牙髓間充質干細胞治療自身免疫性肝炎小鼠模型的效果及其免疫調控機制

Abstract：ObjectiveToinvestigate the therapeuticefectofdentalpulpstemcells（DPSCs）onautoimmunehepatisininvivo andinvitro experimentsandtherelated mechanism.MethodsAninvitroco-culturesystemwasusedtoevaluate the immunoregulatory efectof DPSCs，and32 mice wererandomlydividedinto healthycontrol group，modelgroup，positivedrug group，and DPSCs treatment group，with8 mice ineach group.The serum levelsof alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），andinflammatoryfactors weremeasured，andHEstainingwasused toassessliverpathologicalinjuryAn analysisofvariance wasusedforcomparisonof normalldistributed continuous data between multiplegroups，and the least significant difference t -test was used for further comparison between two groups.ResultsThe in vitro experiment showed that the positive rates of CD105，CD73，and CD90in DPSCswere 99.97% ， 100% ，and 99.53% ，respectively，while the positive ratesof CD34，HLA-DR，and CD45were 0.56% ， 0.17% ，and O，respectively.DPSCs significantly inhibited the proliferation of Th1 and Th17 subsets，with inhibition rates of 31.32% and 45.76% ，respectively；DPSCs promoted the proliferation of Treg （CD4+CD25FoxP3+）， with a promoting rate of 52.29% . DPSCs had an inhibition rate of 93.70% on the proliferation of lymphocytes.In the mouse model of autoimmunehepatitis，comparedwiththe modelgroup，theDPSCs treatment grouphadsignificantreductions intheserumlevelsof ALTand AST，with reduction rates of 66.8% and 60.0% ，respectively（ t=3.321 and 2.907， P =0.0075andO.0175）andsignificant reductions in the inflammatory factors tumor necrosis factor- α and interleukin- 1β ，with reduction ratesof 57.5% and 71.3% ， respectively （t=2.484 and 2.796， P =0.039 8 and O.O20 6），and histopathological examination showed no significant improvement in periportal bridging necrosis （ t=1.969 ， P =0.098）.ConclusionDPSCs effectively alleviate immune-mediated liver injury through immunoregulation，which provides an experimental basis forclinical translation.

Key words：Mesenchymal Stem Cels；Dental Pulp;Hepatitis，Autoimmune；Mice，InbredBALBC；Immunoregulation

Research funding：Beijing Nova Program（20220484166）

自身免疫性肝炎（autoimmunehepatitis，AIH）是一種由自身免疫異常導致的肝臟炎癥性疾病，多發(fā)于女性，其臨床表現(xiàn)通常為轉氨酶升高、自身抗體如抗核抗體及平滑肌抗體等檢測陽性、IgG水平升高，病理方面表現(xiàn)為巨噬細胞和漿細胞增多，肝組織中淋巴細胞浸潤形成界面性肝炎[1]。現(xiàn)有AIH的一線治療為糖皮質激素（潑尼松/潑尼松龍）聯(lián)合硫唑嘌呤[2]。然而，有 20% 患者對標準治療應答不佳，且長期使用可導致骨質疏松、代謝綜合征等疾病發(fā)生；同時，基線堿性磷酸酶升高者停藥后復發(fā)風險增加，需終身監(jiān)測[3]。

間充質干細胞（mesenchymal stemcell，MSC）最早在成人骨髓中被發(fā)現(xiàn)，是一種黏附的成纖維細胞樣群體[4-5]。MSC具有與多種免疫系統(tǒng)細胞相互作用的免疫調節(jié)特性，包括對T細胞[6-7]、B細胞[8]、樹突狀細胞[9-10]和自然殺傷細胞[1等的免疫抑制作用。當暴露于炎癥環(huán)境中時，MSC可以通過釋放多種介質（包括免疫抑制分子、生長因子、外泌體、趨化因子、補體成分和各種代謝產(chǎn)物）來協(xié)調局部及全身的先天性和適應性免疫反應[12-13]牙髓間充質干細胞（dentalpulpstemcell，DPSC）作為一種獨特的干細胞來源，正在被探索用于細胞醫(yī)學、組織再生和各種疾病的組織工程[14-18]。DPSC可通過分泌IL-10、轉化生長因子（TGF）-β等抗炎因子抑制T細胞活化，并分化為肝細胞、成骨細胞等多種功能細胞[19]。在治療機制上，DPSC主要通過抑制增殖活化的淋巴細胞和促進調節(jié)性T細胞（ Treg） 的形成。體外研究表明，PHA-CD3⁺ T細胞相關的旁分泌機制中的可溶性因子和細胞因子等具有免疫抑制效應[20]

刀豆蛋白A（ConA）誘導的小鼠肝炎是經(jīng)典的T細胞依賴性肝炎模型。該模型在臨床表現(xiàn)和組織病理學特征（如肝細胞壞死、炎癥細胞浸潤）方面與人類AIH高度相似。靜脈注射ConA后，活化的T細胞和巨噬細胞會釋放大量炎癥因子[如腫瘤壞死因子（TNF）- σ?α∝ 、干擾素（IFN）- ，導致肝損傷，表現(xiàn)為血清ALT和AST顯著升高，這些指標變化同樣是人類AIH的重要特征。已有研究表明在小鼠模型中DPSC在逆轉肝臟炎癥和逆轉肝纖維化方面與臍帶血來源的MSC有類似的治療效果[21]。另一項研究也揭示了DPSC在體內(nèi)具有抗纖維化和抗炎作用以及促進肝源性相關肝再生的作用[22]。本研究旨在通過體內(nèi)外實驗驗證DPSC對自身免疫性肝損傷小鼠模型的療效及其免疫調控作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物、材料和儀器實驗動物選用質量 20～ 25g 的雄性8周齡BALB/C小鼠32只，均購自上海靈暢生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2023-0003，動物使用許可證號：SYXK（滬）2020-0034。牙髓來源于患者捐贈。藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范（GMP）級MSC無血清培養(yǎng)基購自友康生物科技（北京）股份有限公司；GMP級MSC無血清培養(yǎng)基添加劑購自友康生物科技（北京）股份有限公司；外周血單核細胞（PBMC）購自浙江自貿(mào)區(qū)邁順生物科技有限公司；羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）細胞增殖試劑盒購自美國ThermoFisher；DxFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼公司。anti-CD34、anti-HLA-DR、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105、anti-CD73、anti-CD8、anti-IFN- y、 anti-IL-17A、anti-CD25和anti-FoxP3均購自美國Biolegend公司。三系分化培養(yǎng)基及其添加物購自加拿大Stemcell公司。絲裂霉素C購自美國Sigma公司。

1.2DPSC的分離與培養(yǎng)取出患者捐贈牙齒中的牙髓后進行消化和培養(yǎng)，培養(yǎng)液為包含GMP級MSC無血清培養(yǎng)基添加劑的GMP級MSC無血清培養(yǎng)基。

1.3細胞表型測試將DPSC重懸于PBS溶液中，細胞密度調整為 2×10⁶ 個 /mL ，分成6管，每個待測管中加入200μL 細胞懸液，分別加入anti-CD34、anti-HLA-DR、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105和anti-CD73，室溫孵育20min 。孵育結束后PBS洗2次，行流式細胞儀檢測，以上實驗均需避光操作。

1.4三系分化檢測成骨分化：將DPSC按每孔 5×10⁴ 個細胞加人六孔板中，置于培養(yǎng)箱中直至細胞匯合度達到約 70% ，吸棄干細胞培養(yǎng)基，加入成骨分化培養(yǎng)基（4倍體積基礎培養(yǎng)基 +1 倍體積的添加物），繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，直至顯微鏡下觀察到骨基質形成，使用茜素紅進行染色觀察。

成脂分化：將DPSC按每孔 5×10⁴ 個細胞加入六孔板中，置于培養(yǎng)箱中直至細胞匯合度達到約 100% ，吸棄干細胞培養(yǎng)基，加入成脂分化培養(yǎng)基（4倍體積基礎培養(yǎng)基 + 1倍體積的添加物），繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，直至顯微鏡下觀察到油滴，繼續(xù)培養(yǎng)6天，使用油紅O染色。

成軟骨分化：取消化后的DPSC約 5×10⁵ 個細胞離心并重懸于成軟骨分化培養(yǎng)基（4倍體積基礎培養(yǎng)基 +1 倍體積的添加物）中，將含細胞的離心管置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天進行一次半換液，直至細胞形成軟骨球后切片，使用阿利新藍染色。

1.5輔助性T細胞 （Th）1，Th17 增殖抑制實驗空白刺激組在12孔細胞培養(yǎng)板中加入PBMC、PHA（總濃度 2.5μg/mL ）IL-2（終濃度 50U/mL ），實驗組將DPSC接種六孔板過夜孵育后加入終濃度 5μg/mL 的絲裂霉素C處理 ^2h ，與PBMC共孵育 48～72h ，加人終濃度 2.5μg/mL 的PHA作為刺激劑培養(yǎng)4～6h后，收集細胞懸液離心后重懸，加入anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8室溫避光孵育 20min ，PBS清洗2次，加入固定破膜液， 2～8^°C 避光孵育 20min 破膜液清洗2次，加人anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8、anti-IFN-γ 和anti-IL-17A，2～8℃避光孵育 30min ，孵育結束后使用破膜液清洗2次，PBS重懸，進行流式細胞儀檢測。

1.6Treg增殖促進實驗單培養(yǎng)組在12孔細胞培養(yǎng)板中加人PBMC，共培養(yǎng)組將DPSC接種六孔板過夜孵育后加入絲裂霉素C處理 2h ，與PBMC共孵育 48～72h ，收集細胞懸液離心后重懸，加入CD3、CD4、CD25室溫避光孵育 20min ，PBS清洗2次，加入固定破膜液， 2～8^°C 避光孵育 45min ，破膜液清洗2次，加入anti-CD3、anti-CD4、anti-CD25和anti-FoxP3，2～8℃避光孵育 30min 孵育結束后使用破膜液清洗2次，PBS重懸，進行流式細胞儀檢測。

1.7淋巴細胞增殖抑制實驗標記刺激組為 PBMC⁺ CFSE（終濃度 5μmol/L）+PHA+IL-2 ，實驗組將DPSC接種六孔板過夜孵育后加入絲裂霉素C處理 ^2h ，與用CFSE標記的PBMC共孵育 48～72h ，收集細胞懸液離心后PBS重懸，進行流式細胞儀檢測。

1.8實驗動物分組32只小鼠在造模前1天，按照各組之間差異體質量最小的原則隨機分成4組：健康對照組（G1組）模型組（G2組）陽性藥物組（G3組）干細胞治療組（G4組），每組8只小鼠。

1.9ConA誘導造模及給藥給予ConA造模的當天設定為第0天 （0h） 。 G2～G4 組動物在第0天 （0h） 通過尾靜脈注射 20mg/kgConA 誘導小鼠免疫性肝損傷，建立AIH模型；G1組按照同樣的方式和劑量注射PBS。G3組：在ConA造模前 2h 給予 150mg/kgNAC （N-乙酰半胱氨酸）；G4組：在ConA造模后1h尾靜脈給予干細胞注射液 1×10⁶ 個細胞/只小鼠。所有小鼠在ConA誘導造模 8h 后，進行終點取材。收集動物血清和肝臟樣品。血清樣品在收集后快速冷凍并保存在 -80^°C 冰箱中，用于體外血生化指標檢測。肝組織樣品分成2份，1份用液氮快速冷凍后保存在 -80^°C 冰箱中用于體外檢測使用；1份用福爾馬林固定后用于病理分析。

1.10血清生物標志物檢測按照試劑盒的說明檢測ALT、AST、TBil、IL-6、TNF- σ?α∝ 、IL-1β的水平。將所有試劑置于室溫，用 200μL 孔的WashBuffer洗滌3次。每孔加人 50μL 制備好的樣品，用黏接板密封，在搖床上室溫孵育 2h 。用 200μL 孔的WashBuffer洗滌3次。每孔加入25μL 檢測抗體溶液，用黏接板密封，在搖床上室溫孵育^2h 。用 200μL/ 孔的WashBuffer洗滌3次。每孔加入150μL 2× ReadbufferT，在MSD儀器上進行分析。上述所有血清生物標志物檢測均重復3次，取平均值。

1.11組織病理學分析所有肝臟樣品均通過脫水儀器（LeicaHistoCorePearl-0348）脫水，然后使用石蠟包埋機進行包埋，再通過LeciaRM2245機器將嵌入的肝臟樣品切片。切片HE染色后，由病理專家對樣品進行慢性肝損傷單盲評分，包含門靜脈周橋接壞死、小葉內(nèi)肝細胞變性和局灶性壞死、匯管區(qū)炎癥、纖維化四個維度，按嚴重程度進行綜合評分。

1.12統(tǒng)計學方法采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1DPSC的分離、培養(yǎng)與鑒定本實驗自牙髓組織中分離獲得PBMC（圖1a），在培養(yǎng)過程中呈梭形且螺旋生長的細胞形態(tài)（圖1b）。流式細胞儀檢測結果顯示，DPSC的CD105、CD73和CD90表達陽性，陽性率分別為99.97% / 100% 和 99.53% ；而CD34、HLA-DR和CD45表達為陰性，陽性率分別為 0.56%.0.17% 和0（圖2），符合MSC的特征。成骨誘導發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，有明顯的紅色鈣結節(jié)組織；成脂分化顯示DPSC周圍出現(xiàn)空泡狀的脂滴，脂滴呈現(xiàn)橘紅色；成軟骨分化中，細胞內(nèi)縮脫落呈現(xiàn)為軟骨球，培養(yǎng)后切片染色，顯示藍色的軟骨組織（圖3）。

2.2DPSC的體外免疫調節(jié)作用流式細胞儀檢測結果顯示，與對應的空白刺激組相比，DPSC與PBMC共培養(yǎng)后Th1（CD4⁺IFNγ⁺ 的增殖抑制率為 31.32% （ 15.36% VS 10.55% ）

（圖 4a） ，Th17（ 的增殖抑制率為 45.76% （ 1.18% VS 0.64% ）（圖4b）。與對應的單培養(yǎng)組相比，DPSC處理后 Treg（CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺） 的增殖促進率為 52.29% （ 1.09% VS 1.66% ）圖 ^4c ），即干細胞可顯著促進Treg細胞增殖。對應的，與刺激后的PBMC培養(yǎng)組相比，DPSC與刺激后PBMC共培養(yǎng)使PBMC出現(xiàn)明顯增殖抑制（圖4d），對淋巴細胞的增殖抑制率為 93.70%（52.72% VS 3.32% ）。

圖1DPSC的培養(yǎng)與鑒定

Figure1 Cultivation and identification of DPSC

圖2DPSC鑒定的流式細胞儀結果

Figure2FlowcytometryresultsofDPSCidentification

圖3DPSC的三系分化能力

2.3DPSC在小鼠模型中對肝臟及外周免疫炎癥的作用實驗流程圖如圖5所示。與G1組相比，ConA造模各組（G2～G4組）的體質量無明顯變化（ P=0.468） （圖6a）。與G1組相比，各模型組（G2～G4組）的肝質量增加（ P= 0.047）；與G2組相比，G4組小鼠肝質量顯著降低（ Plt; 0.05），說明干細胞治療可一定程度改善肝損傷（圖6b）。如圖7所示，與G1組相比，G2組的肝功能相關指標ALT和AST水平顯著升高（ P 值均 lt;0.001 ），同時炎癥相關因子TNF- σ?α∝ 和IL-1β也顯著上升（ P 值均 lt;0.001 ），提示ConA通過激活T細胞和NKT細胞，以及釋放相應促炎因子，造成免疫性肝損傷。在ConA建模1h后實施干細胞治療，發(fā)現(xiàn)ALT和AST分別降低 66.8% 和 60.0% （t值分別為 3.321，2.907，P 值分別為 0.0075，0.0175 ，TNF- α_?∝ 和IL-1β分別下降 57.5% 和 71.3% （t值分別為2.484、2.796，P 值分別為 0.039 8.0.020 6 ，該結果提示干細胞通過免疫調節(jié)作用降低促炎因子釋放，減輕炎癥反應，保護了小鼠的肝細胞功能。

2.4DPSC在小鼠模型中對免疫病理損傷的作用與G1組相比，G2組的門靜脈周橋接出現(xiàn)廣泛壞死。在ConA建模 ^1h 后實施干細胞治療，門靜脈周橋接壞死無顯著變化 （t=1.969，P=0.098） （圖8）。

3討論

MSC的來源廣泛，在牙齒、脂肪、臍帶、骨髓等多種組織中均可提取擴增，具有良好的自我增殖與多向分化潛能，在過繼細胞療法中，其免疫原性低，治療風險小，副作用少，在臨床中的應用日漸廣泛。

圖6干細胞治療前后小鼠體質量和肝質量變化 Figure6Changes inbodyweight and liver weight of mice beforeand after stemcell treatment

圖8各組小鼠肝組織病理學結果

Figure8The histopathologyresults of liver tissues in each group of mice

課題組前期研究對比了DPSC與人骨髓MSC或人臍帶MSC在免疫調節(jié)方面的差異，并通過轉錄組測序的方法發(fā)現(xiàn)DPSC具有較強的免疫調節(jié)能力，通過免疫細胞招募評分可知DPSC對各種免疫細胞的趨化性比臍帶干細胞更強且更廣泛，尤其表現(xiàn)在對Th17、Th22和Treg的影響[23]。經(jīng)過體外驗證，研究者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后的DPSC符合MSC的表型特征，與免疫細胞共培養(yǎng)過程中顯示出對促炎相關群體如Th1、Th17的明顯抑制，抑制率分別達到 31.32% 和 45.76% ，該調控作用同時體現(xiàn)在對Treg群體的增殖促進，促進率達 52.29% 。這種對不同類型T細胞亞群的精準調控作用充分顯示DPSC精細的免疫調節(jié)能力。從免疫調節(jié)作用方面，Th1通過分泌IFN- ?γ 等細胞因子參與細胞免疫反應，在AIH的發(fā)病過程中，其過度激活可導致肝細胞受損；Th17則在炎癥反應和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演關鍵角色，其分泌的IL-17能夠招募中性粒細胞至炎癥部位，加劇肝臟炎癥反應；而Treg作為維持免疫耐受的關鍵細胞群，能夠通過多種機制抑制過度的免疫反應，其數(shù)量和功能的增強有助于恢復免疫平衡。DPSC對這些細胞亞群的調節(jié)作用，可能通過分泌多種細胞因子和趨化因子，以及與免疫細胞的直接接觸等方式實現(xiàn)，從而在細胞水平上減輕肝臟炎癥。

在ConA誘導的免疫性肝損傷小鼠模型中，DPSC干預組表現(xiàn)出顯著的護肝效應，不僅顯著降低血清ALT、AST水平，還有效抑制促炎因子（TNF- σ?α∝ IL-1β）表達，并具有緩解門靜脈周橋接壞死等組織損傷的趨勢，進一步驗證其抗炎和免疫調節(jié)作用。TNF- α?α∝ 和IL-1β作為促炎性細胞因子，在免疫性肝損傷中起著核心作用，其過度表達可激活肝內(nèi)多種細胞，引發(fā)一系列炎癥反應，加重肝細胞損傷。DPSC可能通過分泌抗炎因子如IL-10、TGF-β等，抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，阻斷炎癥信號通路的傳導，從而減輕肝臟炎癥反應。此外，DPSC還可能通過調節(jié)肝臟局部免疫微環(huán)境，促進肝臟組織自我修復和再生。

從組織病理學角度分析，經(jīng)DPSC治療后，門靜脈周橋接壞死情況與造模組相比雖無統(tǒng)計學差異，但其病理損傷程度有好轉的趨勢。這表明DPSC不僅在分子和細胞水平上發(fā)揮作用，還能在組織層面有效緩解肝臟損傷，促進肝臟結構的修復和再生。肝臟損傷后的修復過程涉及多種細胞類型和復雜的細胞信號通路，DPSC可能通過分泌細胞外基質成分、生長因子等，促進肝細胞的增殖和分化，改善肝臟組織的結構和功能。

綜上所述，DPSC在自身免疫領域已經(jīng)取得部分進展，但臨床應用治療AIH仍需進一步探索，尤其是在激素治療后效果較差或副反應較大的患者群體中療效亟需評價。基于其較強的免疫調節(jié)功能，其抑制肝臟炎癥反應的機制與調控淋巴細胞擴增，減少淋巴細胞浸潤等有密不可分的關系。與傳統(tǒng)治療方法相比，DPSC治療具有獨特的優(yōu)勢。其來源便捷，可從拔除的智齒或脫落的乳牙中獲取，避免了傳統(tǒng)骨髓來源干細胞的有創(chuàng)采集過程，減少了患者的痛苦和風險。同時，DPSC具有更強的增殖能力和免疫調節(jié)活性，這在體內(nèi)外實驗中已經(jīng)驗證。此外，DPSC的免疫原性較低，不表達MHC-II分子，這使其在異體移植時不太可能引發(fā)強烈的免疫排斥反應，拓寬了其臨床應用的前景。

盡管本研究取得了積極的成果，但仍存在一些局限性和需要進一步探討的問題。首先，動物模型與人類AIH在病理生理機制上存在差異，DPSC在人體內(nèi)的療效和安全性仍需通過臨床試驗進行驗證。其次，本研究主要關注了DPSC對肝臟炎癥的短期調節(jié)作用，但對于其在肝纖維化、肝細胞再生等方面的長期影響尚未深入探討。此外，DPSC的最佳給藥劑量、給藥時間、治療療程等臨床應用關鍵問題，也有待進一步研究明確。未來的研究應進一步優(yōu)化實驗設計，深人探索DPSC的作用機制和臨床應用策略，以期為AIH患者帶來更有效的治療方案。

倫理學聲明：本研究方案于2023年6月14日經(jīng)由首都醫(yī)科大學附屬北京積水潭醫(yī)院動物研究委員會批準，批號：202306006，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：李茵負責設計論文框架，起草論文；宋光元負責實驗操作，研究過程的實施；李曉東負責數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計學分析、繪制圖表；史婉婉負責論文修改；王貴強負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2025-05-26：錄用日期：2025-06-26本文編輯：王亞南

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