Drg2對IRI介導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡的影響

中圖分類號：R542.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effect of Drg2 on IRI-mediated Cardiomyocyte Pyroptosis

REN Jia-hao， CHEN Xin-zhe，WANG Tao，WANG Rui-quan，WANG Kun （School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266O7l，China）

Abstract： The regulatory role of GTP-binding protein 2 （Drg2） on I/R-induced cardiomyocyte death was investigated using a primary cardiomyocyte hypoxia/reoxygenation IRI model constructed in suckling mice. In this model， myocardium-specific Drg2 was knocked down and overexpressed to explore the regulatory mechanism of Drg2 in cardiomyocyte death. The results show that knockdown of Drg2 inhibits IRI-mediated cardiomyocyte death，whileoverexpression of Drg2 promotes the elevation of the expression levels of inflammatory factors IL ?1β ，IL-18，and lactate dehydrogenase. Drg2 may play a protective role against myocardial IRI by regulating key factors of the cardiomyocyte death pathway.

Keywords： ischemia-reperfusion injury；cardiomyocytes；pyroptosis

心肌梗死是全球范圍內(nèi)死亡的主要原因之一[1-3]。通過再灌注及時恢復(fù)缺血心肌組織的血流是心肌梗死的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[4]，然而，大量的臨床證據(jù)和實(shí)驗表明，再灌注過程可能引發(fā)心肌缺血再灌注損傷（I/R），導(dǎo)致治療效果顯著降低[5-8]。心肌細(xì)胞焦亡和炎癥在心肌I/R損傷的病理生理學(xué)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，心肌I/R損傷主要與終末分化心肌細(xì)胞的死亡有關(guān)[9]，I/R損傷過程中，細(xì)胞死亡的形式包括細(xì)胞焦亡和壞死[10]。細(xì)胞焦亡是一個嚴(yán)格控制且完善的調(diào)控過程，而細(xì)胞壞死長期以來被視為一種無法控制的細(xì)胞死亡模式[1]。研究表明，某些類型的細(xì)胞壞死，包括壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡、鐵死亡和腫瘤死亡等存在可調(diào)控性[1-13]。 Drg2 是細(xì)胞生長、分化和/或囊泡運(yùn)輸信號通路的重要調(diào)節(jié)器，Drg2 缺失會通過上調(diào) ROS 水平、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的衰老等途徑最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和血管生成受損[14]。發(fā)育調(diào)節(jié)的GTP結(jié)合蛋白（DRGs）是進(jìn)化保守的GTP結(jié)合蛋白，構(gòu)成了GTPase超家族的一個亞科[15]。DRG 亞家族包含兩種密切相關(guān)的蛋白質(zhì)Drg1和 Drg2^[16] ，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、炎癥和線粒體動力學(xué)方面發(fā)揮著重要作用[17]。前期研究已證明細(xì)胞焦亡在許多人類疾病中起著至關(guān)重要的作用，過度的細(xì)胞焦亡可能對宿主有害[18]，但心肌細(xì)胞焦亡的發(fā)生及其心肌 I/R 損傷的相關(guān)機(jī)制仍有待闡明。基于此，本研究以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞焦亡為背景，在心肌IRI中的分子調(diào)控機(jī)制中，探究 Drg2 與心肌細(xì)胞焦亡有關(guān)的通路，嘗試通過 Drg2 對心肌細(xì)胞焦亡進(jìn)行調(diào)控，并開發(fā)心肌細(xì)胞IRI的治療策略。

1 材料與方法

1.1 樣本和主要試劑

實(shí)驗樣本為原代心肌細(xì)胞，由C57BL/6新生小鼠分離培養(yǎng) 1～2 天獲得；所用材料包括 10% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液（美侖生物）;RNA 抑制劑和過表達(dá)模擬物（Gene Pharma）;轉(zhuǎn)染試劑 Lipo 8000（Beyo-time）;Trizol（15596-026，Invitrogen）;Euo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒II（Accurate Biology）;SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（Takara）;細(xì)胞焦亡相關(guān)基因檢測引物（生工生物）;GSDMD-C（PROTEINTECH）;GSDMD-N（PROTEINTECH）； CASPASE 1（PROTEINTECH）； IL-18（PROTEINTECH）；GADPH（AB-CLONAL）;辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（愛必信生物）;ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Vazyme）;LDH-細(xì)胞毒性檢測試劑盒（Solarbio）。

1.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)

實(shí)驗于細(xì)胞房滅菌后的超凈臺上進(jìn)行，使用高溫高壓滅菌后的手術(shù)彎剪在乳鼠胸部剪開 3mm 小口，剪取出心臟，用 4^°C 預(yù)冷的PBS緩沖液清洗心臟，排出心臟內(nèi)血液，然后將心臟泡于 4°C 預(yù)冷的PBS緩沖液中以維持心肌細(xì)胞活力。棄掉PBS緩沖液，將心臟剪碎直至呈現(xiàn)漿狀，把心臟漿液用無菌吸引管轉(zhuǎn)移到經(jīng)過滅菌的錐形瓶內(nèi)，用消化液（二型膠原酶、胰液素和PBS）在 37^°C 水浴鍋內(nèi)進(jìn)行消化。每隔 6min ，將錐形瓶內(nèi)上清部分轉(zhuǎn)移至含有 5mL 預(yù)冷胎牛血清的 50mL 離心管內(nèi)終止消化，然后加入 5mL 消化液對未被消化的心臟再次消化。出現(xiàn)白色絮狀物時，消化完成。用離心機(jī)將終止消化的心肌細(xì)胞懸液以轉(zhuǎn)速 800min 離心 10min ，棄掉上清液，細(xì)胞沉淀用 8mL DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，再次離心并棄掉上清液，重復(fù)重懸過程，將心肌細(xì)胞懸液用無菌的100目篩網(wǎng)過篩至 10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放在含 21%0₂.37°C 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行差速貼壁，培養(yǎng) 1.5～2h ，成纖維細(xì)胞等已經(jīng)貼壁，心肌細(xì)胞未貼壁，收集培養(yǎng)液進(jìn)行離心，棄掉上清液，用 8mL DMEM/F12培養(yǎng)液重懸心肌細(xì)胞沉淀，從而分離心肌細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.3 心肌細(xì)胞IRI模型構(gòu)建

將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含 95%N₂ 的低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在 環(huán)境下使用DMEM/F12培養(yǎng)液缺氧培養(yǎng)12h 以達(dá)到心肌缺血的效果。缺氧培養(yǎng)結(jié)束后，將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含 21%O₂ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在 環(huán)境下使用DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng) ⁶h 以達(dá)到心肌再灌注的效果，通過細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（Hypoxia/Reoxygen-ation， H/R） 建立心肌細(xì)胞IRI模型。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將心肌細(xì)胞分成四組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染：對照組（Control，Con）、陰性對照組（Negative control，NC）、Drg2抑制劑（si-Drg2）組和 Drg2 過表達(dá)（ Drg2 ）組。在無菌EP管中，將NC、si-Drg2和Drg2分別與Lipo8000 混合，靜置 15min 后加入至心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染 5～6h 后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換一次DMEM/F12培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 30～36h ，完成轉(zhuǎn)染。

1.5 RNA提取和定量實(shí)時PCR（qRT-PCR）

使用 Trizol試劑盒從心肌組織中提取總RNA，并驗證其完整性和純度。根據(jù) HiScript IIIRT Super-Mix的指令，將提取的RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA;根據(jù)NCBI基因庫設(shè)計所需mRNA的下游和上游引物序列（表1）；使用實(shí)時熒光定量 PCR 儀器，配合SYBRqPCRMaster Mix進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增；使用GAPDH作為內(nèi)部參考基因以確保所有數(shù)據(jù)歸一化。

1.6 碘化丙啶（PI）染色

使用PI染色檢測心肌細(xì)胞壞死。在24孔板中鋪心肌細(xì)胞，細(xì)胞爬片，用PBS緩沖液洗去培養(yǎng)液，PI染液染色，避光，于 37^°C 孵育 20min ，吸棄染液。細(xì)胞經(jīng)PBS緩沖液清洗3次，用 4% 多聚甲醛固定15min ，滴加 DAPI（1：500）5min，P BS緩沖液清洗3次后控干，滴加抗熒光淬滅封片液封片。

表1細(xì)胞焦亡相關(guān)基因檢測引物名稱及序列

1.7 LDH檢測

使用LDH-細(xì)胞毒性檢測試劑盒測量心肌細(xì)胞中LDH釋放。將 120μL 經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及 H/R 處理后的心肌細(xì)胞上清轉(zhuǎn)移到透明的96孔板中，每孔添加 60μL 的反應(yīng)混合物。于黑暗中孵育 30min ，測量490nm 的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算LDH活性。每個實(shí)驗至少重復(fù)3次。

1.8 蛋白檢測

提取心肌細(xì)胞細(xì)胞總蛋白，用 BCA 試劑盒測得樣品蛋白濃度并計算出所需上樣量，通過 SDS-PAGE 分離不同分子量的蛋白，制作濾紙、蛋白凝膠、 .0.45μm 聚偏二氟乙烯膜的“三明治\"轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)，用預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液，恒壓 100V，90min ，完成轉(zhuǎn)膜。于 10% 脫脂牛奶中室溫孵育 ^1h ，封閉非特異性結(jié)合后，用TBST洗去牛奶，于 4^°C 搖床上孵育一抗（GSDMD-C、GSDMD-N、CASPASE1、IL-18、GADPH），一抗孵育過程至少需要 。一抗孵育結(jié)束后，用TBST洗去非特異性結(jié)合，然后使用二抗孵育 ¹h 。孵育完成后，用TBST洗去非特異性結(jié)合，將膜泡進(jìn)ECL化學(xué)發(fā)光試劑中，顯影并分析目的蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值 ± SD的形式呈現(xiàn)。數(shù)據(jù)分析時，通過兩組之間的studentt檢驗（雙尾）或單向方差分析，對多個組進(jìn)行Tukey事后檢驗， Plt;0. 05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敲低Drg2抑制心肌細(xì)胞焦亡

驗證敲低Drg2抑制心肌細(xì)胞經(jīng)歷 H/R 后的損傷。根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞缺氧構(gòu)建心肌細(xì)胞Con組，NC組，si-Drg2組， H/R 組， H/R+NC 組， H/R+si-Drg2 組，檢測和分析相關(guān)指標(biāo)。轉(zhuǎn)染效率的驗證結(jié)果表明，抑制劑有效抑制了心肌細(xì)胞內(nèi) Drg2表達(dá)（圖1（a）），si-Drg2組模擬了心肌細(xì)胞缺失Drg2的狀態(tài)，此時可以驗證抑制Drg2表達(dá)后的功能（圖1（b））。抑制Drg2表達(dá)后，心肌細(xì)胞焦亡標(biāo)志性蛋白GSDMD-C和CASPASE1表達(dá)減少，反映出心肌細(xì)胞焦亡減輕（圖1（c）、（d））。說明，Drg2缺失有助于減輕由 IRI引起的心肌細(xì)胞焦亡，對心肌細(xì)胞呈現(xiàn)保護(hù)作用，可能通過心肌細(xì)胞焦亡關(guān)鍵因子GSDMD-C和CASPASE1實(shí)現(xiàn)上述保護(hù)過程。

2.2 過表達(dá)Drg2引起心肌細(xì)胞焦亡

通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞缺氧構(gòu)建心肌細(xì)胞Con組，NC組，Drg2組， H/R 組， H/R+NC 組， H/R+Drg2 組驗證過表達(dá)模擬物轉(zhuǎn)染效率。 Drg2 組心肌細(xì)胞內(nèi) Drg2 表達(dá)明顯提高（圖2（a））， Drg2 組模擬了心肌細(xì)胞過表達(dá)Drg2的狀態(tài)，在該狀態(tài)下可以驗證過表達(dá)Drg2后的功能（圖2（b））。在對照和同樣經(jīng)過 H/R 處理模擬IRI的條件下， H/R+Drg2 組細(xì)胞焦亡標(biāo)志蛋白IL-18 和GSDMD-N表達(dá)增多，IL-18和GSDMD-N的增多不利于細(xì)胞焦亡，過表達(dá) Drg2 增重了心肌細(xì)胞焦亡（圖2（c））。同時檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白，在同樣經(jīng)過 H/R 處理模擬IRI的條件下，過表達(dá) Drg2 后心肌細(xì)胞焦亡標(biāo)志性基因IL- 1β ，IL-18表達(dá)增加，表明細(xì)胞焦亡增重（圖2（d））。測量心肌細(xì)胞中LDH釋放，在同樣經(jīng)過 H/R 處理模擬IRI的條件下， H/R+Drg2 組LDH水平增加，表明更多的心肌細(xì)胞發(fā)生死亡（圖2（e）），利用PI染色檢測心肌細(xì)胞壞死，發(fā)現(xiàn) H/R+Drg2 組心肌細(xì)胞死亡增加（圖2（f）。說明， Drg2 過表達(dá)有助于促進(jìn)由IRI引起的心肌細(xì)胞焦亡，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞死亡。

3 討論

焦亡是一種在形態(tài)和機(jī)制上不同于壞死的細(xì)胞死亡形式，特征是GSDMD或GSDME介導(dǎo)的壞死伴隨著炎癥因子釋放。心肌細(xì)胞壞死和炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷的病理生理中起關(guān)鍵作用[19]，靶向焦亡或能成為心臟保護(hù)的有效思路。之前的研究已經(jīng)表明，抑制心肌細(xì)胞焦亡在一定程度上可以提高心肌細(xì)胞經(jīng)歷 IRI后的生存率[2-21]，并且焦亡通路中的調(diào)節(jié)因子GSDMD-C 和CASPASE1對心肌細(xì)胞 IRI具有治療作用，因此心肌細(xì)胞焦亡調(diào)節(jié)因子可能成為心臟疾病治療的理想靶點(diǎn)。本文首先證明 Drg2 參與了IRI介導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡，過表達(dá)心肌細(xì)胞內(nèi)Drg2能夠有效抑制心肌細(xì)胞焦亡過程，對心肌細(xì)胞呈現(xiàn)保護(hù)作用，Drg2通過下調(diào)GSDMD-C和CASPASE1表達(dá)來發(fā)揮其對心臟的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

本研究揭示了心臟發(fā)育基因 Drg2 在IRI介導(dǎo)的焦亡調(diào)控中的關(guān)鍵作用。敲低 Drg2 能夠顯著下調(diào)GS-DMD-C和Caspase-1的表達(dá)，對細(xì)胞焦亡的經(jīng)典信號通路進(jìn)行調(diào)控，抑制心肌細(xì)胞焦亡。這一機(jī)制有效緩解了IRI對心肌細(xì)胞的損傷，減少了心肌細(xì)胞死亡，對心肌細(xì)胞展現(xiàn)了顯著的保護(hù)作用。本研究將 Drg2 作為潛在的心肌IRI治療靶點(diǎn)，通過調(diào)控細(xì)胞焦亡信號通路發(fā)揮保護(hù)作用。這一發(fā)現(xiàn)突破了以往研究中主要關(guān)注凋亡或壞死機(jī)制的局限，為開發(fā)基于 Drg2 的心肌保護(hù)策略提供了新的理論基礎(chǔ)。

靶向Drg2有望開發(fā)出更有效的心肌缺血再灌注損傷IRI治療藥物或干預(yù)措施，但目前仍處于初步探索階段。未來研究方向應(yīng)聚焦于細(xì)胞焦亡通路與心血管疾病病理機(jī)制的關(guān)系，深人研究焦亡通路關(guān)鍵因子與Drg2的相互作用機(jī)制，并通過細(xì)胞和組織功能水平的檢測進(jìn)行驗證。

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