雙鏈DNA胞苷脫氨酶檢測DNA甲基化

中圖分類號：R34 文獻標志碼：A

Double-stranded DNA Cytosine Deaminase Detects DNA Methylation

TANG Yue，LI Xin-min（Institute of Translational Medicine，Qingdao University，Qingdao 266o21，China）

Abstract：A highly sensitive double stranded DNA cytosine deaminase DddA coupling methylation-specific PCR method was developed for detecting DNA methylation， avoiding DNA sample degradation in bisulfite conversion coupled Methylation-Specific PCR. In DddA conversion-based methylation specific real-time quantitative PCR，the DddA deaminated the DNA samples firstly，then performed the real-time PCR with methylation specific primers. According to standard curve of the target genes，the methylation level of the DNA sample could be evaluated. The results showed that the DddA can discriminate the methylate with unmethylated DNA well. And DddA-qMSP can effectively detect the methylation status of colorectal cancer marker genes SEPT9 and SDC2.

Keywords： double-stranded DNA; double-stranded DNA cytosine deaminase; cytosine methylation; epigenetic inheritance; genetic testing

DNA甲基化（DNA Methylation）是常見的表觀遺傳修飾之一，不發生DNA序列改變，但影響基因表達[1]和基因組穩定性[2]。真核生物中發揮重要表觀遺傳調控的DNA甲基化主要是5-甲基胞嘧啶修飾，即在DNA甲基化轉移酶的催化下，將 S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基轉移至胞嘧啶殘基嘧啶環的第5個碳上，形成5-甲基胞嘧啶 （5mC）^[3] 。已有研究證明哺乳動物、昆蟲和植物DNA中廣泛存在DNA 甲基化[4]，主要特異性存在于CpG二核苷酸中，且不是隨機分布[5]。DNA 甲基化參與胚胎發生[6]和細胞衰老[]等多種發育過程，以及癌癥8和神經退行性疾病9]等多種人類疾病。在發病率很高的結腸癌中，SEPT9 基因和 SDC2基因顯著高甲基化[10]。腫瘤特定基因甲基化變化是腫瘤篩查的指標，因此，正確分析DNA甲基化狀態對了解癌癥惡性轉化、診斷、預后和治療監測至關重要。目前，檢測DNA甲基化的方法主要有亞硫酸鹽測序（BS-seq）[1]，甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）[12]，甲基化依賴性限制內切酶（MDREs）[13]或質譜法[14]等。但仍然存在部分局限，如亞硫酸氫鹽導致DNA 降解，使樣品大量損失;MeDIP 不能提供單個胞嘧啶的甲基化狀態，并且存在非特異性結合;MDREs依賴于酶的性質和酶切效率；質譜法要求高純度的樣品DNA。應用酶學的DNA甲基化檢測方法，如酶促甲基化測序（EM-seq）中使用的是單鏈DNA/RNA脫氨酶載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化亞基3A（APOBEC3A）[5，15]，不能直接檢測雙鏈 DNA 甲基化。近期研究發現一種可以直接作用于雙鏈DNA的胞嘧啶脫氨酶（DddA）[16]，DddA是由VI型分泌系統（T6SS）介導的抗菌毒素，催化雙鏈DNA胞嘧啶脫氨，實現CG/TA的轉換，其中甲基修飾的胞嘧啶不發生CG/TA轉換，并且DddA強烈偏好TC基序。基于DddA的研究進展，本實驗研發了一種酶促轉換法，利用DddA直接作用于雙鏈DNA，并與實時熒光定量PCR（qPCR）結合，實現腫瘤基因胞嘧啶甲基化水平的有效檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

10× Phusion GC Buffer（NEB）， 10× Buffer 2（NEB）， 10× cutsmart Buffer（NEB）， 5× DddA Buffer， 2× Es Taq mastermix（康為世紀）， 2× TB Green premix ex taq II（Takara），dNTPs，Phusion DNA polymerase（NEB），M.SsI CpG 甲基化轉移酶（NEB），HpaII（NEB），BstUI（NEB），DddA，尿嘧啶 DNA 糖基酶（UDG）， ，普通DNA產物純化試劑盒（天根），DNA純化與濃縮試劑盒（ZYMOResearch），基因組提取試劑盒（Qiangen），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）， 10× TBE（SangonBiotech），丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺 40% 溶液（ 19：1 ）（Sangon Biotech），尿素（Sangon Biotech）， 10% APS，促凝劑， 10%（v/v） 胎牛血清。

1.2 實驗方法

1.2.1DddA表達與純化DddA表達載體 pETDuet-1：DddAtox-DddIA由擎科生物合成，DddA的表達純化參考已有研究[16]，大腸桿菌BL21（DE3）pETDuet-1：：DddAtox-DddIA 培養物接種至 2L 氨芐抗性LB培養基，培養OD600至0.6。 0.5mM IPTG誘導質粒表達，在 18^°C 的搖培養箱中培養 ^16h 。 4000g 離心20min 收集細菌沉淀，用 50mL 裂解緩沖液 （50mMTris–HClpH7.5，500mMNaCl，30mM 咪唑， 1mM DTT和 1mg/mL 溶菌酶）重懸。超聲裂解， 25 000g 離心 30min 得到上清。上清中DddAtox-DddIA復合物通過鎳親和層析純化，將 4mL Ni-NTA瓊脂糖珠加在重力柱上。將上清液加到柱上，用 50mL 洗滌緩沖液 （50mM Tris-HCl pH7.5，500mMNaCl，30mM 咪唑， 1mM DTT）洗滌。用 5mL 洗脫緩沖液 （50mM Tris-HCl pH7.5，500mMNaCl，300mM 咪唑， 1mM DTT）洗脫目的蛋白。在洗脫蛋白中加入 50mL8 M尿素變性緩沖液（ 50mM Tris-HCl pH7.5，300mM 咪唑， 500mMNaCl 和 1mMDTT） ，于 4^°C 下孵育^16h 。將含有洗脫蛋白的 8M 尿素變性緩沖液加到裝有 4mL Ni-NTA瓊脂糖珠重力柱上，用 50mL8M 尿素變性緩沖液洗滌重力柱，去除DddIA。DddAtox仍然與Ni-NTA瓊脂糖珠結合，用 25mL 降低尿素濃度 （6M，4M，2M，1M） 變性緩沖液連續洗滌，再用洗滌緩沖液洗滌，去除殘留尿素。結合到柱上的蛋白用5mL 洗脫液洗脫，用超濾管濃縮蛋白， 15% SDS-PAGE膠檢測蛋白純度。

1.2.2DddA脫氨活性驗證將DA-S、DA- .ms 在脫氨緩沖液 （1×DddA buffer）配成雙鏈DNA（DA-dsDNA）底物，分別取 5× DddAbuffer（ 100mM MES pH6.4，1 MNaCl，10 mMDTT， 40% Ficoll 70）、DA-ds-DNA以及 DddA進行脫氨反應， 孵育 。反應結束后，向 10μL 的反應體系中加入5 酶 （0.02U/μL UDG 在 1× 緩沖液）， 37^°C 孵育 30min 。再加入終濃度 反應 3min ，使底物斷裂。通過 15% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果，電泳結束后使用Typhoon（GE）Cy2信號通道檢測信號。

1.2.3SDC2基因和SEPT9 基因甲基化標準品的制備（1）制備 SDC2基因和 SEPT9基因（基因序列見表

1，引物序列見表2）：以DNA為模板，分別加人 10× PhusionGCBuffer、SDC2-F、SDC2-R、dNTP、以及Phu-sion DNA polymerase（ 2U/μL） 繼續PCR反應，得到SDC2基因和SEPT9基因。（2）用天根純化試劑盒cat#DP205 純化 SDC2基因和 SEPT9 基因PCR產物。（3）制備 SDC2基因和 SEPT9 基因甲基化標準品：分別將純化得到的SDC2和SEPT9DNA與 CpG 甲基化轉移酶（M.SssI）在 10× buffer2和SAM混合溶液中 孵育 4h，65‰ 加熱 20min 使蛋白失活，得到甲基化的SDC2基因和SEPT9基因，用ZYMO RE-SEARCH的純化試劑盒 對其純化，作為甲基化DNA標準品。

表1實驗所用基因序

表2實驗所用引物序列

注： 表示甲基化胞嘧啶 5mC） 。

1.2.4SDC2 基因和 SEPT9 基因甲基化標準品驗證將甲基化敏感內切酶 HpaII（NEB，cat#R0171S）分別與SDC2基因和SEPT9基因甲基化標準品在 10× cutsmart buffer中 37^°C 孵育 ¹h ，BstUI（NEB，cat#R0518S）分別與SDC2基因和SEPT9基因甲基化標準品在 10× cutsmartbuffer中 60^°C 孵育 ^1h 。酶切結果用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結束后用凝膠成像儀檢測電泳結果。

1.2.5SDC2基因和 SEPT9基因甲基化標準品檢測：（1）DddA脫氨甲基化標準品：將 SDC2基因和SEPT9基因甲基化標準品分別與DddA共同加入 5× DddA buffer 中， 37^°C 孵育 ¹h 。脫氨反應結束后，于65^°C 加熱 18min 使酶失活，得到脫氨SDC2基因和 SEPT9 基因甲基化標準品。（2）脫氨SDC2基因和SEPT9 基因甲基化標準品特異性PCR：脫氨SDC2基因和 SEPT9基因甲基化標準品作為模板，用特異甲基化PCR引物mSDC2-F和mSDC2-R在 2× EsTaqmastermix溶液中進行PCR反應，反應結束后用 8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測DddA-MSP產物，驗證設計的引物的甲基化特異性。

1.2.6DddA-qMSP 檢測靈敏度驗證 使用ABI QuantStudio 5 儀器，在 TB Green premix ex taq II 中以mSDC2-F和mSDC2-R為引物檢測一系列濃度梯度的脫氨 SDC2基因和 SEPT9 基因甲基化標準品，繪制脫氨SDC2基因和SEPT9基因甲基化標準品濃度與Ct值標準曲線。

1.2.7HCT116 細胞和 HeLa 細胞 SDC2 基因和 SEPT9 基因甲基化檢測（1）提取 SDC2 基因和 SEPT9基因：HCT116細胞用含 10%（v/v） 胎牛血清的1640培養基在 CO₂ 培養箱中 37^°C 培養；待細胞密度長到90% ，取六孔板的一個孔的細胞。HeLa細胞用含 10%（v/v） 胎牛血清的DMEM培養基在 CO₂ 培養箱中 培養，待細胞密度長到 90% ，取六孔板的一個孔的細胞。利用Qiangen基因組提取試劑盒提取基因組DNA。（2）HCT116 細胞和 HeLa 細胞中 SDC2基因和 SEPT9基因脫氨：將提取的基因組DNA與 DddA共同加入 5× DddA buffer 中， 37^°C 孵育 2h 。反應結束后于 65°C 加熱 20min 使酶失活。（3）DddA-qMSP：在 TBGreen premix ex taq II 中通過 mSDC2-F和 引物檢測HCT116細胞和HeLa細胞SDC2基因和 SEPT9 基因，使用ABIQuantStudio 5儀器檢測甲基化。（4）評估基因甲基化水平：根據標準曲線和HCT116 細胞和HeLa 細胞中 SDC2 基因和 SEPT9 基因的Ct值，得到待測 DNA 樣品甲基化水平。

2 結果

2.1 DddA脫氨胞嘧啶原理及其活性驗證

DddA 脫氨胞嘧啶使其轉化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不發生脫氨反應[17]。圖1為胞嘧啶、尿嘧啶和甲基化胞嘧啶的結構示意圖。通過合成帶有熒光標記（FAM）的甲基化雙鏈DNA（DA-mS）和非甲基化雙鏈DNA（DA-S）（序列見表2）驗證DddA對甲基胞嘧啶的脫氨活性。圖2為SDS-PAGE蛋白膠驗證DddA-DddIA表達，后大量表達提純得到較高純度DddA蛋白。

圖1胞嘧啶、尿嘧啶以及甲基化胞嘧啶結構示意圖

圖2SDS-PAGE蛋白膠驗證結果

首先將雙鏈底物與DddA進行孵育，隨后加入尿嘧啶DNA糖基酶（UDG）去除脫氨后底物序列中的尿嘧啶，再加入 ΔNaOH 使底物在脫氨堿基處發生斷裂，最終通過變性聚丙烯酰胺凝膠分析結果（圖3（a））。從圖3（b）和圖3（c）中可以得出DddA的脫氨活性受到甲基化修飾的抑制。與產物相對應的DNAmarker中，（A）含有15個A堿基，（TC）14個A堿基的3端為ACTC，（CC）14個A堿基的3端為ACTCGCC（圖3（b））。與圖3（c）中的泳道1和泳道4不經任何處理的原始條帶相比，不與DddA酶孵育，僅通過UDG 和

NaOH處理并不會導致DA-mS和DA-S發生斷裂（圖3（c）泳道2和泳道5）。而與DddA酶孵育并通過UDG 和NaOH處理的非甲基化DA-S鏈中胞嘧啶發生脫氨反應，主要發生在TC基序，AC 基序也存在一定程度的脫氨（圖3（c）泳道6、泳道7和泳道9）。非甲基化TC堿基中的C經處理后被去除，比泳道7的marker少一個堿基。DA-mS中甲基化修飾的TC基序沒有發生脫氨反應，未甲基化的AC基序和CC基序發生脫氨反應（圖3（c）泳道3、泳道8和泳道9）。

圖3DddA脫氨活性檢測原理

（a）DddA脫氨活性檢測流程；（b）引物延伸構建的不同產物位置的DNAMarker，分別對應AC基序（FAM-A15（A））：TC 基序（以（A）為引物，DA-anti為模板，添加dTTP和dCTP延伸），以及CC基序（以（A）為引物，DA-anti為模板，添加dTTP、dGTP和dCTP）；（c）DddA對甲基化 DNA 敏感性的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗，S：樣品，P：產物

2.2DddA酶促轉換——甲基化特異性PCR檢測方案的建立及驗證

根據DddA的脫氨性質，設計DddA酶促轉換———甲基化特異性PCR（DddA-MSP）檢測基因組的甲基化狀態。設計甲基化特異性引物，取目的基因與DddA孵育后的產物進行甲基化特異性PCR，隨后通過電泳或qPCR檢測是否存在產物判斷目的基因是否存在甲基化修飾（圖4，其中箭頭代表甲基化特異PCR 引物， m 代表甲基化修飾），即甲基化修飾的目的基因不發生脫氨反應并有 PCR擴增產物，無甲基化修飾的目的基因脫氨后序列發生變化，則沒有PCR擴增產物。

為驗證該方案是否可行，選取HCT116細胞基因組DNA中的SDC2基因和SEPT9基因進行檢測。制備SDC2基因和SEPT9基因甲基化標準品，分別用對甲基化敏感的BstUI和HpaII對SDC2基因和SEPT9基因及其甲基化標準品進行酶切以驗證甲基化是否完全（圖5（a）和6（a））。BstUI和HpaII均對甲基化CpG敏感，當甲基化標準品經CpG甲基化轉移酶（M.SssI）處理發生甲基化修飾，BstUI和HpaII則無法切割SDC2基因和SEPT9

圖4基因甲基化DddA檢測原理及流程

基因甲基化標準品。將甲基化標準品與DddA孵育，并進行甲基化特異性 PCR（圖 5（b）和6（b）），結果顯示，僅SDC2基因和SEPT9基因甲基化標準品存在擴增產物（圖5（b）和6（b）的泳道3）。

圖5SEPT9甲基化標準品DddA-MSP產物檢測結果（a）內切酶驗證SEPT9甲基化標準品，“一\"指未酶切，B代表BstUI酶切，H代表 HpaII 酶切；（b）電泳檢測SEPT9甲基化標準品DddA-MSP產物，“一\"指未用DddA處理，“ + \"指DddA處理，u代表未甲基化的DNA， m 代表甲基化的DNA

圖6SDC2甲基化標準品DddA-MSP產物檢測結果 R² （a）內切酶驗證SDC2甲基化標準品，“一\"指未酶切，B代表BstUI酶切，H代表HpaII酶切；（b）電泳檢測SDC2甲基化標準品DddA-MSP產物，“一\"指未用DddA處理，“ + \"指DddA處理，u代表未甲基化的DNA， m 代表甲基化的DNA

2.3 DddA-MSP檢測靈敏度驗證

為驗證該方案的靈敏度，使用qPCR在一定濃度范圍內檢測 SDC2基因和SEPT9基因甲基化標準品的甲基化水平。結果表明，在 0.1pg^-3ng 的DNA濃度范圍內，方案均具有較高靈敏度（圖7和圖8）。

（a）SDC2甲基化標準品濃度梯度熒光信號曲線；（b）Ct值與SDC2甲基化標準品DNA濃度對數擬合曲線

圖7SDC2甲基化標準品DddA-qMSP檢測結果

圖8SEPT9甲基化標準品DddA-qMSP檢測結果

（a）SEPT9甲基化標準品濃度梯度熒光信號曲線；（b）Ct值與SEPT9甲基化標準品DNA濃度對數擬合曲線

2.4 DddA-MSP檢測基因組DNA甲基化

使用 DddA-MSP 檢測 HCT116 細胞及 HeLa 細胞中 SDC2 基因和 SEPT9 基因的甲基化水平。 30ng HCT116 細胞中，SDC2 基因Ct值為35 循環，0.1 pg SDC2 甲基化標準品的Ct值也為35循環。由此判斷，HCT116細胞中SDC2基因甲基化水平和 0.1pg 的SDC2基因標準品甲基化水平相當（圖9（a））。HCT116細胞中SEPT9甲基化的 Ct 值為35.4循環， 0.1pg SEPT9甲基化DNA的Ct值為35.1循環，即HCT116細胞中 SEPT9 基因甲基化水平略低于SEPT9 基因標準品甲基化水平（圖9（b））。

圖9HCT116細胞中SDC2和SEPT9甲基化水平DddA-qMSP檢測結果

（a）SDC2熒光信號曲線；（b）SEPT9熒光信號曲線

圖10HeLa 細胞中SDC2、SEPT9甲基化水平DddA-qMSP檢測結果

有研究發現HCT116細胞中的SDC2基因和SEPT9 基因甲基化水平高于HeLa 細胞[18-19]。因此，檢測HeLa細胞中SDC2基因和SEPT9基因的甲基化水平（圖10），結果顯示 30ng HeLa細胞中SDC2基因Ct值為37.6循環，SEPT9基因Ct值為36循環，均大于HCT116細胞中SDC2基因和SEPT9基因的Ct值。與預期結果一致，HCT116細胞中的SDC2基因和SEPT9基因甲基化水平高于HeLa細胞。

3 討論

DNA甲基化作為可遺傳的表觀遺傳修飾，對基因表達、基因組穩定性的維持以及胚胎發育等均發揮重要的調控作用[20-23]。研究發現，癌細胞中DNA 甲基化模式有別于正常細胞[2]。結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，SDC2和 TFPI2 甲基化是結直腸癌檢測的生物學標志物，糞便中 SDC2 和 TFPI2 甲基化檢測可能成為結直腸癌有效的早期無創篩選方法[25]。PAX1和 SEPT9 是宮頸癌的生物學標志，其甲基化率和水平隨著宮頸病變嚴重程度的增加而增加，并在宮頸癌脫落細胞中達到峰值[26]。新建立的 DddA-qPCR 可以準確靈敏的檢測雙鏈 DNA甲基化，根據目的基因甲基化標準品確定細胞中目的基因甲基化水平。目前，DNA 甲基化檢測有多種方法，如胞嘧啶甲基化檢測的金標準，亞硫酸氫鹽測序[2]，納米孔測序[28」，，酶促轉換測序[5]等，但都存在局限性。DddA 脫氨胞嘧啶進行C/T轉化是一種簡單高效的方法，可以直接作用于雙鏈 DNA，檢測信號轉換簡單，實驗成本低，避免了DNA樣品降解和重亞硫酸鹽和強堿對操作人員的危害。DNA 甲基化的基因組分析有助于闡明DNA甲基化的分子基礎，開發更具特異性和更有效的DNA甲基化抑制劑，對于癌癥的早期診斷和治療具有一定作用。

4 結論

實驗驗證DddA 對雙鏈 DNA胞嘧啶和甲基化胞嘧啶的敏感性，以及其對 TC 基序的偏好。將 DddA 脫氨雙鏈胞嘧啶的特性與qPCR相結合，建立一種新的可以直接用于雙鏈DNA甲基化的檢測方法，并成功檢測HeLa細胞和HCT116 細胞中的SDC2基因和SEPT9基因的甲基化水平。DddA-qPCR具有較高的靈敏度，實驗條件溫和，克服以往不能直接檢測雙鏈DNA甲基化的不足，為甲基化檢測提供新的可能性。

參考文獻

[1]XUYY，CHENGLUNJ，etal.HypermethylationofitochondrialcyochromebandcytochromecoxidaseIgeneswithcreasedmitochondrialDAcopyumbersintheAPP/PS1transgenicmousemodelofleimer'sdiseaseJ]NeurochemicalResearch02，46（3）：564-572.

[2]YUEYA，RENLK，ZHANGC，etal.MitochondrilgenomeundergoesdenovoDNAmethylation that protects mtDNAagainstxida-tivedamageduringtermplntatiowindoJ]ProcedingsoftheNatioalAcademySciencesofteUnitedStatesAmerica2，119（30）：e2201168119.

[3]ORTIZ-BARAHONA V，JOSHIRS，ESTELLERM.UseofDNAmethylationprofiling in ranslationaloncology[J]SeminarsinCancerBiology，2022，83：523-535.

[4]WYATTGR.Recognitionandestimationof5-methylcyosineinnucleicacids[J].TheBiochemicalJournal951，485）：58-584.

[5]VAISVILAR，PONNALURIVK C，SUNZY，etal.Enzymatic methylsequencing detects DNA methylationatsingle-baseresolutionfrom picograms of DNA[J].Genome Research，2021，31（7）：1280-1289.

[6]DE LIMA C B，MARTIN H，PECORA MILAZZOTTOMP，et al. Genome-wide methylationprofileof mitochondrial DNA across bovine preimplantation development[J].Epigenetics，2023，18（1）：2241010.

[7]HUANGCH，CHANG MC，LAIYC，etal.Mitochondrial DNAmethylationprofilingof thehumanprefrontalcortex and nucleusaccumbens：Correlations with aging and drug use[J].Clinical Epigenetics，2O22，14（1）：79-93.

[8]LIUZ，TIANJH，ENGFH，etal.HypermethylationofitochondrialDNAfacilitatesbonemetastasisofrenalcellcrcioaJ].Journal of Cancer，2022，13（l）：304-312.

[9]STOCCOROA，SMHAR，MOSCAL，etalMitochondriald-loopmethylationlevelsinverselycorelate withdiseasedurationinamyotrophic lateral sclerosis[J].Epigenomics，2024，16（4）：203-214.

[10]LIY，LIBRta.Aelrgmetdofhtirkrselstproeheflotalaer and precancerous lesions[J].Cancer Medicine，2023，12（21）：20626-20638.

[11]MATSUDA S，YASUKAWA T，SAKAGUCHIY，etal.Acurate estimationof5-methylcytosine inmammalianmitochondrial DNA[J].Scientific Reports，2018，8（1）：5801-5813.

[12]SUNX，VAGHJIANIV，JAYASEKARAWSN，etal.ThedegreeofmitochondrialDNAmethylationintumormodelsofgloblastomaand osteosarcoma[J].Clinical Epigenetics，2018，10（1）：157-168.

[13]DOUXYBOYD-KIRKUPJD，MCDERMOTTJ，etal.The strand-biased mitochondrialDNA methylome anditsregulationby DN-MT3A[J].Genome Research，2019，29（10）：1622-1634.

[14]INFANVAEGNAA，ACOBAZZIF，tal.Impirmentofethylcycleects miochondrialmethavlabilitydglutathione level in down's syndrome[J].Molecular Genetics and Metabolism，2o11，102（3）：378-382.

[15]XIENB，WANGM，JITT，etalBisulfiefreeandsinglenucleotideresolutionsequencingofDNAepigeneticmodificatioof5-hydroxymethylcytosine using engineered deaminase[J]. Chemical Science，2022，13（23）：7046-7056.

[16]MOK BY，DEMRAESMH，ZENGJetal.AbacterialcytidinedeaminasetoxinenablesCRISPR-fre mitochondrialbaseeditingJ].Nature，2020，583（7817）：631-637.

[17]MIL，SHM，IX，etalDddomoogsearchandegineringexpandsequenecompatibilityofohodrialbaseediig]ature Communications，2023，14（1）：1-9.

[18]ZHAOGD，LIUXY，LIUY，etal.AberantDNA methylationofSEPT9andSDC2instolspecimensasanntegratedbiomarkerforcolorectal cancer early detection[J].Frontiers in Genetics，202o，11：643-653.

[19]JIAOXL，ZHANGSY，JAOJ，etal.PromoterethylationofSEPT9asapotentialbomarkerforarlyetectioofcervcalcits overexpression predicts radioresistance[J].Clinical Epigenetics，2ol9，11（1）：120.

[20]YINYM，MORUNOVAE，JOLMAA，etalImpactofcytosine methylationonDNAbndingspeificitiesofhuman ranscriptionfactors[J].Science，2017，356（6337）：eaaj2339.

[21] JIN Z L，LIU Y.DNA methylation in human diseases[J]. Genes amp; Diseases，2018，5（1）：1-8.

[22]SCHULZ M，TEISSANDIER A，DE LA MATA SANTAELLA E，et al.DNA methylation restricts cordinated germline and neuralfates in embryonic stem celldifferentiation[J].Nature Structural amp;Molecular Biology，2024，31（1）：102-114.