生物鐘基因在肝癌發生發展與治療中的研究進展

關鍵詞：癌，肝細胞；生物鐘；晝夜節律；基因，腫瘤抑制

Abstract：Primarylivercancerisoneof themostcommonmalignanttumorsofthedigestivesystem，anditsmorbidityandmortality ratesareincreasing yearbyyear.Recent studieshaveshown that circadian clockgenedisordersarecloselyasociated with the developmentandprogresiooflivercaner，hichprovidesanwperspectivfotheprevention，iagosistreament，andprogois of livercancer.Inadition，targetingcircadianclockgenesalsoshowsacertainclinicalapplicationpotentialinthetreatmentof cancer.Thisarticlereviewsthelatestresearch advances in theroleofcircadianclock genes in the pathogenesis，prevention， treatment，andprognosisoflivercancer，inordertoprovidenewideasfortheclinicaldiagnosisndtreatmentoflivercancer.

Key Words：Carcinoma，Hepatocellular；Biological Clocks；Circadian Rhythm；Genes，Tumor Suppressor

Researchfunding：ScientificResearchProjectofNational ClinicalResearch BaseofTraditionalChineseMedicineofHenan ProvincialAdministration（2O21JDZYO03）；ConstructionProjectofTraditionalChinese MedicineinHenanProvince（STG-ZYX04- 202133）；HenanProvincialHealthCommsionSpcialProjectofTaditionalChineseMedicineScientificResearch（203Z007）

肝細胞癌（HCC）是全球高發的高致死率惡性腫瘤，其發生發展與腫瘤微環境（tumormicroenvironment，TME）動態演變密切相關。中晚期HCC一線治療方案以免疫聯合治療為主，雖可顯著改善患者生存，但仍未滿足臨床需求[1]。最新研究發現，生物鐘基因不僅參與

HCC的形成、進展，更展現出作為新型預后標志物的臨床應用潛力[2]。本文對生物鐘基因在肝癌發生發展中的調控機制進行總結，并探討其作為治療靶點與預后評估工具的應用前景，以期為HCC開發新型、精準的診療策略提供理論依據。

1生物鐘

2生物鐘參與肝癌發生發展機制

1.1生物鐘與晝夜節律生物鐘是生物為適應因晝夜更替而不斷變化的環境所進化出的一種內在節律系統。哺乳動物生物鐘分為中樞和外周兩類。中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核，可將從外界接收到的光信息進行整合后通過激素和神經信號傳遞到外周生物鐘，產生節律性振蕩，實現身體內部節律與外部環境的周期性同步。外周生物鐘廣泛分布于各器官，受中樞鐘調控但具相對獨立性[3]。由于生物鐘影響著幾乎所有生理現象的晝夜節律，包括激素水平、代謝能力、DNA損傷修復、細胞凋亡等，晝夜節律的紊亂將引發相關疾病。長期的時差可顯著降低人源化HCC小鼠的腫瘤潛伏期和存活率，改變HCC預后指標（AFP、PT、INR等），增加HCC發病率、生長速率和轉移率，降低癌細胞對藥物敏感性，阻礙后續治療[4]。可以推測，長期晝夜節律紊亂亦可能增加HCC發病風險。

1.2生物鐘基因目前已鑒定出15個核心生物鐘基因[5]。以腦和肌肉芳香烴受體核轉運蛋白樣1基因（brainandmusclearntlike1，BMAL1）時鐘基因（circadianlocomotor outputcycleskaput，CLOCK）、周期基因（period，Per）、隱花色素（cryptochrome，Cry）等核心生物鐘基因為基礎形成的轉錄-翻譯-反饋環（transcription-translationfeedbackloop，TTFL）是使生物細胞具有晝夜節律的關鍵，其分子機制如下：CLOCK和BMAL1結合形成異二聚體CLOCK-BMAL1，在細胞核內與Cry和Per的E-box結合，生成并激活Per和 Cry ，從而正向調控晝夜節律轉錄，而胞內積累的 Per 和Cry結合形成異二聚體，進入細胞核抑制CLOCK-BMAL1活性，形成負反饋調控環路。該過程同時受視黃酸相關孤兒核受體 ∝ （retinoid-relatedorphan receptor- α RORα ）與核受體亞家族1組D成員1（nuclear receptor subfamily1，group D member1，NR1D1/REV-ERB）調控，二者通過競爭性結合RORE（ROR反應元件）位點分別激活或抑制BMAL1表達，并影響時鐘蛋白穩定性[6。生物鐘基因的表達不僅取決于轉錄激活因子/蛋白的活性，也與基因的染色質修飾狀態密切相關，如DNA甲基化以及組蛋白修飾等。現有研究已證實生物鐘基因的異常表達或突變等可導致肝細胞的異常增殖、凋亡抑制以及DNA損傷應答功能失調等，從而促進HCC發生發展[7]。因此，深人研究生物鐘基因在HCC中的作用機制，有助于更好地理解肝癌的發病過程，并為HCC診療提供新的策略和靶點。

2.1生物鐘與外界環境人體肝臟約 40% 的轉錄組呈節律性表達[8]。流行病學調查顯示，外界環境異常變化（長期夜間工作、睡眠呼吸障礙等）可顯著增加罹患HCC風險[9]。日本一項研究發現，在不同輪班工作模式下，男性胡須毛囊中的生物鐘基因表達存在顯著差異，連續夜班工作（≥3天）組Per3和核受體亞家族1成員D2表達水平整體低于白天工作組[10]。動物實驗進一步證實，僅通過干擾外界環境變化即可誘發代謝相關脂肪性肝病，在進展為HCC之前，代謝相關脂肪性肝病逐漸發展為代謝相關脂肪性肝炎和肝纖維化，究其原因可能是長期晝夜節律紊亂誘發神經內分泌功能障礙，導致外周生物鐘紊亂、肝臟整體代謝功能障礙和全基因組基因失調，最終激活致癌基因并促進HCC發生[11]。

2.2生物鐘基因與癌基因人體細胞的代謝過程受生物鐘調控。然而腫瘤細胞通過代謝重塑可擾亂生物鐘的正常節律，為癌細胞的增殖、存活、侵襲和轉移提供大量能量支持[12]。不同的癌基因以不同的方式重塑代謝。例如，HCC的關鍵癌基因細胞髓細胞瘤病癌基因（cellularMYelocytomatosisoncogene，c-MYC）以不同形式結合TTFL中的E-box元件，抑制CLOCK、BMAL1表達并激活REV-ERBα ，形成抑制BMAL1的惡性循環。而BMAL1、Per2或Cry2等生物鐘基因的缺失又反向上調c-MYC，加速腫瘤進展[13]。此外，生物鐘與關鍵抑癌基因p53存在雙向調控：當DNA損傷時，Per1可激活p53，啟動細胞凋亡程序。同時，Per2與p53、鼠雙微體基因2結合形成三聚體，可穩定p53并確保其下游信號通路的正常表達[14]。而p53突變/缺失可導致IL-34表達上調，繼而代謝重編程腫瘤相關巨噬細胞在HCC干細胞聚集，抑制細胞毒性T淋巴細胞抗腫瘤免疫，導致癌細胞對免疫檢查點抑制劑耐藥性增加。然而，剔除HCC小鼠肝細胞中p53，可顯著抑制HCC進展并延長小鼠總生存期（overallsurvival，OS），表明 p53 持續激活、積累與HCC發生發展的風險呈正相關[15]。雖然p53在HCC中的作用尚存爭議，但可以確定的是生物鐘基因與癌基因（c-MYC、RAS、p53、cyclin蛋白家族等）的相互作用是HCC的啟動因素并加快HCC進展。

2.3生物鐘基因的突變

2.3.1CLOCK基因自1994年Takahashi教授首次在小鼠中發現CLOCK基因以來，對于CLOCK基因及其所編碼的CLOCK蛋白已有深入的研究和認識。CLOCK突變及表達變化與HCC增殖及生存周期顯著相關。CLOCK-BMAL1二聚體激活REV-ERB和WEE1轉錄，WEE1是DNA損傷修復關鍵激酶，使細胞在進入有絲分裂之前進行DNA損傷修復，參與G2/M期調控[16]。與此同時，REV-ERB上調間接抑制細胞周期依賴性激酶抑制劑p21轉錄，導致HCC細胞周期停滯和凋亡。因此，在HCC細胞中下調BMAL1/CLOCK導致WEE1下調， p21 表達上調，促進癌細胞凋亡和細胞周期停滯。相較于BMAL1，敲低CLOCK可誘導更大規模的癌細胞凋亡，并使細胞周期停滯在DNA復制期（S）和G2/M期，提示CLOCK過表達可誘導HCC增殖，縮短患者生存期。CLOCK抑制劑或可與其他療法聯用，以提高HCC治療效果，而WEE1和p21可作為療效評估指標。

2.3.2Per基因Per基因是人類發現的第一個生物鐘基因，Yang等[17]通過檢測30例HCC患者生物鐘基因的mRNA，發現Per1、Per2、Per3在HCC細胞中表達水平較癌旁細胞顯著降低，且 Per2，Per3 與腫瘤大小、門靜脈侵犯、肝功能分級呈負相關，表明Period基因可能參與HCC的進展，并與HCC患者的臨床表現和預后有關，但該研究未詳細闡明Per基因在HCC中的具體調控機制。近期報道顯示，HCC組織中Per2異常表達與DNA甲基化相關，其中6個CpG島 （cg20070418.cg22879834.cg21315421， cg24831107，cg12308675 和 cg06259818 高甲基化與不良預后呈正相關[18]。此外，在Per2突變小鼠中，HCC 發生率增加近5倍，刪除Per2基因PAS結構域可導致晝夜節律紊亂，激活癌基因c-MYC和CCNB1（細胞周期蛋白B1）、細胞增殖和促炎因子（IL-6和TNF- σ?α?α?α?α ）水平升高等，增加小鼠DEN（二乙基亞硝胺）致癌敏感性[19]。由此可見， Per2 為動物體內抑癌基因，過表達可抑制HCC增殖，導致細胞周期停滯，減緩癌細胞的分裂速率，加快凋亡。相反， Per2 突變可加速HCC進展，導致不良預后。

2.3.3Cry基因Cry基因在DNA損傷修復和維持基因組穩定中扮演重要角色。研究發現，Cry1、Cry2在HCC組織中的表達均降低，可能導致癌細胞增殖失控和凋亡抑制，進而增加HCC生長和轉移風險[20]。然而，單純Cry基因缺失（ Cry^-/- 并不增加小鼠患自發性或電輻射誘發癌癥的風險，表明其功能障礙不直接損害DNA損傷檢查點或阻礙DNA損傷修復。研究發現，Cry基因與p53存在協同作用，可通過激活 p53 介導的轉錄，誘導HCC細胞周期停滯和凋亡[21]。在DNA損傷檢查點和修復功能正常的情況下，與單純 p53 突變 （p53^-1- 的小鼠細胞相比，同時缺失p53和Cry基因的小鼠在接受奧沙利鉑治療后，細胞凋亡更為顯著并停止生長，而 p53^-1- 小鼠的腫瘤則繼續增殖[22]。此外， Cry2 表達水平降低與HCC患者生存期成正比，提示Cry基因有望作為評估HCC預后的獨立標志物[23]

2.3.4BMAL1基因BMAL1是生物鐘系統的核心組成部分，在維持人體正常代謝節律方面起著不可或缺的作用。肝臟作為人體脂質代謝重要場所，BMAL1缺失?BMAL1^-′- ）可導致脂質代謝紊亂，具體表現為增強脂質分解代謝而減弱合成代謝，即肝細胞傾向于分解機體內儲存的脂質，而非參與合成、轉運新的脂質和脂肪酸氧化，將顯著增加代謝相關脂肪性肝病相關HCC風險[24]。此外，BMAL1在維持細胞周期穩定方面發揮重要作用。BMAL1功能障礙可導致細胞周期S期延長，M期節律喪失，但DNA合成峰仍存在，表明可能同時存在其他控制DNA合成的因素。進一步研究發現，BMAL1小鼠的細胞周期蛋白A2、細胞分裂周期基因2及CCNB1的表達節律基本消失，提示BMAL1可控制肝細胞分裂時間，進而影響HCC發展。此外，BMAL1低表達與腫瘤分期及預后呈正相關[25]。因此，構建BMAL1與不同腫瘤標志物（AFP、ctDNA、CEA等）的評估模型，或將有助于輔助早期惡性腫瘤診斷，但由于基因表達模式的多樣性，個體差異大，需進一步研究驗證BMAL1作為診斷、預后標志物的可能性。

2.3.5其他基因神經元PAS結構域蛋白2（neuronalPASdomainprotein2，NPAS2）REV-ERB以及TIM蛋白（timelesscircadianregulator，TIMELESS）等基因功能失調亦可通過影響不同調控通路影響腫瘤進程，發揮抗癌或促癌作用。在一項針對接受TACE（經導管動脈栓塞化療）治療的HCC患者研究中，NPAS2基因的單核昔酸多態性（rs1053096、rs2305160）被證實與患者死亡風險顯著增加密切相關，此外，NPAS2過表達可激活CDC25A（細胞分裂周期25A）、抑制CDK2/4/6（細胞周期蛋白依賴激酶2/4/6）和Bcl-2（B細胞淋巴瘤2）磷酸化，加快HCC 細胞分裂[26]。而TIMELESS在HCC中表達顯著上調，通過抑制 p53 的表達促進細胞糖酵解并抑制氧化磷酸化，進而促進癌細胞增殖。相反，REV-ERB過表達可抑制HCC細胞的生長和擴散，其激動劑在臨床前研究中顯示出抑癌潛力。

綜上所述，生物鐘基因可通過直接或間接調控細胞周期，促進肝癌細胞的增殖、侵襲（表1），而靶向生物鐘基因的表達、調控或許將成為抑制腫瘤惡化、改善患者預后的潛在策略。

表1生物鐘基因在肝癌發生發展中的作用機制Table1The mechanism of clock genes in the tumorigenesis and development of hepatocellular carcinoma

3生物鐘作為HCC預后指標

HCC早期發現與治療對患者預后至關重要。AFP、AFP異質體百分比和異常凝血酶原是臨床常用的肝癌診斷及預后評估指標，但其敏感性和特異性尚未達到臨床診療需求[27-28]。研究表明，生物鐘基因的改變與HCC的預后密切相關，其中，PER2、TIMLESS表達水平與HCC生存率呈負相關，而Cry2、PER1和RORA、BMAL1、NPAS2則與預后不良呈正相關[29]。因此，通過檢測生物鐘基因表達水平，可為HCC的預后評估提供重要參考依據，有助于為患者制訂更加個體化的治療方案?；诖耍醒芯咳藛T通過檢驗Cry2、PER1、RORA和TIMELESS在HCC組織中的mRNA水平，結合TNM腫瘤分期和性別2個風險因素構建了HCC預后預測模型，根據風險評分中位數結果，將患者分為高危組與低危組，預測HCC患者的 0S^[30] 。進一步研究發現，高危組與細胞增殖、DNA損傷應答、代謝和腫瘤突變負荷相關。除了核心生物鐘基因，不少生物鐘相關基因在HCC細胞中也表現出較大差異，在作為HCC預后指標方面表現出一定的研究價值。Liu等[31將篩選的在HCC中異常表達的生物鐘相關基因進行富集分析、計數、分組，觀察到大多數免疫細胞（B淋巴細胞、 CD4⁺T 淋巴細胞、 CD8⁺T 淋巴細胞、自然殺傷細胞等）分布在高分組中，表明HCC患者免疫細胞與生物鐘基因緊密相關，即TME中的免疫細胞受晝夜節律調控。在此基礎上，研究人員進一步驗證了部分生物鐘相關基因（RPL29、PFKFB3、RPS7、SLC6A6和RPLP2）與HCC預后之間的相關性，發現高分組患者OS明顯短于低分組，提示生物鐘基因表達失調與HCC患者的差異性預后有關。值得一提的是，CRRG表達上調不僅促進了固有和適應性免疫細胞比例增加，且與免疫治療效果反應呈負相關。腫瘤浸潤淋巴細胞的活性和數量與實體瘤生長及免疫治療效果密切相關。TME中多種免疫細胞存在晝夜波動，如 CD8⁺T 淋巴細胞的抗腫瘤作用在早晨更強，早晨輸注嵌合抗原受體T淋巴細胞免疫藥物或免疫檢查點阻斷劑可提高非小細胞肺癌患者OS，實現更好的治療效果[32]。綜上所述，生物鐘或可通過免疫調節影響腫瘤預后及治療，為未來HCC的診療提供了新的思路和方向。

4生物鐘協助HCC治療

4.1時間療法生物鐘不僅調控人體正常生理代謝過程，還參與多種外源性化合物（包括臨床藥物、真菌毒素和環境污染物）的代謝和轉運過程。生物鐘基因可直接或間接調控藥物代謝酶和轉運體，例如BMAL1可調節腸道MRP2（多藥耐藥相關蛋白2）的表達及甲氨蝶呤轉運活性，而REV-ERBα通過直接結合RORE位點抑制SLC7A11（溶質載體家族7成員11）的轉錄，進而促進鐵死亡[33]

時間療法是通過選擇最佳給藥時間，使藥物釋放、代謝與人體的自然節律保持一致的治療方法[34]，有助于提高藥物治療效果，同時減少副作用和相關風險。早期一項關于卵巢癌的化療試驗顯示，與接受常規時間阿霉素和順鉑治療的受試者相比，接受時辰化療方案（早晨輸注阿霉素和夜晚輸注順鉑）患者的5年生存率提高了4倍，展現出時間療法在特定癌癥治療中的應用價值[35]。但現有證據顯示，時辰化療方案并非對所有癌癥均有優勢，且后續的大型多中心研究并未證實上述報告的結論。為進一步驗證時間療法在癌癥治療中的潛力，確定腫瘤與正常組織之間的晝夜節律關系至關重要，而達到這一目標尚需更多的臨床研究探索生物鐘與治療靶點之間的相互作用，已明確最佳治療時機。

4.2褪黑素褪黑素是大腦松果體分泌的重要激素，近年來在HCC治療中展現出潛在價值。研究發現，褪黑素攝入量與HCC發病率呈負相關，聯合TACE治療可顯著提高晚期HCC患者生存率。由于褪黑素分泌具有晝夜節律性，因此，調節生物鐘或可延緩HCC進展[36]。研究證實，0.001mol/L 濃度的褪黑素即可顯著抑制HepG2細胞增殖，誘導細胞周期阻滯于G0/G1期，同時上調p53基因表達并下調多種炎癥介質（腫瘤壞死因子、前列腺素、巨噬細胞炎癥蛋白等）水平，尤其是IL-7和IL-13。上述結果表明，褪黑素補充劑可直接調節生物鐘，達到抗腫瘤增殖作用[37]。此外，褪黑素可促進腫瘤細胞凋亡并增強化療藥物敏感性，提示其可能作為輔助治療藥物降低常規抗癌藥物的劑量需求和毒副作用[38]?？傮w而言，褪黑素是一種安全性良好且具有轉化潛力的HCC治療候選藥物。

4.3生物鐘調節劑目前，生物鐘相關小分子調節劑可分為兩類：一類是調控生物鐘基因活性的藥物，另一類是間接影響生物鐘基因表達的調節劑。在哺乳動物TTFL中，泛素連接酶F-box亮氨酸重復蛋白3通過形成Skp1-Cul1-F-box復合物識別、泛素化和降解Cry基因，Cry蛋白活化劑KL001可干擾兩者相互作用，抑制Cry的泛素化和降解，從而延長晝夜節律周期。Cry在多數肝病中下調，研究發現對乙酰氨基酚聯合KL001治療可維持Cry穩定表達，降低肝活性氧水平，提高抗氧化能力，減輕乙酰氨基酚誘導的肝損傷，提示其或可用于預防HCC治療藥物所致的肝損傷[39]。目前，KL001已進入臨床I期試驗（NCT06119659、NCT06125756），用于治療重癥血友病B，但尚未報告研究結果。

另有研究篩選出多種Cry調節劑（SHP656、KL101、KS15、GO214、TH301等），相比KL001更為強效。其中，KS15（Cry抑制劑）聯合SR8278（REV-ERBα拮抗劑）可上調WEE1和p21表達，減輕順鉑誘導的DNA損傷并促進細胞修復，減輕化療期間不良反應，展現出生物鐘調節劑在輔助治療HCC方面的獨特優勢[40]。此外，REV-ERB特異性激動劑（SR9009、SR9011）對多種癌細胞（結腸癌、乳腺癌等）具有高度選擇性的細胞毒性，在同等的濃度下對正常細胞幾乎不具有毒性，展現廣譜抗腫瘤的應用潛力[41]。然而，目前關于治療HCC的生物鐘相關小分子調節劑體內外試驗較少，尚無充足的證據證明生物鐘調節劑在協助治療HCC方面一定具有良好的效果。

5小結與展望

生物鐘基因在肝癌預后評估及治療中的應用前景廣闊，但生物鐘基因在肝癌中復雜的調控通路尚未完全闡明，單一靶點干預可能并不能達到預期療效，甚至引發副作用。未來仍需結合基因組學、轉錄組學等多組學技術，深人解析生物鐘基因在肝癌中的精準調控機制，并進一步開展靶向生物鐘基因的藥物研發和臨床試驗，探索新的切實可行的治療策略和方法，實現對HCC患者的個性化治療，改善其生存質量及預后。隨著技術進步與研究深入，生物鐘基因有望為肝癌的防治工作帶來新的希望和機遇。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：孔亞楠負責查閱文獻，撰寫論文；劉江凱負責指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-12-31：錄用日期：2025-02-20本文編輯：邢翔宇引證本 文： KONG YN，LIU JK.Research advances incircadianclockgenesinthedevelopment，progression，andtreatment of liver cancer[J].J Clin Hepatol，2025，41（7）：1431-1436.孔亞楠，劉江凱.生物鐘基因在肝癌發生發展與治療中的研究進展[J].臨床肝膽病雜志，2025，41（7）：1431-1436.