島大根、夏白玉和NBZ。

表2雜交品種抗性鑒定結果

Table2Resultsofresistanceidentificationofhybridvarieties

2.3性狀統計及混池測序

為探究根腫病抗性遺傳規律，筆者以地方品種鑒定中免疫材料紅丁蘿卜和高感材料鄭研791為親本構建F群體。采用苗期人工接種法對376株 F₂ 單株開展抗病性鑒定，結果顯示，抗病單株294株，感病單株82株，分離比為2.93：1。經卡方檢驗，該分離比符合3：1的孟德爾單基因遺傳理論比值，表明紅丁蘿卜的抗根腫病性狀受一對顯性主效基因控制。

進一步選取40株感病單株提取DNA，進行極端混池測序。測序數據總量共 32.13Gb ，親本平均測序深度為 11.2X ，極端池平均測序深度為 41.7X ，基因組覆蓋度 （?1 個堿基覆蓋）為 83.21% ，測序質量滿足后續分析要求。經檢測和一系列過濾后，總共獲得8917981個SNP位點，用于后續QTL-seq分析。

2.4 QTL位點的檢測

根據QTL-seq方法，計算獲得SNP-index值。

以 1Mb 為滑動窗口， 500kb 為步長進行作圖，并設定 99% （黃線）和 95% （綠線）的置信水平作為篩選閾值條件。從圖1、表3可以看出，共4個區域超過95% 閾值線，分別是位于1號染色體的rs1.1，2號染色體的rs2.1和 rs2.2 ，以及5號染色體的rs5.1。其中， rs2.1 的部分區域超過了 99% 閾值線，這些區域分別位于 6.5～10.0Mb 以及 11.0～17.5Mb 兩個區間，其中第2個區間SNP-index值更高，由此推測該區域可能是抗根腫病的主效位點。

3 討論與結論

根腫病是全球十字花科作物生產的主要威脅，其致病菌蕓臺根腫菌具有變異速度快、生理小種分化程度高等特點，選育具有廣譜抗性的品種是防治根腫病最為經濟有效的措施[13]。目前，白菜、甘藍等十字花科作物的根腫病抗性研究已取得顯著進展，克隆了CRa、CRb等主效抗性基因[25]。然而，蘿卜作為重要根菜類蔬菜，其抗根腫病基因資源的挖掘和分子機制研究仍相對滯后。筆者在本研究中系統開展了40份蘿卜種質資源的根腫病抗性鑒定，篩選獲得5份免疫材料，并利用QTL-seq技術，在蘿卜1號、2號和5號染色體上定位到抗根腫病QTL位點。該研究成果為蘿卜抗根腫病分子育種提供了關鍵種質資源與理論依據。

圖1蘿卜抗根腫病相關QTL位點的SNP-index分布圖 Fig.1 SNP-indexdistribution forclubrootresistance-relatedQTLloci inradish

注：藍色的點代表計算出來的SNP-index 值，紅線為擬合后的SNP-index平均值。黃線和綠線分別代表置信度為0.99和0.95的閾值線。 Note：BluedotsrepresenttheaulatedN-inexvues，andteedlineindicatstfitedmeanSN-ndexvs.Theyellowadee linesdenote threshold linesat confidencelevels of0.99 and 0.95，respectively.

表3抗根腫病QTL位點信息 Table3SummaryofQTLsdetected forclubrootresistant

筆者對31份地方蘿卜種質開展根腫病抗性鑒定，結果顯示，多數地方品種呈現不同程度感病，但仍篩選到具有優異抗性的種質資源。其中，北京紅丁蘿卜表現為免疫，重慶紅蘿卜表現為高抗，北京心里美蘿卜、襄縣牛腿蘿卜及云南四季蘿卜表現為抗病。值得注意的是，前人研究中北京心里美蘿卜呈感病特性[9-10，12]，這可能是根腫菌生理小種分化，或鑒定材料來源不同所致。上述發現為地方品種抗病資源篩選提供了重要依據。針對9份雜交蘿卜品種的抗性鑒定表明，4份材料表現為免疫，3份材料表現為高抗。相較于地方品種，雜交品種的田間及苗期鑒定病情指數均值更低，凸顯其在根腫病抗性方面的優勢。其中，春長白、白玉春、新白玉和山田大根免疫品種的篩選，為后續抗病育種與品種推廣奠定了堅實基礎，該結果與前人關于蘿卜抗根腫病種質資源主要來自歐洲及亞洲的日本和韓國，中國地方蘿卜品種普遍感病的結論相符[12-13]。筆者采用田間成株期調查和苗期人工接種鑒定相結合的方法，綜合評估材料抗性。結果顯示，田間鑒定病情指數總體低于苗期鑒定，部分材料在苗期鑒定表現為抗病或中抗，但在田間鑒定呈現高抗甚至免疫特性，推測與田間病圃的菌群濃度分布不均有關。盡管存在上述差異，苗期和田間鑒定結果總體一致，與甘彩霞等[13]、胡燕等[2的研究結論相符。因此，在根腫病抗性篩選時，可將田間鑒定作為初步篩選手段，對表現為免疫或高抗的材料，需通過苗期人工接種重復鑒定，以確保結果的準確性。

目前，蘿卜根腫病抗性的遺傳機制解析及抗性基因克隆研究仍相對滯后。多數學者認為其抗性主要由一對顯性主效基因調控，目前已定位Crs1[14]和RsCr6[8兩個主效基因位點。Gan等提出了不同觀點，認為蘿卜根腫病抗性受隱性多基因控制，并定位到5個QTLs，這種結論差異可能源于研究選用的抗原材料不同。本研究表明，北京紅丁蘿卜的抗根腫病性狀屬于核遺傳，受一對顯性主效基因控制，同時受微效基因影響，該結果與前人的研究基本一致。此外，筆者以免疫材料紅丁蘿卜和高感材料鄭研791構建分離群體，并利用QTL-seq技術進行基因定位，獲得4個候選位點。其中，2號染色體的rs2.1為主效位點，其部分區域超過 99% 置信水平閾值線，在 11.0～17.5Mb 區間的SNP-index值最高。這一結果與前人在1號、5號、8號和9號染色體鑒定到的抗病位點不同[15-17]，推測 rs2.1 位點可能是一個全新的抗根腫病關鍵位點，這為蘿卜抗病育種提供了新的基因資源。該差異進一步印證了蘿卜抗根腫病遺傳機制的復雜性，亟待更深入地研究。

綜上所述，筆者通過系統開展蘿卜種質資源的抗根腫病鑒定與QTL-seq定位分析，明確了蘿卜抗性種質資源的分布特征，篩選出優異抗病資源5份，包括北京紅丁蘿卜、春長白、白玉春、新白玉和山田大根；定位到以rs2.1為主效位點的抗病相關區域。研究結果深入揭示了蘿卜抗根腫病的遺傳規律，為蘿卜抗病分子育種提供了重要的理論依據和基因儲備。

參考文獻

[1] 包崇來，汪精磊，胡天華，等.我國蘿卜產業發展現狀與育種方向探討[J].浙江農業科學，2019，60（5）：707-710.

[2] 胡海嬌，汪精磊，胡天華，等.“十三五\"我國蘿卜遺傳育種研究進展[J].中國蔬菜，2022（10）：20-26.

[3] 王靖，黃云，李小蘭，等.十字花科根腫病研究進展[J].植物保護，2011，37（6）：153-158.

[4] 司軍，李成瓊，任雪松，等.十字花科植物根腫病及抗根腫病育種研究進展[J].西南農業學報，2002，15（2）：69-72.

[5] 章藝，馬新焱，余紅瑞，等.十字花科作物根腫病綜合防治研究進展[J].中國蔬菜，2022（10）：27-37.

[6] HOWARDRJ，STRELKOVSE，HARDINGMW.Clubrootofcruciferous crops-new perspectives on an old disease [J].Cana-dianJournal ofPlantPathology，2010，32（1）：43-57.

[7] RANDALLRC.Evaluationofradishcultivarsforresistancetoclubroot（Plasmodiophora brassicae）race6formidwesternUSA[J].PlantDisease，1980，64（5）：462-464.

[8] ASHIZAWAM，YOSHIKAWAH，HIDAK，etal.Studiesonthebreedingofclubroot resistancein cole crops[J].BulletinoftheVegetable and Ornamental CropsResearch Station：SeriesA，1978，4：1-25.

[9] YANGHH，YUANYX，WEIXC，etal.Anewidentificationmethod reveals the resistance of an extensive-source radish col-lection to Plasmodiophora brassicae race 4[J].Agronomy，2021，11（4）：792.

[10]WANGQB，WANGYP，QIAN HH，et al.Evaluation of germ-plasm and development of markers for resistance to Plasmodi-ophorabrassicae in radish（RaphanussativusL.）[J].Agrono-my，2022，12（3）：554.

[11] 孟玥.蘿卜種質根腫病抗性鑒定初步研究[D].南京：南京農業大學，2020.

[12]冉劍釗，孔垂豹，雍曉平，等.蘿卜種質資源根腫病抗性鑒定與抗性基因遺傳分析[J].中國瓜菜，2023，36（11）：16-23.

[13] 甘彩霞，崔磊，袁偉玲，等.湖北長陽山區蘿卜根腫病抗性鑒定篩選[J].中國蔬菜，2017（12）：35-41.

[14]KAMEIA，TSURUO M，KUBO N，et al.QTL mapping of club-rootresistanceinradish（RaphanussativusL.）[J].Theoreticaland Applied Genetics，2010，120（5）：1021-1027.

[15]AKABA M，KANEKO Y，HATAKEYAMAK，et al.Identifica-tionand evaluationofclubroot resistanceofradish chromosomeusinga Brassicanapus-Raphanussativusmonosomicadditionline[J].Breeding Science，2009，59（2）：203-206.

[16]池鵬.蘿卜抗根腫病位點初定位及油菜MYB28轉錄因子在根腫菌和SA處理下的響應特征分析[D].北京：中國農業科學院，2020.

[17]GAN C X，DENG XH，CUI L，et al.Construction of a high-den-sitygenetic linkage mapand identification of quantitative traitloci associated with clubroot resistance in radish（Raphanussa-tivusL.）[J].MolecularBreeding，2019，39（8）：116.

[18]GANCX，YANCH，PANGWX，et al.Identification of a nov-el locusRsCr6 related to clubroot resistance in radish（Rapha-nussativusL.）[J].FrontiersinPlantScience，2022，13：866211.

[19]PANGWX，LIANGY，ZHAN ZX，et al.Development ofasin-itic clubroot differential set for the pathotype classification ofPlasmodiophorabrassicae[J].FrontiersinPlantScience，2020，11：568771.

[20]魏小春，原玉香，趙艷艷，等.96個大白菜品種根腫病抗性鑒定及位點檢測[J].中國瓜菜，2022，35（8）：27-34

[21]張小麗，劉玉梅，方智遠，等.青花菜及近緣種屬種質資源抗根腫病鑒定[J].植物遺傳資源學報，2016，17（6）：1106-1115.

[22] 甘彩霞，余陽俊，袁偉玲，等.國內主要十字花科抗根腫病品種在湖北病區的表現[J].中國蔬菜，2016（6）：53-58.

[23] TAKAGI H，ABEA，YOSHIDAK，et al.QTL-seq：Rapid map-ping of quantitative trait loci in rice by whole genome rese-quencing of DNA from two bulked populations[J].Plant Jour-nal，2013，74（1）：174-183.

[24]ZHANGXH，LIUTJ，WANGJL，et al.Pan-genome of Rapha-nushighlights genetic variationand introgression among domes-ticated，wild，andweedyradishes[J].MolecularPlant，2021，14（12）：2032-2055.

[25]YANGZQ，JIANGYF，GONGJF，et al.R gene triplicationconfers European fodder turnip with improved clubroot resis-tance[J].Plant Biotechnology Journal，2022，20（8）：1502-1517.

[26]胡燕，周娜，陸景偉，等.重慶地區蘿卜根腫病抗性種質資源鑒定[J].南方農業，2023，17（7）：13-17.

[27]洪雅婷，沈向群，陳永浩，等.四季蘿卜（Raphanussativusvar.radicula）抗根腫病遺傳規律[J].西北農業學報，2013，22（7）：138-142.