表沒食子兒茶素沒食子酸酯治療實驗性代謝相關脂肪性肝炎的效果及機制分析

Abstract：ObjectieToinvestigate theeffectandmechanismofactionof epigalocatechin-3-gallate（EGCG）inthetreatmentof experimentalmetabolicdysfunction-associatedsteatohepatitis（MASH），andtoprovideabasisforclinicaldevelopmentand application.MethodsA totalof32 experimental C57B/6Jmice wererandomlydivided into normal diet group（Congroup with8 mice）and modelgroupwith24 mice.The miceinthemodel group were givenahigh-trans fatyacid high-carbohydrate（HFHC） dietfor24weekstoestablishamodelofMASH，andattheendofweek24，themiceinthemodelgroupwerefurtherdividedinto HFHC group，EGCG treatment group （100mg?kg^-1?d^-1） ，and obeticholic acid treatment group （10mg?kg^-1?d^-1） ，with 8mice in each group.After 6 weeksof treatment，samples were collected toobserve the general conditions of mice；the contentof triglycerides（TG）andhydroxyprolinein livertisseandtheserum levelsof alanineaminotransferase（ALT）andaspartate aminotransferase（AST）were measured;HEstaining，oilredOstaining，and picrosiriusredstaining wereused toobserveliver histopathologicalchanges.Intheinvitroexperiment，LO2celsereinducedwithfrefattyacid（FFA）toestablishamodelflipd deposition，andthecellsweredivided intoCongroup，FFAgroup，andEGCGgroup.ThecontentofTGincellswas measured，as well as the results of oil red O staining and the relative mRNA expression levels of TNF- α ，CCL2，and CXCL10.The transcriptomicstechnique wasused toidentifydferentiallyexpressd genesbetwee theCongroup，theHHC group，andtheEGCG group and perform the GSEA analysis，and pathways with a P -adjust value of lt;0.05 that were associated with MASH were further classifiedinto metabolism-related pathwaysand inflammation-related pathways.Thespecificsignaling pathways ineach category wererankedbasedonthedegreofenrichment，andkeygenesinthetopthreepathways were verifiedbyPCRinvivo.Keygene in theNOD-likereceptorsignalingpathwaywereverifiedbyWesternbloting.Aone-wayanalysis ofvariance was usedforcomparison of normallydistributedcontinuousdata withhomogeneityofvariancebetweenmultiplegroups，andtheleastsignificantdierence t 1 test wasused for furthercomparison between two groups.ResultsCompared with the HFHC group，the EGCG group had significant reductions in the content of TG in liver tissue（ Plt;0.05 ）andthe serumlevelsofALTandAST（ Plt;0.05 ）. Oil red O staining showed significant allviation ofhepatocytefattdegeneration inthe EGCG group，HE staining showed that EGCG effectivelyallviatedinlammation，andpicrosiriusedstainingshowedsignificantreductionintenumberoffibroustissueafter EGCG treatment.There wasasignificantreductioninthecontentof hydroxyprolinein liver tisseafter EGCG intervention（ Plt; 0.01）.Cellexperiments showedthatcompared withtheFFA group，theEGCGgroup hadasignificantreductioninthecontentof TG，and oilredOstaining showed the disappearance of lipid droplets in theEGCG groupcompared with theFFA group，with significant reductions in the relative mRNA expression levels of the inflammatory factors TNF- α ，CCL2，and CXCL10（all Plt; 0.01）.The transcriptomics analysis identified230diferentially expressed genes between the HFHC groupandthe EGCGgroup， among which there were108upregulated genesand122downregulated genes.EGCG significantlyreduced thelevelsof the key proteins TLR4，NLRP3，and IL- 1β in the NOD-like receptor signaling pathway in liver tissue （all Plt;0.05 ）.Conclusion EGCG cansignificantlyaleviatelipiddeposition，inflammation，andfibrosis inthemousemodelofMASHandimprovelipiddeposition and inflammatory injury in LO2 cels，possibly by regulating the NOD-like receptor signaling pathway.

Keywords：Metabolic Dysfunction-Associated SteatoticLiverDisease；EpigalocatechinGallte；MolecularMechanismsof Pharmacological Action； Signal Transduction

Research funding：General Programof National Natural ScienceFoundationofChina（8217404O）；Shanghai Sailing Progran （23YF1448200）； SIMM-SHUTCMTraditional Chinese Medicine Innovation Joint Research Program（2022，E2G807H）

代謝相關脂肪性肝?。╩etabolicdysfunction-associatedfattyliverdisease，MAFLD）是一種多系統疾病，與胰島素抵抗和代謝功能障礙密切相關，影響全球約 38% 的人□[1-3]，疾病范疇涵蓋代謝相關脂肪肝、代謝相關脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）代謝相關脂肪性肝纖維化、肝硬化，并最終可能發(fā)展為肝癌。MAFLD的發(fā)病機制尚未完全明確，目前治療方法有限[4]。2024年3月，美國食品藥物管理局批準瑞美替羅（Resmetirom）治療成人 MASH^[5] 。然而，目前該藥物僅適用于特定類型的MASH患者，且存在治療成本較高、治療范圍有限等問題。因此，積極研發(fā)安全有效的MASH治療藥物仍是當前醫(yī)學研究領域的重要課題。

現代研究發(fā)現，綠茶具有降低血糖和血脂水平、抗炎、抗氧化以及促進體質量減輕等藥理作用[6-7]。兒茶素是綠茶中的主要活性成分，而兒茶素中含量最多的是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG），占綠茶中兒茶素總量的 50%～80%^[8] 。EGCG已被證明可以有效改善HBV、乙醇及藥物等不同原因誘導的肝損傷[9-I]。近幾年研究發(fā)現EGCG對MASH有治療作用，但其機制有待進一步闡明[12]。本研究建立高反式脂肪酸高碳水化合物（high-trans fattyacid high-carbohydrate，HFHC）飲食誘導的MASH小鼠模型和游離脂肪酸（freefattyacid，FFA）誘導的LO2細胞脂質沉積模型，并使用亞洲人群日常飲用綠茶劑量等效小鼠劑量干預，探究EGCG治療實驗性MASH的藥效，并探討其治療實驗性MASH的機制，旨在為MAFLD的治療提供科學依據。

1材料與方法

1.1動物實驗

1.1.1實驗動物選用32只6周齡的C57BL/6J雄性小鼠，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。在上海中醫(yī)藥大學的實驗動物中心進行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間，小鼠自由進食和飲水，飼養(yǎng)溫度 26^°C ，相對濕度控制在 60%± 10% ，光照周期為 12h 的明暗交替。實驗動物生產許可證編號：斯萊克SCXK（滬）2017-0005；實驗動物使用許可證編號：SYXK（滬）2020-0009。

1.1.2實驗材料EGCG購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（CAS：989-51-5，批號：180120）；奧貝膽酸（OCA）購自Biovison（CAS：459789-99-2，批號：3J28B18980）；BCA蛋白定量試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，貨號：NCI3225CH）；高反式脂肪酸飼料、正常飼料（美國Researchdiets，貨號：D12331、D12328）；果糖、蔗糖（南通特洛菲飼料科技有限公司，貨號：F0001、S0001）；甘油三酯（TG）試劑盒（浙江東歐生物工程有限公司，貨號：A0-10017）;ALT、AST賴氏法試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、油紅O試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C009-2、C010-2、D006-1、D027-1）；天狼星紅染料（北京雷根生物技術有限公司）。

1.1.3 實驗儀器 脫水機、石蠟包埋機、冰凍切片機、掃片機（LEICA，型號：ASP300、EG1160、CM3050S、AperioATTurbo）；快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：JXFSTPRP-24）；激光共聚焦（OLYMPUS，型號：FluoviewFV10i）。

1.1.4造模、分組及給藥32只雄性C57BL/6J小鼠，適應性飼養(yǎng)1周，采用完全隨機法將小鼠隨機分為正常飲食組 （Con，n=8） 和模型組（ n=24 ）。Con組給予正常飼料并飲用雙蒸水。模型組小鼠給予高反式脂肪酸飼料聯合高糖飲水（糖水濃度為 42g/L ，糖分配比： 55% 果糖 + 45% 蔗糖），造模24周建立MASH模型，第24周末采用完全隨機法將模型組小鼠隨機分為HFHC組、EGCG組和OCA組，每組8只，EGCG組中EGCG給藥劑量為每只小鼠 100mg^?kg^-1?d^-1 ，OCA組中OCA給藥劑量為每只小鼠 10mg?kg^-1?d^-1 。給藥6周后取材。

1.1.5血清和肝組織生化指標檢測 （1）肝組織TG含量檢測遵照TG試劑盒說明書測量每個孔的吸光度（OD）。肝組織TC （測量孔OD值-空白孔OD值）/標準孔 ×200×3/20（2） 血清ALT、AST活性檢測按照試劑盒說明書計算ALT和AST的檢測值。（3）小鼠肝組織羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量按照HYP試劑盒說明書進行測定，計算公式：HYP含量（ |μg/mg? ）=（測定OD值-空白OD值）/（標準OD值-空白OD值） × 標準液濃度（ 5μg/mL）× 水解液體積（ 10mL /肝濕重（ 50mg ）。

1.1.6肝組織病理染色

1.1.6.1肝組織HE染色和天狼星紅染色對肝組織進行固定、脫水、包埋，切片后脫蠟處理。HE染色，次日收集病理切片，在顯微鏡下觀察。使用非酒精性脂肪性肝病活動度總評分（NAS）對肝組織病理進行評估[13]。將肝組織石蠟包埋后，采用天狼星紅染色法來評估肝臟中膠原沉積情況。

1.1.6.2肝組織油紅0染色采用冷凍切片技術對肝組織進行切片處理。將切片置于稀釋后的染色液中染色10min 。染色完成后去除多余染液。復染液染色、清洗、封片處理。顯微鏡下評估染色效果和組織結構。

1.1.7WestemBlot檢測將肝組織樣本裂解、勻漿、沉淀，吸出上清液。使用BCA蛋白定量法蛋白定量。制備好的蛋白進行電泳、轉膜?？贵w結合：一抗NLRP3（1：1000）、IL-1β（1：1000）、TLR4（1：1000）及 GAPDH（1：10000）. 4^°C 過夜孵育。次日二抗室溫孵育 ^1h 。顯影檢測特異性蛋白條帶。

1.1.8小鼠肝組織基因轉錄組分析從Con組、HFHC組和EGCG組的肝組織樣本中每組隨機挑選5個進行質檢及轉錄組分析。提取肝組織樣品中總RNA。通過IlluminaHiSeq平臺對短序列片段進行測序。以mRNA為模板合成穩(wěn)定的雙鏈結構后連接adaptor，最后進行文庫富集，回收目的條帶定量，按數據比例混合上機，生成雙端測序（paired-end，PE）文庫，讀長 2×150bp 。

1.1.9篩選差異表達基因分析小鼠肝組織樣本中各基因的表達水平，以 Plt;0.05 且基因表達差異倍數 （FC）? 2為標準，確定HFHC組和EGCG組之間的差異基因集。

1.1.10基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）及驗證對Con組、HFHC組、EGCG組3組數據進行GSEA，共1000次重抽樣，確保每個分析的標準化富集分數。符合歸一化富集評分 gt;1，Plt;0.05 、假發(fā)現率（FDR） lt;25% 的通路為顯著富集通路，并對富集的通路按照富集程度從大到小排列。使用Con組、HFHC組、EGCG組小鼠肝組織樣本，對富集程度排名前三的信號通路中的關鍵基因進行PCR實驗驗證。

1.2細胞實驗

1.2.1實驗材料DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（美國賽默飛世爾科技公司，貨號：11965092、10099141C）；雙抗 ?0.25% 胰酶、DMSO（美國CorningCellgro公司，貨號：30-002-Cia、25-050-CI、25-950-CQCC）;TG含量酶法測定試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，貨號：E1013-50）、油紅0染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：D027-1）；RNA提取試劑盒（美國BioFlux公司，貨號：BSC52M1）；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑（日本Takara公司，貨號：K1622、AK7208）；磷酸鹽緩沖液（中國葵賽生物，貨號：C0221A）；TNF- α 、CCL2、CXCL10引物（中國BioTNT公司，貨號 ;Tnt5197，Tnt1467，Tnt5469a） 。

1.2.2實驗儀器 CO₂ 培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋（美國ThermoScientific公司，型號：Midi40、TSGP02）；熒光倒置顯微鏡（美國Olympus公司，型號：IX71-F22FL/DIC）;細胞用水系統（美國Millipore公司，型號：Milli-Q）。

1.2.3細胞培養(yǎng)人正常肝細胞L02（HL7702）購于中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。在 37% CO₂ 培養(yǎng)箱中使用含胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.4細胞分組及處理6孔板每孔種板 10⁵ 個細胞，設對照組（Con組）模型組（FFA組）EGCG組，模型組的培養(yǎng)基為含有 0.2mmol/L FFA的培養(yǎng)基，EGCG組的培養(yǎng)基為含有 0.2mmol/L FFA且含有 50μmol/L EGCG的培養(yǎng)基，對照組加人等量DMSO，給藥 24h 后收集細胞進行檢測。

1.2.5EGCG細胞毒性檢測方法96孔板每孔種板 7× 10⁵ 個細胞，藥物的濃度梯度為200、100、50、25、12.5、6.25μmol/L ，每組藥物各設6孔，按照CCK8試劑說明書進行測定，統計分析數據。

1.2.6細胞內TG含量檢測按照TG試劑盒說明書進行TG含量測定。按照BCA試劑盒的檢測方法進行蛋白定量，TG含量的計算公式為：TG值/蛋白含量 單位蛋白濃度下的TG含量（ mg/g protein）。

1.2.7細胞油紅0染色方法以 10⁵ 個細胞每孔種板于6孔板，設置EGCG給藥濃度為 50μmol/L ，給藥 24h 之后，按照油紅0試劑盒說明書操作，置于顯微鏡下拍照。1.2.8RT-PCR檢測本研究采用純化柱法對樣品中的RNA進行提取。測定總RNA的濃度后逆轉錄，完成后將得到的cDNA保存在 的條件下備用。將配制好的混合液加入到384孔板中，放人PCR儀中進行檢測。引物由BioTNT公司合成，序列如下。TNF- α?α∝ 上游序列：5^′ -ATGAGCACTGAAAGCATGATC- ?3^′ ，下游序列： 5^′ 1TCACAGGGCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCC- ?3^′ ; CCL2上游序列： 5^′ -TGCTGCTACTCATTCACTGGC- ?3^′ ，下游序列： 5^′ -CCTTATTGGGGTCAGCACAG- ?3^′ ;CXCL10上游序列： 5^′ -CTTTCTGCATCTAAGTGGCATTC- 3^′ ，下游序列： 5^′. CACCCTTTCTTTTTCATTGTAGCAA .3^′ 。

1.3統計學方法應用SPSS26.0、GraphPadPrism和ImageJ軟件完成數據分析。符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較使用LSD-t檢驗。 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1EGCG對HFHC飲食誘導MASH小鼠肝脂質沉積、炎癥及纖維化程度的影響在Con組中，小鼠的皮毛光滑，油脂較少。HFHC組小鼠體寬 gt;5cm ，皮毛有油脂分泌，EGCG組小鼠體寬 lt;4cm ，皮毛油脂減少。在第30周處死小鼠時，與 Con 組相比，HFHC組小鼠肝體積明顯增大，顏色由暗紅變成黃白色。經過EGCG干預后，小鼠肝臟形態(tài)趨于正常（圖1a）。與Con組相比，HFHC組小鼠體質量和肝濕重均顯著升高（ P 值均 lt;0.01 ）；與HFHC組小鼠相比，EGCG組體質量、肝濕重均顯著下降（ P 值均 lt; 0.01），OCA組的體質量雖然較HFHC組有下降趨勢，但是差異無統計學意義（ （Pgt;0.05） （圖1b）。

油紅O染色結果顯示，HFHC組小鼠出現明顯的脂肪變性，肝細胞胞質中脂滴顯著增多，紅色染色區(qū)域明顯變大。與HFHC組相比，EGCG組小鼠肝細胞胞質中脂滴顯著減少，紅染密度和大小明顯變小（圖1c）。與Con組相比，HFHC組小鼠肝組織中TG含量顯著升高（Plt;0.05） ；在EGCG和OCA用藥之后，小鼠肝組織中TG含量均顯著降低（ P 值均 lt;0.05 （圖1d）。

HE染色結果顯示，HFHC組小鼠均有不同程度的脂肪變性，在小葉中心區(qū)可見典型的大泡或小泡性脂肪變性，肝小葉中有炎性細胞浸潤。經EGCG和OCA治療之后，肝小葉中脂肪變性明顯減輕，脂肪空泡明顯減少，炎性細胞浸潤較HFHC組減少（圖1c）。NAS評分結果顯示，與Con組相比，HFHC組小鼠NAS評分顯著升高（ Plt; 0.01）；與HFHC組相比，EGCG組和OCA組NAS評分均顯著下降（P值均lt;0.01）（圖1d）。

圖1EGCG對HFHC飲食誘導MASH小鼠肝脂質沉積、炎癥及纖維化程度的影響e1EffectofEGCGonHFHCdiet-induced liver lipiddeposition，inflammation，and fibrosis inMASH

注：a，小鼠大體和肝臟形態(tài)肉眼觀;b，小鼠30周末體質量和肝濕重;c，肝組織病理染色;d，肝組織TG含量、NAS評分和HYP含量;e，血清ALT和AST水平。

天狼星紅染色結果顯示，在第30周末， Con 組肝細胞形態(tài)正常。HFHC組的肝組織結構被破壞，并被大量增殖的纖維組織所取代，肝竇周纖維化明顯。與HFHC組相比，EGCG組的細胞形態(tài)較為正常，纖維組織顯著減少（圖1c）。與 Con 組相比，HFHC小鼠肝組織HYP含量顯著升高（ Plt;0.01 ；與HFHC組相比，EGCG組和OCA組小鼠肝組織中HYP的含量均顯著下降 （P 值均 lt;0.01 ）（圖1d）。

與Con組相比，HFHC組小鼠血清ALT明顯升高（ Plt; 0.01）；EGCG用藥之后ALT顯著降低，OCA也顯著逆轉了HFHC飲食引起的ALT異常增加（ P 值均 lt;0.01 （圖1e）。與Con組相比，HFHC組小鼠AST顯著升高（ Plt; 0.01）；與HFHC組相比，EGCG組和OCA組小鼠血清AST均顯著降低（ ∣P∣ 值均 lt;0.05 （圖1e）。

2.2EGCG對FFA誘導的L02細胞模型脂質沉積和炎癥程度的影響CCK8結果顯示，在 0～200μmol/L 的劑量范圍內，EGCG對L02細胞沒有明顯的細胞毒性（圖2a）。

與 Con 組相比，FFA誘導的模型組肝細胞TG含量顯著升高 （Plt;0.01） ；與FFA組相比，給藥 25，50，100μmol/L EGCG后細胞內TG含量劑量依賴性降低，當EGCG給藥劑量為 50μmol/L 時，FFA組與EGCG組出現顯著差異（ Plt; 0.01）（圖2a）。

L02細胞油紅O染色結果顯示，正常的L02細胞呈梭形，透明狀，無紅染；FFA造模之后，細胞周圍和細胞內部有紅色脂滴聚集，連接成片；與FFA組相比，EGCG50μmol/L 組脂滴明顯消散（圖2b）。

與Con組相比，FFA誘導的模型組肝細胞TNF- α?α∝ 和CXCL10的mRNA相對表達量顯著升高（ P 值均 lt;0.01 ）；與FFA組相比， 50μmol/L EGCG干預后TNF- α_? CCL2、CXCL10的mRNA相對表達量均顯著降低（ ∣P∣ 值均 lt;0.01 ）（圖2c）。

2.3EGCG干預后MASH小鼠肝組織轉錄組學分析及驗證主成分分析結果顯示，組間差異較大，組內樣本差異較小；選擇HFHC組和EGCG組之間的差異基因（ Plt;0.05

注：a，L02細胞生存率及LO2細胞內TG含量；b，細胞油紅O染色;c，各組細胞TNF- σ?α∝ CCL2和CXCL10mRNA相對表達量。

圖2EGCG對FFA誘導L02細胞模型脂質沉積和炎癥程度的影響

Figure2EffectofEGCGonfreefatyacid-inducedlipiddepositionanddegreeofinflammationintheL02cellmodelFC?2 ）進行聚類分析，聚類分析熱圖顯示EGCG組與HFHC組組內樣本基因表達相似，不同組間樣本基因表達差異顯著；HFHC組和EGCG組之間共有230個差異表達基因，其中上調基因108個，下調基因122個（圖3）。

對Con組、HFHC組、EGCG組3組數據進行GSEA富集分析，將 P -adjust lt;0.05 的通路按照富集程度從大到小排列，富集結果顯示，EGCG主要影響代謝相關和炎癥相關兩類信號通路。在代謝相關信號通路中，EGCG主要影響類固醇生物合成、FOXO信號通路和mTOR信號通路的變化 P-adjustlt;0.05 ，富集程度排名前三）（圖4）；在炎癥相關信號通路中，EGCG主要影響了NOD樣受體信號通路、IL-17信號通路和TNF信號通路的變化（ P -adjustlt;0.05 ，富集程度排名前三）圖5）。基于上述發(fā)現，運用小鼠肝組織樣本對上述信號通路相關基因mRNA進行驗證，PCR驗證結果與轉錄組數據結果基本一致，其中NOD樣受體信號通路中多個基因在EGCG干預后較模型組顯著下降（ P 值均 lt;0.05 ，且與通過富集程度篩選出的其他5條通路相比，NOD樣受體信號通路中的關鍵差異基因最多、最顯著，可能是EGCG發(fā)揮藥效的重要調控通路之一（圖4、5）。

2.4EGCG對MASH小鼠肝組織NOD樣信號轉導通路的調控作用WesternBlot結果顯示，與Con組相比，HFHC組小鼠肝組織TLR4、NLRP3、IL-1β蛋白表達均顯著升高 （P 值均 lt;0.05 ）；與HFHC組相比，EGCG用藥組上述蛋白表達均顯著降低（P值均 lt;0.05 （圖6）。

圖3HFHC組與EGCG組主成分分析圖、差異基因聚類熱圖、表達量差異火山圖 （n=5） Figure3PCA plot，diferentiallyexpressed gene clustering heatmap，and volcano plotof expresson diferences between HFHC and EGCG groups （n=5）

圖4代謝相關通路GSEA曲線及部分基因驗證

Figure4GSEAcurvesofmetabolism-related pathwaysandpartial genevalidation

圖5炎癥相關通路GSEA曲線及部分基因驗證

注：a，肝組織TLR4、NLRP3和IL-1β蛋白表達；b，蛋白表達半定量分析。

Figure 5GSEA curves of inflammation-related pathwaysand partial gene validation

圖6EGCG對MASH小鼠肝組織NOD樣信號轉導通路的調控作用

Figure6Regulatory effect ofEGCG on NOD-like signal transduction pathway in MASH mouse liver tissue

3討論

多項現代研究已經證實，綠茶對于預防和治療癌癥、肥胖癥、糖尿病、心血管疾病以及神經退行性疾病具有積極作用。在綠茶的眾多有益成分中，EGCG作為主要的多酚類化合物，展現出了顯著的抗癌、抗氧化、抗炎、抑制血管生成以及促進細胞凋亡的生物活性[14-15]既往有學者對EGCG在不同的動物模型如 _ob/ob 誘導的NASH模型、蛋氨酸及膽堿缺乏飲食（MCD）誘導的NASH模型進行過研究[16-17]，而本研究利用HFHC飲食誘導的MASH小鼠模型和FFA誘導的L02細胞脂質沉積模型，探討EGCG對MASH的療效。與 _ob/ob 模型、MCD模型相比，HFHC飲食模型能誘導出肥胖或胰島素抵抗等，更接近人類疾病特征。因此本研究對今后的臨床研究可能更有借鑒意義。OCA是法尼醇X受體（FXR）激動劑，能夠有效減輕MASH小鼠的肝脂質沉積、肝臟炎癥和胰島素抵抗，并且在治療MAFLD的3期臨床試驗中療效顯著[18-19]。因此，本實驗將OCA作為陽性對照藥。

在本研究中，通過測定HFHC飲食誘導的MASH小鼠的肝酶活性、TG水平和肝組織的病理變化，發(fā)現EGCG對MASH小鼠的肝脂肪積累、炎癥反應和纖維化發(fā)展具有明顯的改善作用。此外，研究還利用FFA誘導的L02細胞脂質沉積模型驗證了EGCG能顯著減少肝細胞內的脂質積累。上述結果證明EGCG對實驗性MASH體內外模型具有良好的療效。這為EGCG作為潛在的治療手段提供了實驗依據。

研究顯示，在高脂飲食喂養(yǎng)的SD大鼠模型中，EGCG可能通過TLR4信號通路抑制炎癥和改善肝組織中的胰島素抵抗[20]，EGCG還可通過調節(jié) TGF/SMAD、PI3K/Akt/FOXO1和NF- σ_κB 通路的活性改善MAFLD[2I]。為了進一步探究EGCG治療MASH的作用機制，本研究通過轉錄組學尋找機制研究的新思路。轉錄組學及PCR結果提示，EGCG治療MASH的機制有可能與調控炎癥相關信號通路如TNF信號通路、NOD樣受體信號通路，以及代謝相關信號通路如類固醇生物合成信號通路等6條信號通路有關?；诖耍狙芯繉@6條信號通路中相關基因進行PCR驗證，發(fā)現NOD樣受體通路中關鍵基因（NLRP3相關）的轉錄水平在給藥之后顯著下調，且與通過富集程度篩選出的其他5條通路相比，NOD樣受體信號通路中下調的關鍵差異基因最多最顯著，提示對該通路的調控可能是EGCG的藥理途徑之一。因此，進一步對NOD樣受體信號通路進行了更深人的探討。

NOD樣受體信號通路核心是NOD樣受體，是細胞質中的一種模式識別受體，其在先天性免疫應答中起到關鍵作用[22]。在目前發(fā)現的22種人類NOD樣受體蛋白中，有3種蛋白（NLRP3、NLRP6、NOD2）與肝病，特別是代謝性肝病有關[23]。在肝臟中，TLR4可激活NLRP3，而被激活的NLRP3可通過激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（caspase-1），釋放IL-1β等炎癥因子加重MASH[24]NLRP6可以調控促炎細胞因子IL-18的表達，還可以通過抑制CD36介導的脂質攝取，改善 MASH^[25-26] 。NOD2受體被激活后，募集RIPK2（受體相互作用絲氨酸蘇氨酸激酶2），RIPK2活化后進一步募集下游的MAP3K7（絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7），加重 MASH^[27] 。進而對這3條通路相關基因進行轉錄組分析和PCR驗證，發(fā)現EGCG組與HFHC組相比，NLRP3通路中TLR4、NLRP3和IL-1β等基因顯著改變，但NLRP6及NOD2通路中相關基因改變不明顯。因此后續(xù)研究重點關注EGCG對NLRP3信號通路的調控，WesternBlot實驗結果證實EGCG可顯著抑制NLRP3信號通路中關鍵蛋白TLR4、NLRP3和IL-1β表達。

綜上，本研究結果表明，EGCG治療實驗性MASH的機制可能是與炎癥相關信號通路以及代謝相關信號通路有關，EGCG通過調控NOD樣受體信號通路中關鍵蛋白TLR4、NLRP3、IL-1β，從而發(fā)揮治療MASH的作用。本研究對EGCG治療MAFLD的機制進行了探索，為中醫(yī)藥治療MAFLD提供了新思路和新證據。未來，擬對TNF信號通路以及IL-17信號通路開展相關研究，更深入地探索相關靶點和信號通路在MASH中的作用機制。

倫理學聲明：本研究方案于2017年10月20日經由上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號：SZY201710017，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：徐笑負責設計論文框架，起草論文；張倩負責實驗操作，研究過程的實施；辛鑫負責數據收集，統計學分析，繪制圖表；馮琴、辛鑫、孫沁梅負責論文修改；馮琴、胡義揚負責擬定寫作思路；馮琴、辛鑫指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-10-15：錄用日期：2024-12-02本文編輯：劉曉紅

引證本文：XUX，ZHANG Q，SUNQM，etal.Efficacyandmechanismofepigallocatechin-3-gallateintreatmentofexperimentalmetabolicdysfunction-associatedsteatohepatitis[J].JClinHepatol，2025，41（7）：1327-1336.

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