基于特異引物的葡萄灰霉病檢測體系的建立及應用

摘要［目的]建立葡萄灰霉病的快速檢測體系。［方法]以灰霉菌的RNA聚合酶Ⅱ大亞基基因（RPB2）序列為檢測靶標，設計并篩選特異性引物，通過聚合酶鏈式反應技術（PCR），建立基于特異引物的葡萄灰霉病檢測體系，對引物的特異性、準確性、靈敏性進行驗證。[結果]引物能從15種真菌DNA中特異檢測出灰霉菌;能從發病的葡萄果實中檢測出灰霉菌;能在葡萄感染灰霉菌 24h 后檢測出條帶，最低檢出限為 ［結論]建立了一種基于特異引物的具有較好特異性、準確性、靈敏性的葡萄灰霉病檢測體系。

關鍵詞灰霉菌；特異性引物；快速檢測；準確性；靈敏性 中圖分類號 S436.631.1 文獻標識碼A文章編號 0517-6611（2025）16-0092-05doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2025.16.020

Abstract[Objective]Inorder toestablisharapiddetectionsystemforB.cinerea.Method]TheRNApolymeraseIlargesubunitgene （RPB2）squceofcineewasutildastargetfoetetiondtopsofscifcprisedsigddsreedhetab lishmentofaB.cinereadetectionsystembasedospecifcprimerswasachievedthroughtheutiliationofpolymerasechainreaction（PCR） techologyiicacdsiiysullo primersindetectingDNAfro15fungalspecies.TeprmeracuratelydetectsB.cineredindiseasedgrapefruitsandcandetectabadwitn 24haftergrapeiectionwith.cineeihdetelitof4CocusionTeprestdysuessullstablsd-basd detectionsllitaplsei ity.

Key Words Botrytis cinerea;Specific primers;Rapid detection;Accuracy;Sensitivity

葡萄（VitisviniferaL.）屬于葡萄科（VitaceaeJuss）葡萄屬（VitisL.）落葉藤本植物，是世界最古老的果樹之一。葡萄灰霉病俗稱“爛花穗”，又稱葡萄灰腐病，主要危害花序、幼果和已經成熟的果實，有時也危害新梢、葉片和果梗，是葡萄生產、加工、采后貯藏等過程中最常見病害之一。隨著設施栽培面積的擴大，葡萄灰霉病呈現出日益加重的趨勢[1]，據報道，每年可造成葡萄產量直接損失 20%～30% ，嚴重時可達總產量的 50%^[2-3] 。葡萄灰霉病極大地降低了其商業價值，給產銷業者造成巨大經濟損失，嚴重影響葡萄產業的健康發展。

灰葡萄孢霉（BotrytiscinereaPers）又稱灰霉菌，是引起葡萄灰霉病的主要致病菌。灰霉菌易產孢，繁殖快，易變異，適應能力強，可在低溫下生長、產孢，具有潛伏侵染和低溫致病的優勢，且侵染速度快，發病周期長，嚴重影響作物和果蔬的產量和品質。灰霉菌寄主廣泛，除引起葡萄灰霉病外，還可以侵染包括茄科、葫蘆科、薔薇科、豆科等470余種植物[4，是作物、果蔬生產、運輸和貯藏過程中常見的致病菌。灰霉菌的快速、早期、準確的檢測是葡萄灰霉病正確診斷和早期防治的重要手段。目前已開發出多種關于灰霉菌的早期檢測技術，如常規的病原菌分離鑒定檢測、環介導等溫擴增檢測[5-6] 近紅外光譜檢測[7]、高光譜圖像檢測[8]、酶聯免疫吸附檢測[9] 熒光定量PCR檢測[10-11]等。但常規病原菌分離檢測耗時長，步驟煩瑣，易錯過病原菌防控的最佳時機，而光譜檢測、定量PCR等對儀器等要求較高，技術難度大，很難推廣普及。環介導等溫技術檢測雖然比較靈敏，不依賴儀器，但試劑成本高，引物設計復雜，也有一定的實現難度。盡管目前針對病原菌的檢測技術已取得長足進步，新興技術不斷發展，普通PCR檢測鑒定的方法具有易操作、技術難度低等優點，廣泛應用于植物病原菌檢測，是病原菌快速檢測的金標準之-[12]。Nielsen 等[13]設計基于普通PCR的特異引物用于檢測灰霉菌，Singh等[4利用PCR快速檢測的方法實現對洋蔥頸腐病連續3年的田間監測，為田間管理和采后貯藏提供了重要的信息支撐。但PCR檢測也存在引物特異性或靈敏度不夠高及可選擇特異性引物不多等問題。基于此，經過查閱文獻，筆者以葡萄灰霉病為檢測靶標，以RNA聚合酶Ⅱ大亞基基因（RPB2）為靶點設計特異性引物，采用易操作、技術難度低的PCR方法對灰霉菌進行快速檢測，并對檢測的特異性、準確性、靈敏性進行探索與實踐。

1材料與方法

1.1材料供試菌株：所用真菌材料來源于14個不同種屬，共計15個菌株。菌株來自實驗室前期分離，所有供試菌株均通過形態學觀察及ITS序列比對鑒定后備用。菌株包括新殼梭孢菌（Neofusicoccumparvum）鏈格孢菌（Alternariaal-ternata）節菱孢菌（Arthriniumsaccharicola）枝孢霉菌（Cla-dosporiumanthropophilum）黑附球菌（Epicoccumnigrum）隱孢子蟲菌（Cryptosporiopsisdiversispora）、稻黑孢菌（Nigros-poraoryzae）擬盤多毛孢菌（Neopestalotiopsisprotearum）哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）擴展青霉菌（Penicilliumex-pansum）盤多毛孢菌（Pestalotiopsistrachicarpicola）禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）擬莖點霉菌（Diaporthenovem）、灰霉菌（Botrytiscinerea）。菌株的活化及培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA，馬鈴薯 200g/L ，葡萄糖 20g/L ，瓊脂15g/L ）。

供試材料及主要試劑：葡萄材料購自寧夏銀川永寧縣王家莊葡萄莊園。特異引物于上海生工生物有限公司合成， 2× PCRMix購自上海生工生物有限公司。所用瓊脂糖為Biowestagarose，熒光染料為 GelRed ，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離。取患病果實，于病健交界處取1塊患病組織，用 1% 次氯酸鈉浸泡 5min 70% 無水乙醇浸泡 40s ，無菌水漂洗2次，后用無菌濾紙吸干組織表面水分，將組織放入PDA培養基，于 26^°C 恒溫培養箱中培養。3～5d后，挑取菌落邊緣菌絲轉接到新PDA培養基中，直至獲得純化菌落。

1.2.2DNA的提取。參照Zhou等[15]的方法提取病原菌菌絲和果實DNA。真菌于PDA培養基上培養5～7d，取菌絲于 1.5mL 離心管中備用。果實樣品取自于患病果實病健交界處。

1.2.3特異性引物的設計。從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫下載灰霉菌及其他植物病原菌（如青霉菌、葡萄座腔菌等其他常見病原菌）的RNA聚合酶I大亞基基因（RPB2）序列，通過MEGA7對基因序列進行比對，獲得灰霉菌的RPB2基因中的特異區間，并以此為模版設計特異性引物。共設計2對引物，引物具體信息見表1。

表1用于PCR擴增快速檢測灰霉菌的特異引物

Table1SpecificprimersforPCR amplificationrapid detection of Botrytiscinerea

1.2.4引物特異性的檢驗。為檢測引物的特異性，以15種不同種屬的菌株DNA作為模板，其中包括2組陽性對照在內（2組不同型種的灰霉菌DNA），以無菌 ddH₂（ρ） 為空白對照，通過PCR驗證引物特異性。PCR反應體系（ 25μL \" 2× PCR Mix 12.5μL ，正向引物 10μmol/L ，反向引物 10μmol/L 模板DNA 1μL ，無菌 ddH₂0 補足至 25μL PCR反應程序：95^°C 預變性 變性 30s ，退火30s（B.c-585/B.c1053 退火溫度為 52^qC，B.c-754/8.c-1019 引物退火溫度為56^°C ）， 72^°C 延伸 30s ，循環32次， 72^°C 延伸 10min 。

1.2.5引物準確性的檢驗。從市場上收集腐爛的葡萄果實，取病健交界處的果肉提取DNA作為模板，進行PCR檢測。同時對患病的葡萄進行常規病原菌分離、純化、鑒定，獲得的純化菌株提取菌絲DNA后，通過通用引物ITS1/ITS4（引物序列為TCCGTAGGTGAACCTGCG/TCCTCCGCTTATTGATAT-GC）進行PCR反應，PCR產物送至上海生工生物有限公司測序，通過NCBI網站進行BLAST分析。將病原菌分離鑒定結果與特異引物PCR檢測結果進行比較，驗證引物的準確性。通用引物ITS1/ITS4PCR反應體系同“1.2.4”。PCR反應程序： 95^°C 預變性 變性 5min 58^°C 退火 30s ，72^°C 延伸 30s ，循環32次， 72^°C 延伸 10min 。

1.2.6引物的靈敏性檢測。引物靈敏性檢測分為果實接種病原菌后時間檢測和DNA濃度檢測2個方面。

1.2.6.1接種時間檢測。從市場上購買新鮮健康的葡萄果實，用 1% 次氯酸鈉浸泡 10min 進行表面消毒，無菌水沖洗干凈，在超凈工作臺上晾干后，在果實赤道部位用無菌接種針制造傷口。取計數至 1×10⁶CFU/mL 的灰霉菌分生孢子5μL 注入孔內，接種無菌 ddH₂0 為空白對照。接種后，將果實放置于干凈的塑料筐中，用塑料袋密封并保持濕度 90% 以上，放入 25^°C 恒溫培養箱中。分別在接種后0、6、12、24、48、^72，96h 取接種點周圍直徑為 15mm ，深度為 10mm 的果肉，提取葡萄果實DNA，分別用特異引物 B.c-585/B.c1053 和B.c-754/B.c-1019 進行PCR檢測，并用通用引物（ITS1/ITS4）進行PCR，對比特異引物與通用引物之間的靈敏性差異。PCR反應體系及反應程序分別見“1.2.4”和“1.2.5”

1.2.6.2DNA檢出濃度檢測。將灰霉菌模板DNA進行梯度稀釋，分別稀釋至濃度為 70，50，25，15，10，5，2，1，0.1，0.05， 0.01，5×10^-3，1×10^-3，5×10^-4，1×10^-4，5×10^-5，1×10^-5ng/μL. PCR反應體系為 25μL ，體系中模板DNA含量分別為2.8、2.0，1.0，0.6，0.4，0.2，0.08，0.04ng 和 4，2，0.4，0.2，0.04，0.02， 0.004，0.002，0.0004pg 。用特異引物 754/B.c-1019 和通用引物（ITS1/ITS4）進行PCR擴增，并對比與通用引物之間的靈敏性差異。PCR反應體系及反應程序分別見“1.2.4\"和\"1.2.5”。

2 結果與分析

2.1引物特異性驗證為驗證設計的引物 B.c-585/B 的特異性，對15株供試菌株進行檢測。如圖1所示，引物 B.c-585/B.c-1053 （圖1a）和引物B.c-754/B.c-1019 （圖1b）都只能在灰霉菌中擴增出條帶，且目標條帶清晰單一，無雜帶，條帶大小符合預期，而在其他菌種中不能擴增條帶，說明2對引物均具有很強的特異性。

注：從左起模板依次為新殼梭孢菌、鏈格孢菌、節菱孢菌、枝孢霉菌、黑附球菌、隱孢子蟲菌、稻黑孢菌、蛋白新菌、木霉菌、擴展青霉菌、鼠疫菌鐮刀菌、擬莖點霉菌、灰霉菌、灰霉菌。a.引物B.c-585/B.c-1053;b.引物B.c-754/B.c-1019。

圖1引物特異性檢測

2.2引物準確性驗證為了驗證引物在葡萄果實上檢測病原菌的準確性，從市場上收集葡萄病果，取病果果肉組織提取DNA，分別用2對引物進行PCR檢測，檢測結果如圖2所示。引物B.c-585/B.c-1053（圖2a）和B.c-754/B.c-1019（圖2b）檢測結果一致，且均有清晰條帶，可以推測15個葡萄果實均有灰霉菌感染。同時對病果進行病原菌分離，純化的菌株進行ITS測序，測序結果在NCBI網站進行BLAST分析，以初步判定病原菌的分類。表2為從15個病果上分離得到的病原菌ITS序列比對結果，也均為灰霉菌。可知，ITS測序結果與PCR檢測結果一致。由此證明，使用特異引物檢測結果與常規病原菌分離鑒定結果一致，檢測結果準確可信。

圖2患病果實DNA檢測

Fig.2DNAdetection ofdiseased fruits

注：a為引物B.c-585/B.c-1053檢測;b為引物B.c-754/B.c-1019檢測。

Note：a.PrimersB.c-585/B.c-1053areused fordetection;b.PrimersB.c-754/B.c-1019wereusedfordetection.

2.3引物靈敏性驗證為了驗證引物在葡萄果實上檢測病原菌的靈敏性，采用離體接種法接種健康的葡萄果實，在接種后 0.6，12，24，48，72，96h 提取果實DNA后，分別用特異引物 和通用引物ITS1/ITS4進行PCR檢測。接種無菌 ddH₂0 的果實DNA作為空白對照，對引物檢測靈敏性進行PCR驗證。

表2病原菌分離法純化菌絲ITS核酸測序BLAST結果

Table 2Purification of mycelium ITS nucleic acid sequencing BLAST results by pathogen isolation method

從接種后表型觀察可以看出， 0.6，12，24h 果實無明顯變化， 48h 大部分果實開始出現明顯病斑， ^72h 后菌絲已長出接種孔， 96h 果實已經開始嚴重腐爛（圖3）。從PCR結果（圖4）可以看出，引物 B.c-585/B.c1053 （圖4a）和 B.C-754/ B.c-1019 （圖4b）在接種 24h 后出現明顯的條帶，可以檢測到灰霉菌，而引物ITS1/ITS4（圖4c）只在 ^72h 之后檢測到灰霉菌，兩者對比，特異性引物效果優于通用引物ITS1/ITS4。

為了驗證特異引物的最低可檢測DNA濃度，將灰霉菌模板DNA進行梯度稀釋，并分別用特異引物 B.c-585/B 和通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增，結果如圖5所示，引物 B.c-585/B.c1053 最低可檢測出濃度為 4pg 的DNA，引物 B.c-754/B.c-1019 與通用引物ITS1/ITS4的可檢出DNA量最低濃度為 40pg B.c-585/B c1053檢測靈敏度優于 B.c-754/B.c-1019 和通用引物ITS1/ITS410倍。

圖3葡萄接種灰霉菌后表型觀察

注：a為引物B.c-585/B.c1053;b為引物B.c-754/B.c-1019;c為通用引物ITS1/ITS4。

Note：a.Primers B.c-585/B.c1053;b.PrimerB.c-754/B.c-1019;c.Auniversal primer ITS1/ITS4.

Fig.3Phenotypic observation of grapesinoculatedwith Botrytiscinerea

3結論與討論

由灰霉菌引起的果蔬腐爛給農業生產造成巨大的損失和危害，是農業生產中需重點防范和控制的病害。明軍等[16]利用PCR技術針對百合中的灰葡萄孢進行檢測，能從

5種常見致病菌中特異檢測出灰霉菌，該試驗設計的特異性引物，能在15種常見致病菌中特異檢測出灰霉菌，在檢測范圍方面有了進一步的擴大和提高。引物 B.c-585/B.c1053 和B.c-754/B.c-1019在果實感染灰霉菌 24h 能檢測到灰霉菌注：a為引物B.c-585/B.c1053;b為引物B.c-754/B.c-1019;c為通用引物ITS1/ITS4。

Note：a.PrimersB.c-585/B.c1053;b.PrimerB.c-754/B.c-1019;c.A universal primer ITS1/ITS4.

圖4果實DNA電泳圖Fig.4 Fruit DNA electrophoresis image

的存在，而通用引物ITS1/ITS4能在感染 ^72h 檢測出，說明不同引物之間的檢測效果存在明顯差異；接種 24h ，葡萄果實尚未出現明顯癥狀，說明在未出現癥狀前可通過特異引物對灰霉菌進行監測，為田間管理或采后貯藏提供有效信息。從檢測靈敏度方面， B.c-585/B.c1053 最低可檢測出 4pg 的DNA，引物 B.c-754/B.c-1019 可檢出DNA量最低濃度為40pg B.c-585/B.c1053 靈敏性優于 B.c-754/B.c-1019 0Nielsen 等[13]設計的特異引物 BA2f/BA1r 也可檢測 1～10pg 純菌絲DNA，張靜等[17]設計的特異引物可檢測出 0.4ng DNA，該試驗中特異引物在靈敏性方面也有較好表現。

該研究建立的利用普通PCR方法，基于特異引物對葡萄灰霉病原菌進行檢測的方法可以簡化植物病害診斷和早期病原體監測，有助于實現有效的田間監測和采后貯藏管理，以避免疾病大規模發生，從而最大限度地減少損失。但也存在著一些限制，如在整個檢測過程中，DNA提取占據整個檢測過程的大部分時間，今后應致力于嘗試DNA的快速提取等方法，提高檢測速度。其次，隨著環境條件的不斷變化，田間病原菌也呈現出多樣性、復雜性等特點，也應嘗試建立可同時對多種病原菌進行檢測的復合檢測體系，提高工作效率。基于普通PCR技術的灰霉菌檢測特異性引物的設計注：a為引物B.c-585/B.c1053;b為引物 B.c-754/B.c-1019;c 為通用引物ITS1/ITS4;1～17的模板DNA量分別為2.80、2.00、1.00、0.60、0.40、0.20、0.08、0.04 ng 和 4、2、0.4、0.2、0.04、0.02、0.004、0.002、0.000 4 pg。Note：aPrimersB.c85B5;b.Pr.c54/Bc19;euesaprr4；tplateotsof-re0，1.00，0.60， 0.40，0.20，0.08，0.04 ng and 4，2，0.4，0.2，0.04，0.02，0.004，0.002 and 0.0004pg ，respectively.

圖5DNA梯度稀釋電泳圖

Fig.5DNA gradient dilution electrophoresis image

對于病原菌的檢測工作來講是一項基礎工作，有著極為重要的應用價值和更廣闊的推廣范圍。在PCR的基礎上衍生出的檢測方法，如雙滴式數字PCR[18]，PCR-核酸傳感器[19]，芯片數字PCR[20]等，這些方法在病原菌的檢測方面也初具規模，這些靈敏度上有更高優勢的方法也將是今后不斷改良探索的新方向。

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