模塊化高效CRISPR載體組裝與蘋果基因編輯效率評價體系構建

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）08-1871-1.

Abstract： 【Objective】 The CRISPR/Cas gene editing technology has demonstrated a broad application prospect for diverse applications in genetic improvement programs targeting apple （Malus domestica） and other perennial fruit crops. However， conventional gene editing systems exhibit critical limitations， including low eficiency vector assembly and inflexible modular architectures.We aim to develop a modular and eficient CRISPR vector system，optimize the Agrobacterium-mediated transient delivery system in apple plantlets，and establish a corresponding evaluation system for assessing the effciency of gene editing in apple. 【Methods】 The conventional vectors pUC19 （DNA cloning plasmid） and pHK2 （Dicotyledonous gene editing plasmid based on pCAMBIA1300 modification） were firstly modified by inserting a pair of type II S restriction enzyme sites （such as Esp3I or Bsa I etc.） into selected positions， to construct the intermediate vector pUC19-Esp3 I -Bb and the plant expression vector backthe Golden Gate cloning system respectively. Subsequently，the e35S promoter， SpyCas9 coding sequence and NOS terminator were amplified by PCR and seamlessly assembled into pUC19-Esp3 I -Bb vector to construct expression module A （e35S-Cas9-NOS）; For targeted editing of apple PDS （Phytoene desaturase） gene， the specific gRNA （guide RNA） sequence was designed and constructed expression module B （AtU6-gRNA） through PCR amplification using primers containing Bsa I restriction enzyme site; Based on the same strategy，the RUBY reporter element was amplified by primers with additional Bsa I restriction enzyme site to form expression module C.These three modules （A＼B＼C） were assembled with the plant expresson vector backbone pHK2-Bsa I -Bb using Golden Gate cloning technology， ultimately establishing the modular CRISPR gene editing system e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBY.This platform enables flexible replacement and rapid reconstruction of core components including Cas proteins， promoters，and gRNA expression cassetes，and establishes a system for visual detection of precise plasmid transfection by integrating the RUBY reporter system.【Results】We developed a modular vector assembly platform through strategic engineering of conventional plasmids pUC19 and pHK2.By employing type II S restriction enzyme sites （such as Esp3 I or Bsa I）， we constructed two core components： the intermediate vector （pUC19-Esp3 I -Bb） and the plant expresson vector backbone （pHK2-Bsa I -Bb）. The pUC19-Esp3 I -Bb vector enabled the integration of multiple DNA fragments into a single transcriptional module， generating intermediate constructs designated as pUC19- Module A/B/C.These modules were subsequently assembled into the plant expression vector backbone pHK2-Bsa I -Bb through a seamless cloning strategy. This system demonstrated exceptional modular compatibility， enabling seamless integration of multiple expression modules and rapid adaptation of the vector's functional components as required. To validate this system， we constructed three core modules： a Cas9 expression cassette was generated using pUC19-Esp3 I -Bb vector （e35S-Cas9-NOS，expression Module A）， a gRNA transcription unit （AtU6-gRNA，expression Module B），and a visual reporter system （RUBY， expression Module C）. Hierarchical assembly of these components into the plant expression vector backbone pHK2-Bsa I -Bb yielded a multifunctional CRISPR gene editing plasmid （e35SCas9-AtU6-gRNA-RUBY） that concurrently encoded genome-editing machinery and a transformation marker.This system significantly improves the efficiency of vector assembly by enabling concurrent integration of CRISPR/Cas components and reporter genes into a single binary expression plasmid. Beyond providing an optimized framework for plant gene editing vector construction， this platform allows for flexible adaptation of critical components （such as Cas proteins， guide RNAs and promoters etc.） in subsequent experimental studies， thereby accommodating species specific editing requirements across diverse plant systems. Functional validation revealed that the CRISPR gene editing plasmid e35S-Cas9- AtU6-gRNA-RUBY could be transiently expressed in tobacco and showed good visual indication function. Furthermore， vacuum infiltration mediated transient transformation of apple leaves confirmed PDS gene editing through RT-PCR amplification and Sanger sequencing of target loci， and preliminarily evaluated the editing effciency of gRNAs targeting the apple PDS gene.The experimental data demonstrated variable editing efficiencies among distinct gRNAs. Notably， gRNA variation in editing efficiency underscored the importance of pre-screening guide RNAs before stable transformation. Collectively， the vector system developed high transformation efficiency and accurate editing ability. These results establish a robust and adaptable vector platform that streamlines the construction of plant gene-editing vectors and provides a reliable toolkit for plant genome engineering.【Conclusion】 The modular vector system e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBY is based on Golden Gate technology，and has achieved the seamless assembly of multiple DNA fragments in a single reaction through the synergistic action of type I S restriction enzyme sites （such as Esp3 I or Bsa I etc.） and T4 DNA ligase.This significantly simplifies the operation process， shortens the time，and improves the efficiency and precision of the construction of gene editing vectors.This platform enables eficient and accurate seamless integration of multiple gene modules，serves as the primary vector framework for subsequent optimization of the apple gene editing system，and offers a novel solution for enhancing the efciency and operability of apple gene editing technology. It accommodates the flexible combination of gene editing requirements and provides a universal tool and methodological framework for advancing gene editing technology in other horticultural fruit crops.

Key words： Malus domestica; CRISPR/Cas system; Modular vector; Gene editing efficiency; Transient transformation

CRISPR/Cas基因編輯技術作為一種革命性的基因組編輯工具，憑借其高效性、靈活性和操作簡便性等特點，在農作物和果樹的產量提升、品質改良及抗病性增強等方面取得顯著成效，展現出廣闊的應用前景[n-2]。針對蘋果、葡萄、桃等果樹漫長的育種周期和復雜的遺傳特性，CRISPR技術能夠直接靶向目標基因實現精準編輯，加速性狀改良進程3。然而，蘋果再生周期長，基因組信息不夠全面，以及遺傳轉化體系尚未完全成熟，蘋果基因編輯研究的發展仍相對滯后。為突破這一技術瓶頸，亟須構建高效穩定的基因編輯體系，從而推動蘋果遺傳改良和基礎研究的深度發展[4]。

目前大多數植物基因編輯載體僅支持gRNA靶標序列的替換，而無法對啟動子、Cas蛋白等核心功能元件靈活替換[5]。GoldenGate、GibsonAssembly等新興克隆技術推動了植物表達載體工具箱的開發，例如MoClo、GreenGate和GoldenBraid等系統。這些工具箱依賴特定的載體與模塊庫，其固定化的拼接方法難以滿足果樹復雜基因組編輯的需求。傳統工具箱的模塊庫構建費時耗力，限制其在多樣化應用中的靈活性，且缺乏對復雜轉錄單元的高效組裝能力。常規載體缺乏針對這些元件的快速替換策略，導致編輯效率難以系統性優化，嚴重制約了基因編輯技術體系的適應性和擴展性。

在CRISPR/Cas9基因編輯系統中，sgRNA的選擇是影響編輯效率的關鍵因素。因此，在開展穩定遺傳轉化之前，需要初步評估sgRNA的編輯效率。目前編輯效率的檢測方法包括T7endonuclease1（T7E1）酶切法、同源重組檢測法（HR）、Sanger測序和高通量測序等技術體系[9-10]。近年來，瞬時表達系統被引入蘋果基因編輯研究中，用于快速評估sgRNA基因編輯效率[1I-2]。這種方法通過農桿菌介導的瞬時轉化技術，將CRISPR/Cas9系統直接轉化到蘋果葉片中，利用分子標記（如GFP熒光蛋白）進行目標位點的實時監測，顯著縮短了檢測周期。相比穩定轉化體系，瞬時轉化系統操作簡單、周期短，可在幾天內獲得編輯效率數據；此外，瞬時轉化的結果具有較高的可重復性，有助于快速篩選高效的基因編輯工具和優化編輯條件[13]。

開發模塊化高效的載體組裝方法，并結合靈活可靠的基因編輯效率評價體系，是優化果樹基因編輯工具的重要步驟。為解決上述問題，筆者構建了基于GoldenGate克隆技術的模塊化載體組裝系統，同時建立了高效的編輯效率評價體系。首先通過對傳統載體進行改造使其兼容GoldenGate，構建了分級組裝策略平臺，實現Cas蛋白、核定位信號（NLS）、啟動子及sgRNA表達盒等核心功能模塊的靈活替換，突破了傳統載體元件替換的局限性。其次，引入RUBY報告元件，通過顏色實現質粒轉染的可視化檢測[4。此外，結合蘋果葉片瞬時轉化體系，筆者系統評估不同sgRNA對蘋果PDS（Phytoenede-saturase）基因的編輯效率。該研究不僅為蘋果基因編輯技術的高效化和可操作性提供了全新的解決方案，更為其他果樹的基因編輯技術開發提供了通用的工具和方法框架，為果樹遺傳改良和精準育種奠定了堅實基礎。

1 材料和方法

1.1 載體骨架改造

pUC19-Esp3I-Bb：使用pUC19-F-BbsI和pUC19-R-BbsI引物（表1），對pUC19質粒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司，ZK102）進行PCR反向擴增線性化。使用lacZ-F-BbsI-Esp3I和lacZ-R-BbsI-Esp3I引物，擴增pUC19質粒中LacZ基因。PCR擴增體系為：KODOneMPCRMasterMix25μL ，上下游引物各 2μL ，質粒 2μL ，無菌水補至50μL 。反應程序為： 94^°C 預變性 2min 98^°C 變性 退火 延伸 20s，35 個循環；72^°C 終延伸 2min;4°C 保存。上述PCR產物純化后，兩者等量混合，使用 BbsI 限制性內切酶和T4DNA連接酶進行GoldenGate組裝，反應體系為：線性化pUC19片段 100ng，lacZ 片段 100ng，BbsI 內切酶20U，T4DNA連接酶 400U，10× 連接酶緩沖液2μL ，無菌水補至 20μL 。 37^°C 酶切 5min ， 16^°C 連接 5min ，重復30個循環，確保高效組裝。最終將反應產物轉化到大腸桿菌DH5a菌株，并接種Luria-Broth（LB）培養基（ 100mg L氨芐青霉素 ?24mg^?L^-1 IPTG及 40mg?L^-1X-gal） 。 37^°C 倒置過夜培養，篩選藍色菌落，獲得目標克隆，并測序驗證其正確性。

pHK2-BsaI-Bb：使用lacZ-pHK2-F-BbsI-BsaI和lacZ-pHK2-R-BbsI-BsaI引物，擴增pUC19質粒，獲得lacZ基因片段，PCR擴增體系和反應程序同上。PCR產物純化后用限制性內切酶BbsI單酶切進一步純化。隨后，將植物雙元表達質粒pHK2-Cas9-AtU6（武漢伯遠，REC43-I）用限制性內切酶HindI和EcoRI雙酶切，產物切膠并回收純化。將純化的lacZ基因片段與pHK2骨架等量混合，按照T4DNA連接酶反應流程（TakaraTomoy，2011A）， 16^°C 連接 4h 。最終將反應產物轉化到大腸桿菌 DH5α 菌株，并接種LB培養基 （50mg?L^-1 卡那霉素 .24mg?L^-1 IPTG及 40mg?L^-1X-gal ）。 37^°C 倒置過夜培養，篩選藍色菌落，獲得目標克隆，并測序驗證其正確性。

表1載體改造引物序列

Table1 Vector modification primersequences

注：GAGACG表示 Esp3I識別位點，GAAGAC表示 BbsI識別位點，GAGACC表示BsaI識別位點，下劃線表示切割位點。Note：GGACGidicatesEsp3identificatiositeGAAACindicatesbsidentificatiositeGAGCCindicatesBsaIidentifcatioiteand the underline indicates the cut site.

1.2 Cas9-AtU6-gRNA-RUBY質粒構建

使用GoldenGate引物設計在線網站（https：//goldengate.neb.com/）簡化引物設計。首先將pUC19-Esp3I-Bb載體序列輸入網站，參數中選擇Esp3I作為酶切位點。將增強型35S啟動子、spy-Cas9以及NOS終止子等片段序列，按照順序依次添加至軟件，自動生成帶有Esp3I酶切位點的3對引物，用以擴增啟動子、Cas蛋白以及終止子序列。3個擴增產物純化后，等量混合，酶切連接體系為：pUC19-Esp3I-Bb載體 100ng ，PCR混合產物 300ng Esp3I內切酶20U，T4DNA連接酶 400U，10× 連接酶緩沖液 2μL ，無菌水補至 20μL 。 37^°C 酶切 5min 16^°C 連接 5min ，重復30個循環，確保高效組裝。最終將反應產物轉化到大腸桿菌 DH5a 菌株，并接種LB培養基 100mg?L^-1 氨芐青霉素、 24mg?L^-1 IPTG及 40mg?L^-1X-gal） 。 37^°C 倒置過夜培養，篩選白色菌落，獲得目標克隆，并測序驗證其正確性，生成e35S-Cas9-NOSter表達元件（pUC19-ModuleA）。

參照前人報道1，構建靶向蘋果PDS（MD04G0021400）基因的AtU6-gRNA表達元件，并設計附加BsaI酶切位點引物（表2），將AtU6-gRNA從啟動子到polyT區域擴增，產生AtU6-gRNA表達元件（ModuleB）。以質粒35S：RUBY（Addgene#160908）為模板，設計附加BsaI酶切位點引物，擴增e35S-RUBY-HSPter區域，產生RUBY表達元件（ModuleC）。上述Module ΔA/B/C ，三者等量混合，使用BsaI限制性內切酶和T4DNA連接酶進行Golden Gate組裝，反應體系：ModuleA/B/C各 100ng pHK2-BsaI-Bb質粒 100ng，BsaI 內切酶20U，T4

表2質粒構建引物序列

Table2 Plasmid construction primer sequences

注：CGTCTC表示 Esp3I 識別位點，GGTCTC表示BsaI識別位點，下劃線表示切割位點。Note：CGTCTCindcatesEspIidentificationsite，GGCTCindicatesBsaIidentificationsiteandtheundelineindicatesthesite.

DNA連接酶 400U，10× 連接酶緩沖液 2μL ，無菌水補至 20μL 。 37^°C 酶切 5min，16^°C 連接 5min ，重復30個循環，確保高效組裝。最終將反應產物轉化到大腸桿菌 DH5a 菌株，并接種LB培養基 100mg?L^-1 氨芐青霉素、 .24mg?L^-1 IPTG及 40mg?L^-1X-gal?， ）37^°C 倒置過夜培養，篩選白色菌落，獲得目標克隆，并測序驗證其正確性。

1.3蘋果葉片瞬時表達系統優化

為了構建蘋果葉片的瞬時轉化體系，選取25dGala蘋果組培苗作為試驗材料。首先將基因編輯質粒轉化至GV3101（pSoup-p19）農桿菌，后續挑選陽性克隆接種于YEB液體培養基（ 50mg?L^-1 卡那霉素，30mg?L^-1 利福平）， 28^°C 過夜培養 （200r?min^-1） 。將培養液按 10% 比例轉接至新鮮培養基中，繼續擴大培養至 OD₆₀₀ 為 0.8～1.0 。離心收集菌體后，用等體積 10mmol?L^-1MES（pH=5.6） 緩沖液重懸，同時可加入 乙酰丁香酮和 0.01% Silwet L-77。將整棵植株浸泡到侵染液中，采用真空滲透法， -0.086MPa 真空處理 5min 并快速釋放壓力，3次重復。經無菌濾紙吸取表面殘留液體后，將植株轉入組培瓶中，在 26^°C 黑暗條件下靜置 24h ，繼而轉至弱光（ 16h 光 /8h 暗）條件下培養 72h ，隨后提取葉片RNA和DNA用于后續試驗。每次試驗設置3個組間重復，每個組別包括5株生物學重復。

1.4植物RNA提取以及檢測分析

分別采集瞬時轉化后的煙草和蘋果葉片的新鮮組織樣本，使用RNAEasyFast植物組織RNA快速提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取總RNA，并使用PrimeScriptMIV1ststrandcDNASyn-thesisMix（TaKaRa）反轉錄為cDNA。利用qRT-PCR對煙草葉片中RUBY報告元件進行表達量分析。qRT-PCR反應體系為：cDNA 1μL 2× ChamQUniversa SYBR qPCRMaster mix 5μL ，上下游引物各 1μL ，無菌水補至 10μL 。RUBY報告元件主要由CYP76AD1基因（CYP）、DODA基因、Glucosyltrans-ferase基因（Glu）三部分組成。以煙草Actin為內參基因，采用 2^-ΔΔcT 法進行RUBY的定量分析。使用RT-PCR檢測蘋果葉片中Cas9蛋白、gRNA以及RU-BY的表達情況。設計Cas9基因mRNA檢測引物Cas9-F、Cas9-R;gRNA檢測引物gRNA1-F、gRNA2-R;RUBY報告元件mRNA檢測引物DODA-F、DO-DA-R（表3）。擴增產物通過 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用GeIRed染料染色并在紫外光下觀察條帶，確定各個基因的表達情況。

1.5基因編輯效率檢測

使用植物基因組DNA提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司， ZP309. ），對葉片進行基因組DNA提取。使用NanoDrop分光光度計測定DNA質量濃度，稀釋至 20ng?μL^-1 。稀釋后的DNA樣品使用 2× RapidTaqPlusMasterMix聚合酶（諾唯贊生物科技股份有限公司，P223）和PDS特異檢測引物進行PCR反應（PDS-F：GTGTTTGCCCCTT-GAAGGTT;PDS-R：TGTCTCTGTTCCTTATGTTT-CCTTT）。PCR產物純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行Sanger測序，測序數據使用TIDE（https：//tide.nki.nl/）軟件進行分析。

表3引物序列及片段長度

Table3Primersequencesand fragmentlength

1.6數據分析

使用Excel2019對試驗數據進行統計，利用IBMSPSS23.0軟件對試驗數據進行差異顯著性分析，使用GraphPadPrismv9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1模塊化載體實現多個表達單元無縫整合

筆者在本研究中的思路是通過改造常規質粒載體，在選定的位置插入一對Esp3I或BsaI等IIS型限制性內切酶位點，將傳統質粒改造為兼容GoldenGate技術的升級版質粒。IIS型限制性內切酶可在遠離其識別序列的位置裂解DNA，并產生黏性末端，從而有序并同時無縫組裝多個片段。pUC19是一種常見的DNA克隆質粒，含有LacZ基因，提供藍白斑篩選功能，便于插入片段的鑒定。pHK2是基于pCAMBIA1300改造的適用于雙子葉植物基因編輯載體，雖然已攜帶Cas9和gRNA表達元件，但是無法對啟動子、Cas蛋白、核定位信號、終止子等元件靈活替換。因此，筆者對pUC19、pHK2進行改造，使其與GoldenGate兼容，構建中間載體和植物表達載體的基礎骨架。

pUC19質粒改造流程：首先，設計附加Esp3I和BbsI酶切位點引物，用以擴增pUC19質粒的lacZ基因；其次，設計附加BbsI酶切位點引物反向擴增pUC19的骨架；兩者PCR產物經過限制性內切酶BbsI酶切連接以后，成功將Esp3I酶切位點插入lacZ基因兩側；最終將中間載體骨架命名為pUC19-Esp3I-Bb（圖1-A），此載體原核抗性為氨芐青霉素，兼容GoldenGate連接技術，同時可利用藍白斑篩選提高陽性克隆成功率。

pHK2質粒改造流程：設計附加BsaI和BbsI酶切位點引物，擴增pUC19質粒的lacZ基因，隨后使用限制性內切酶BbsI酶切擴增產物，在擴增子兩端形成黏性末端；使用限制性內切酶HindIII和EcoRI酶切pHK2質粒，釋放出AtU6-gRNA和35s-Cas9-rbcs表達元件，并產生與lacZ模塊具有相同黏性末端的骨架分子；最終將lacZ與pHK2骨架連接，生成植物表達骨架載體pHK2-BsaI-Bb（圖1-B）。該質粒具備雙元表達載體元件，以及卡那霉素（原核）和潮霉素（真核）抗性，插入BsaI-lacZ-BsaI模塊，使之兼容GoldenGate連接技術，同時可利用藍白斑篩選提高陽性克隆成功率。

本系統開發的中間載體pUC19-Esp3I-Bb，支持將多個片段整合進一個轉錄模塊（Module），形成中間載體pUC19-ModuleA/B/C，并進一步將多個Module無縫裝載到植物表達載體pHK2-BsaI-Bb，用于后續植物遺傳轉化（圖2）。為此，用于擴增的引物被設計為含有Esp3I酶切位點，以實現無縫連接，可以通過GoldenGate引物設計在線網站簡化引物設計。此外，每個Module的第一個片段的正向引物和最后一個片段的反向引物，應在Esp3I酶切位點和連接序列之間包含一個BsaI酶切位點。在這些引物中，相鄰片段之間的融合位點互補，組裝體中第一個和最后一個融合位點與pHK2-BsaI-Bb載體位點互補。通過在引物中附加BsaI酶切位點，第二輪組裝時只需一個pHK2-BsaI-Bb就能裝載多個pUC19-Module，并形成一個完整的表達質粒。

圖1載體改造示意圖Fig.1 Schematicdiagramof themodification ofvector

圖2pUC19-Module構建示意圖

Fig.2 Schematic diagramforproducingthepUC19-Module construct

2.2植物基因編輯載體e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBY的構建

筆者在本研究中構建的載體骨架，能夠將不同的功能元件靈活組合，可以作為不同植物基因編輯工具優化的基礎載體。為了確認開發的方法有效性，筆者嘗試利用pUC19-Esp3I-Bb和pHK2-BsaI-Bb構建全新基因編輯質粒。首先，將e35S啟動子、SpyCas9和NOS終止子分別從不同質粒中擴增，并無縫組裝到pUC19-Esp3I-Bb中，形成e35S-Cas9-NOS表達模塊A。構建靶向蘋果PDS基因的AtU6-gRNA表達元件，并設計附加BsaI酶切位點引物，將AtU6-gRNA擴增，產生表達模塊B。其次，設計附加BsaI酶切位點引物，擴增RUBY報告系統的完整表達元件，產生表達模塊C。最終，將模塊A、B、C與pHK2-BsaI-Bb混合，在BsaI限制性內切酶和T4DNA連接酶作用下進行一體化無縫連接，得到基因編輯載體e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBY（圖3-A）。

圖3e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBY載體在煙草中實現瞬時表達

A.e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBY構建示意圖;B.煙草葉片瞬時轉化表型;C.RUBY相對表達量分析。DODA.DODA，CYP.CYP76AD1，Glu.Glucosyltransferase。***表示在 Plt;0.001 差異極顯著。A.Schematicdaduge5C-UUBosctastrafotiootetbaclaysisofrelativeosrsee*atetelyiPlt;0.001 ：

Fig.3The e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBYvector enables transient expression inN.benthamiana

此載體包含基因編輯元件和RUBY可視化報告系統，可通過顏色初步識別遺傳轉化事件。瞬時轉化煙草葉片顯示，e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBY使得煙草葉片變紅（圖3-B），與原始質粒35S：RUBY的表現一致。進一步對兩組葉片中RUBY報告元件的表達量進行分析，結果表明，在這兩組葉片中均檢測到RUBY的表達，且表達水平無顯著差異（圖3-C）。以上結果表明，此質粒在遺傳轉化系統中具備可視化指示功能。

2.3蘋果瞬時表達系統

植物穩定轉化需要較長時間篩選以及再生，使基因編輯難度與時間成本大幅增加。對于植物而言，在成功構建好CRISPR載體后，先進行瞬時轉化，在較短時間內迅速檢測CRISPR載體系統和gRNA的有效性，隨后開展穩定轉化，大大降低試驗難度與時間成本。

由于蘋果葉片蠟質層較厚，無法采用針管注射法瞬時轉化，筆者采用真空滲透法進行蘋果瞬時表達。如圖4-A所示，蘋果組培苗完全浸泡在農桿菌懸浮液中， -0.086MPa 真空輔助侵染。暗培養1d后，在弱光下繼續培養。植株在侵染4d后，葉片出現明顯的紅色，表明質粒成功轉染進植物細胞并表達RUBY報告元件（圖4-B）。為了檢測質粒中Cas9、gRNA及RUBY元件是否成功表達，提取葉片RNA并采用特異性引物對Cas9蛋白、gRNA以及RUBY的mRNA進行擴增檢測。RT-PCR顯示，侵染后的紅色葉片具有明顯的Cas9、gRNA以及RUBY的特異性條帶（圖4-C），后續測序進一步確認序列正確。以上結果表明，該瞬時轉化方法可以將質粒導入蘋果葉肉細胞，并且質粒中基因編輯和RUBY功能元件均在葉片中成功表達。

2.4蘋果瞬時表達系統驗證基因編輯質粒的功能

為了進一步驗證構建的質粒具有基因編輯功能，筆者采用瞬時表達的方法，對葉肉細胞中PDS基因進行敲除試驗。兩個gRNA靶標（gRNA-1/2）分別位于蘋果PDS基因的第2個和第3個外顯子區域，gRNA-1靶向負義鏈，gRNA-2靶向正義鏈（圖5-A）。兩個gRNA由共同的AtU6啟動子驅動，中間序列連接，轉錄后會被細胞內的tRNA加工酶切割，將gRNA從同一轉錄本中分開，釋放出功能性單個gRNA（圖5-B）。

A.蘋果植株真空滲透瞬時轉化流程;B.蘋果植株瞬時轉化表型;C.通過RT-PCR檢測蘋果植株中T-DNA插入。M.Marker;T.瞬時轉化葉 片;C.對照葉片。 A.Transientepolifiatsstasto tionofT-DNAinsertioninappleplantletsbyR-CRanalysis.M.Marker;T.Thetransientlytransforedleaves;C.Thecontroleaves.

圖4農桿菌介導的蘋果植株瞬時轉化試驗

使用TIDE在線工具可以分析目標區域PCR產物的Sanger測序數據，從而解析野生型/編輯細胞群體中插入/缺失突變（indeI）的大小頻率。通過比較gRNA-1和gRNA-2位點的Sanger測序數據，TIDE可以識別不同indel的種類和相對頻率，gRNA-2位點的基因效率高于 gRNA-1（24.1% vs 13.7% ），gRNA1與gRNA2之間存在顯著差異 （Plt;0.05） ，堿基類型多為1bp的插入和缺失（圖5-C～D）。

3討論

筆者基于GoldenGateAssembly技術開發的模塊化載體構建系統，成功解決了植物基因編輯中常見的多元件整合的技術難題。通過對傳統載體pUC19和pHK2進行改造，實現了多元件的精準整合，提供了一種高效且靈活的基因組整合方案。相較于傳統克隆技術，本系統在構建效率和靈活性方面展現出明顯優勢。與GibsonAssembly相比，本系統無需依賴序列重疊區設計，減少了同源臂的設計及長片段PCR擴增需求，避免了序列依賴性組裝偏差，通過TypeIIS限制性內切酶（如BsaI、Esp3I）和T4DNA連接酶的協同作用，可實現多片段DNA的一次性精準高效組裝。與MoClo系統相比，本系統克服了其對單一限制性內切酶的過度依賴，采用更靈活的模塊化設計。相比之下本系統“一鍋”反應簡化了操作流程，減少了步驟和時間[，允許根據試驗需求自由組合Cas蛋白、啟動子及gRNA等元件，顯著提升了基因編輯載體的構建效率與精準度。此外，相較于傳統抗生素篩選標記，RUBY可視化報告元件的整合將表型確認時間從2～3周縮短至4～6d，為基因編輯的實時監控提供了創新性解決方案。

相關研究表明，基于GoldenGate和CRISPR/Cas9的基因編輯平臺提供了高效且可重復的模塊化編輯工具，具備多基因同時編輯、無疤痕拼接和快速構建目標載體三大技術特征[18]。基于此，筆者在本研究中構建的pUC19-Esp3I-Bb和pHK2-BsaI-Bb載體展現出優異的模塊化兼容性，能夠使多個表達模塊無縫整合，且具有較強的適應性，可以根據需求快速調整載體的功能元件。該平臺不僅提供了植物基因編輯載體的優化方案，還可以在后續的基因編輯研究中靈活地調整Cas蛋白、gRNA、啟動子等關鍵元件，以滿足不同植物的編輯需求。在功能驗證方面，筆者成功地將e35S-Cas9、AtU6-gRNA和RUBY報告系統整合，構建了e35S-Cas9-AtU6-gRNA-RUBY基因編輯質粒。該質粒在煙草葉片中成功表達，并表現出良好的可視化指示功能，與以往的基因編輯體系相比，該體系為基因編輯效率的監控提供了便利。在蘋果葉片的瞬時轉化體系中，利用優化的真空滲透法應對了蘋果葉片轉化的挑戰，成功實現了PDS基因的靶向編輯和gRNA編輯效率的初步評價，并通過RT-PCR和測序確認了編輯效果。

然而本系統存在以下局限性：首先，僅驗證了蘋果瞬時轉化體系的編輯效率，尚未通過穩定遺傳轉化評估基因編輯的能力，后續將通過蘋果遺傳轉化體系進行驗證；其次，當前試驗樣本量可能不足以全面評估編輯效率的穩定性，特別是在CRISPR/Cas9系統常見的嵌合體形成方面；最后，本系統對TypeIIS限制性內切酶的依賴性可能限制大片段 （gt;15 kb）或高CG含量模塊的組裝效率，未來可結合Gib-sonAssembly技術進行互補優化。此外，本系統尚未在單子葉植物中進行驗證，其應用范圍仍需進一步驗證。

綜上所述，筆者建立的模塊化載體系統具有較高的轉化效率和強大的編輯能力。通過適當設計引物和限制性內切酶位點，能夠實現快速組裝，減少了傳統克隆過程中的時間和工作量，并有效提高了組裝成功率。這為不同植物的基因編輯系統提供了一個標準化且易于調整的構建平臺，極大地促進了植物功能基因組學研究的深入，為果樹基因編輯研究提供了可靠的工具。

4結論

筆者基于GoldenGate克隆技術成功構建模塊化載體系統，實現了多個基因模塊的高效精準組裝，并通過蘋果瞬時轉化體系驗證其編輯效率。針對果樹轉化難題，優化的真空滲透法解決了蘋果遺傳轉化效率低的問題，成功實現了對PDS基因的靶向編輯。該系統在基因編輯工具多元化、載體的靈活性以及轉化效率等方面提供了新的思路與技術支持，其模塊化設計支持CRISPR元件、核定位信號、啟動子及sgRNA表達盒的靈活組合，為果樹等難轉化植物的高效精準編輯及遺傳改良提供了技術支撐。未來，基于此平臺的進一步優化和應用有望推動更多植物品種的遺傳改良，尤其是在經濟作物和果樹領域，帶來更高效、精準的基因組編輯技術。

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