辣椒花藥培養再生植株倍性鑒定方法的比較

中圖分類號：S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）08-077-06

Comparison of ploidy identification methods for regenerated plants from pepperantherculture

CHENG Zhifang， LI Li， SHI Yanyan， HAN Yanan， CHANG Xiaoke， YAO Qiuju （InstituteofVegetable，HenancdemyofAgriculturaliencesZhengzhouoo2Heania）

Abstract：Inorder toexploreanacurate，eficient，andapplicable ploidyidentification method forregenerated plants from pepperantherculture，inthisstudy，6Oregenerated plantlines from1O genotypesofpepperantherculture wereused as the test materials.The ploidy identification was conducted by adopting the plant fertilitydetection method and DNA flowcytometry，combined withthechromosomecounting methodofroot tipcellsquash.Theadvantagesanddisadvantagesof diferent methods werecompared.Theresults indicated thatthe accuracyrateof ploidy identification byDNA flow cytometry was 96.67% ，this method was rapid and convenient，but it had highcost and was prone to peak bias.The pollen vitality detection method had an accuracy rate of 100% in determining the odd-even ploidy of regenerated plants' chromosomes，but itcouldnotdistinguishthe specific ploidyofregeneratedplants.Thecombinationofpolenvitalitydetection method and DNA flowcytometry detection method could significantlyreduce the identificationcost，improve theaccuracyrateandeficiency.Thatis，forthelines thathavealreadyflowered，thepollenvitalitydetectionmethodcouldbeused to determine theodd-even ploidy of chromosomes，which was convenient for early chromosome doubling treatment; for thelines thatfloweredlater，theDNAflowcytometrydetectionmethodshouldbeused inthesedlingstage.Ifthere were difficult-to-determine situations suchaspeakbias，thepollnvitalitycouldbecombined todetermine the ploidyofregenerated plants.

KeyWords： Pepper;Ploidy identification; Flowcytometer; Pollen viability; Chromosome counting

辣椒（CapsicumannuumL. ，2n=2x=24 ），是世界上廣泛種植的蔬菜作物之一，現有栽培品種多為一年生草本。傳統育種方式育成新品種至少需要5a（年），近年來隨著花藥培養技術逐漸應用于辣椒育種領域，顯著提高了育種效率。但由于植物在減數分裂過程中可能存在染色體行為、減數分裂微管骨架、細胞質分裂等異常細胞學現象而形成倍性復雜的小孢子，進而導致花藥培養再生植株中可能有單倍體、二倍體、多倍體、混倍體和非整倍體[-]，而不同染色體倍性植株用途不同，如單倍體株系可通過人工加倍獲得雙單倍體（doublehaploid，簡稱DH；而通過自然加倍花粉再生出的二倍體株系即為DH系，可直接應用于育種實踐，加快育種進程，亦可用于遺傳分析和分子生物學等研究領域，還可快速高效篩選并創制優質抗病抗逆新種質；而非整倍體和多倍體株系可用于細胞遺傳學研究等領域。因此，花藥培養再生植株的倍性鑒定是其充分利用的前提。

目前常用的植物染色體倍性鑒定方法有形態學鑒定[5、細胞學鑒定（即利用葉片氣孔保衛細胞周長[8-9]、氣孔密度[10-12]、保衛細胞葉綠體個數[9-13]進行鑒定）、花粉形態[14]或染色體計數[6-7，10-12，15]判斷植株的倍性，還有分子標記鑒定法[16-17及近些年廣泛應用的DNA流式細胞儀鑒定法[5-7，10，15，18]。縱觀多種植物的倍性鑒定方法，可知多種方法兼用可提高鑒定效率和準確率。李春蘭等[15]利用染色體計數法與DNA流式細胞儀相結合檢測棉梨的倍性水平，提高了鑒定的效率和準確率。而在辣椒花藥培養再生植株倍性鑒定方面的研究較少。張菊平等[19-20]研究了辣椒單倍體和二倍體植株葉片氣孔保衛細胞周長及其葉綠體數的差異，結果表明，氣孔保衛細胞葉綠體數可作為辣椒苗期快速確定植株倍性的指標且準確率可達 92.68% ；而氣孔保衛細胞周長（第5片葉）僅可作為鑒定辣椒植株倍性的輔助指標。付文婷等2比較了染色體計數法、DNA流式細胞儀、形態鑒定及坐果情況在鑒定辣椒花藥培養再生植株倍性方面的可靠性，發現DNA流式細胞儀檢測法和染色體計數法吻合度達 93% 。但前人的研究多側重于單倍體與二倍體的區別，而鮮少涉及多倍體、混倍體和非整倍體現象。因此，探索出一種針對辣椒的成本低廉、快速準確的倍性鑒定方法勢在必行。

因辣椒花粉活力與植株倍性緊密相關，在無逆境脅迫的情況下[22]，通常二倍體和四倍體等偶數倍體的花粉活力高，而單倍體和三倍體等奇數倍體由于減數分裂異常而導致花粉無活力或活力極低[23]，因此花粉活力可作為判斷植株倍性的依據之一。鑒于此，筆者以60個辣椒花藥培養再生株系為試材，主要利用植株育性檢測法和DNA流式細胞儀檢測法確定其倍性，當兩種方法鑒定結果依然不能確定植株倍性時，再利用根尖細胞壓片染色體計數法，最后分析不同方法的準確度及其優劣勢，以期尋求一種適合辣椒的準確高效易普及的植株染色體倍性鑒定方法。

1 材料與方法

1.1材料

供試材料為河南省農業科學院蔬菜研究所通過10個辣椒品種花藥培養獲得的60個再生株系（表1）。2023年9一10月陸續將花藥培養再生株系馴化移栽到直徑為 10cm 的營養缽中，2023年11月至2024年3月，將辣椒幼苗陸續定植到河南現代農業研究開發基地日光溫室，株行距為 30cm× 50cm 。

表1參試辣椒品種名稱、來源、類型及再生株系數量

Table1Name，source， type and number of regenerated lines of the tested pepper varieties

1.2 方法

1.2.1植株育性檢測法植株育性調查分為兩個方面：一是花粉活力檢測；二是結籽情況調查。花粉活力檢測采用碘-碘化鉀 染色法。每個株系任取3個生長良好的即將開放的新鮮花蕾，將花藥置于載玻片上，加1～2 滴 I₂. -KI染色液，用鑷子擠出花粉，去除破碎的花藥壁，蓋上蓋玻片 10min 后，采用Olympus顯微鏡在 10× 鏡下觀察花粉染色情況并拍照，藍色為可育花粉，黃褐色為發育不良或不育花粉，每個花蕾觀察5個視野，3次重復，統計其可育花粉的百分率，取平均值。2024年6一7月調查其單株坐果和結籽情況。

1.2.2流式細胞儀檢測法流式細胞儀檢測采用Sysmex公司的CYStainUVPreciseP試劑盒進行裂解和染色，采用PARTEC公司的CyFloW Cube8流式細胞儀進行倍性鑒定。每株系取1～2片約 0.5cm² 的新鮮幼嫩葉片，加入 300μL 細胞裂解液，用手術刀片切碎，然后加入 1200μL 染色液， 50μm 篩子過濾后收集濾液，避光染色 5～10min 后利用流式細胞儀檢測該樣品DNA含量分布圖，讀取峰值。用二倍體雜交種華之秀二號作對照調試電壓，使對照位于200道。每個樣本測定1次，根據峰值曲線判斷待測樣品倍性。DNA峰值處于100道、200道、300道和400道分別為單倍體、二倍體、三倍體和四倍體，其余為非整倍體。

1.2.3根尖細胞壓片染色體計數法從土壤中挖取待測株系的幼根，清水沖洗干凈，切取 1cm 左右的幼嫩根尖，先用 0.002mol?L^-1 的8-羥基喹啉于28^°C 避光處理 5～7h ，后經卡諾固定液固定 4～24h 再轉到 70% 乙醇中放 4^°C 冰箱備用。用清水沖洗2～3次后，用 1mol?L^-1 的HCL在 60^°C 水浴中解離10～12min ，取出后再用清水沖洗3～4次，切取幼嫩根尖，滴入卡寶品紅染色液染色制片，在Olympus顯微鏡下選取能數清染色體個數的分裂相在 100× 油鏡下觀察、記數、拍照成像。每個待測株系觀察5個根尖壓片，每個根尖至少看到3個可數分裂相，確定染色體個數。

1.3 數據分析

采用Excel2019對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1利用植株育性檢測辣椒花藥培養再生植株群 體的染色體倍性構成

參試的60個花藥培養再生株系花粉活力差異明顯（表2），根據花粉活力將再生株系基本分為三類：一類為花粉完全無活力（0）的株系，共15株，均不結籽。第二類為花粉活力較低的株系 （2.02%～ 31.63% ，共19株，除1個株系（華之秀2號-159，花粉活力為 31.63% 收到5粒種子外，其余均不結籽；由此認定以上兩類株系為奇數倍體或非整倍體。第三類為花粉活力較高的株系 81.18%～98.49% ，共26株，均可大量結籽，認定為偶數倍體或混倍體。

表260個辣椒再生株系的花粉活力分布、結籽情況及流式細胞儀檢測結果

able2Thepollen vitality，seed-setting condition and the result of flow cytometer detecti of 60 regenerated lines of pepper

2.2DNA流式細胞儀檢測辣椒花藥培養再生植株 群體的染色體倍性構成

參試60個花藥培養再生株系經DNA流式細胞儀檢測的結果如表2、圖1所示，單倍體（圖1-A）為30株，二倍體（圖1-B）為23株，三倍體（圖1-C）2株，四倍體（圖1-D）2株，混倍體（單倍體和二倍體組成，圖1-E）1株，非整倍體（圖1-F）2株，分別占再生植株的 50.00%.38.33%.3.33%.3.33% 1.67% 和 3.33% 。

圖1流式細胞儀測定辣椒花藥培養再生植株DNA含量分布

Fig.1Distribution of DNA content in regenerated plants obtained from pollen culture of pepper determined by flow cytometry

2.3花粉活力檢測法和DNA流式細胞儀檢測法鑒 定結果的比較

對照以上兩種鑒定方法的檢測結果（表2）可知，參試株系中26個花粉活力在 81.18%～98.49% 的株系，均可大量結籽，流式細胞儀檢測為二倍體、四倍體或混倍體；參試株系中15個花粉活力為0的株系，流式細胞儀檢測為單倍體或三倍體，均不結籽；參試株系中19個花粉活力在 2.02%～31.63% 的株系，流式細胞儀檢測為單倍體或非整倍體，除1株花粉活力為 31.63% 的株系極少量結籽外，其余均不結籽；其中流式細胞儀檢測為非整倍體的2個株系（華之秀2號-159和華之秀2號-24）的花粉活力分別為 31.63% 和 13.57% ，前者收到5粒種子且可萌發，而后者不結籽。進一步利用根尖細胞壓片染色體計數法確定2個非整倍體株系的染色體數，根尖染色體計數均為12條（圖2），即華之秀2號-159和華之秀2號-24均為單倍體再生株系。因此參試株系中花粉活力在 2.02%～31.63% 的株系均為單倍體。

綜上，60個參試辣椒花藥培養再生株系采用花粉活力檢測法、DNA流式細胞儀檢測法，結合根尖細胞壓片染色體計數法和植株結籽性，確定32株為單倍體、23株二倍體、2株三倍體、2株四倍體和1株混倍體，分別占參試植株的 53.33%.38.33% F3.33%.3.33% 和 1.67% 。DNA流式細胞儀檢測法倍性鑒定準確率為 96.67% 。

3 討論與結論

參試株系中花粉活力高于 81.18% 時，經DNA流式細胞儀鑒定為偶數倍體和混倍體，均可大量結籽。參試株系中花粉活力低于 31.63% 時，經DNA流式細胞儀檢測結合根尖細胞壓片染色體計數鑒定均為奇數倍體，除1株極少量結籽外，其余均不結籽，這可能是由于單倍體株系在異常減數分裂過程中產生極少量 2n 花粉[23]，進而有可能結籽或假性結籽，但結籽率極低，本研究中單倍體株系結籽率僅為 3.13% ，19株花粉活力為 2.02%～31.63% 的株系，13株出現假性結籽現象，而花粉活力為0的奇數倍體株系，無假性結籽現象。這說明不能僅憑是否結果來判斷辣椒植株的染色體倍性，而花粉活力檢測更可靠。另外，參試株系中單倍體占奇數倍體的 94.12% ，三倍體占奇數倍體的 5.88% ，綜上可見，采用花粉活力檢測法可以準確區分辣椒花藥培養再生株系是奇數倍體或偶數倍體，且再生株系中單倍體在奇數倍體中占很大比例 （94.12% ，而只有單倍體再生株系需要進行人工染色體加倍處理，進而得到DH系應用于辣椒育種，因此，僅用花粉活力檢測法足以完成辣椒花藥培養再生植株倍性鑒定進而滿足創制DH系的育種需求。此方法簡便、高效、準確度高、成本低廉，且對再生植株無傷害；但缺點是植株需現蕾，鑒定周期參差不齊，時效性略差，因此，適合現蕾較早株系的染色體倍性鑒定，不適合苗期長的草本植物和童期長的木本植物；另外，與DNA流式細胞儀或根尖細胞壓片染色體計數法相比，不能甄別再生植株的具體染色體倍性。

筆者在本研究中僅采用DNA流式細胞儀檢測法的倍性鑒定準確率為 96.67% ；而付文婷等[21]和陳斌等[24的研究表明，DNA流式細胞儀鑒定準確率分別為 93% 和 94.5% ，與本研究相比略低，這可能是參試群體數量不同和協同鑒定方式不同所致。流式細胞儀檢測法快速、便捷，可短時間進行大量群體檢測，取材部位多樣，不受取材部位、季節和細胞所處時期的限制；目前在許多蔬菜作物的研究中多采用此法[25。但缺點是該方法作為單倍體育種工作中的常規檢測手段，價格昂貴、對樣品準備要求高、易出現偏峰現象等2。本研究中參試的60個再生株系29株存在偏峰現象，此現象在不結球白菜的研究中也有發生[。因此DNA流式細胞儀檢測與花粉活力檢測結合使用可提高辣椒植株倍性鑒定的準確率，降低使用繁雜的染色體計數法的頻率。

綜上所述，筆者認為花粉活力檢測法與DNA流式細胞儀檢測法兩者結合是適合辣椒的高效、準確、低廉的倍性鑒定方法，即對已現蕾的株系，采用花粉活力檢測法確定其染色體奇偶倍性，便于早期進行染色體加倍處理；對現蕾較晚的株系，宜采用DNA流式細胞儀檢測法。

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