井岡山養殖場患病大鯢病原分離鑒定及致病性分析

關鍵詞大鯢；病原菌；致病性；生化特性；耐藥性中圖分類號S966.6文獻標識碼A文章編號 0517-6611（2025）16-0076-05doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.16.016

AbstractInoderarfusefiseasefantlamaderindiiJgashanCitygiroviissuy isolatedpathogenicbacterfromthediseasedgiantsalamanderinthef.Theisolatedstrainsweresubjectedto6SDNAgeneidentifica tionaturalaegiicalactesalsdsiictel sectionsoforansndisusuchsdsples，nsdlivesoftheasdiantsalamadererealspefodtoer histopatololtoulltob wardsiellatadndomoasoieonantcteogtromonsroniisrontgeitydtuallt wounded giant salamanders in a water environment with a bacterial concentration of 5×10⁷ CFU/mL，resulting in 100% mortality of the giant salaade;iltioosoi；ooitil fazolin，ideaoddi；ftadsdio aremainycharacteridbyongestionandabnoalcellucleiTissudyeterinedtatteainpathogenofdiseasedgiantsalades wasAeromonasoiahsulsisgeityoecalppetisdgsistaeractestsdel reference for the prevention and control of epidemics in giant salamander farms.

Key wordsAndrias davidianus;Pathogenic bacteria;Pathogenicity;Biochemical characteristics;Drug resistance

近年來，我國大鯢人工繁殖產業發展迅猛，但大鯢在人工養殖過程中經常會發生疾病，能引發大鯢疾病的病原主要包括病毒、細菌、真菌以及寄生蟲等，但其中細菌性疾病最為多見[1]，且多發生在每年7—8月。楊曉偉等[2]研究發現葡萄牙檸檬酸桿菌感染后大鯢臨床上主要表現為皮膚腐爛、腹部膨脹、腹腔積液等癥狀。高正勇等[3研究發現弗氏檸檬酸桿菌感染大鯢的癥狀與自然發病癥狀相同。蘇英等[4]研究發現弗氏檸檬酸桿菌對健康大鯢的半致死濃度（ LD₅₀ ）為3.16×10⁶CFU/mL 。郝成森等5研究發現感染維氏氣單胞菌致使大鯢發生腹水、皮膚及肢體潰爛；王旭等[°從患腐皮病的大鯢上分離到1株維氏氣單胞菌，該菌可導致大鯢腐皮病。樊汶樵等研究發現肺炎克雷伯菌可導致大鯢“爛腳病”；李曉英等研究發現肺炎克雷伯菌可感染大鯢使其器官出現不同程度的炎癥，其中以壞死性脾炎和肝炎為主。李瑞偉等°研究發現摩氏摩根菌能感染大鯢并使其發病。楊星等[10]研究發現類志賀鄰單胞菌可導致健康大鯢發病。孟彥等[]發現嗜水氣單胞菌是大鯢腹水病的主要病原；孫浩等[12]從江西省某大鯢人工養殖場分離到1株嗜水氣單胞菌，發現它是引起大鯢水腫病的病原菌，且具有很強的致病性；徐景峨等[13]從皮膚潰爛的大鯢體內分離到1株嗜水氣單胞菌，該菌株具有較強的致病力。張海琳等[14]從患病大鯢肝臟中分離到淺黃金黃單胞菌，該菌為優勢菌株，且對鯽魚具有很強的致病性。朱盈名等[15]從皮膚潰爛和腹部腫脹的患病大鯢不同臟器組織上分離到9個不同菌種，并確定弗氏檸檬酸桿菌、摩氏摩根菌、嗜水氣單胞菌、約氏不動桿菌和維氏氣單胞菌混合感染是大鯢發病的主要原因。楊敏等[1從死亡大鯢的腎臟中分離到1株惡臭假單胞菌，發現該菌對鯽魚有較強的致病性。不同地區大鯢養殖場患病大鯢的致病菌不同，即使是同一種致病菌因其生存的地理環境不同，其藥物敏感性和毒力也會存在一定的差異。

江西省井岡山市某大鯢養殖場出現大鯢患病甚至死亡的現象。為弄清原因，筆者從患病大鯢上采集病料，并進行細菌分離及16SrDNA基因鑒定、致病性試驗、致病菌生化特性分析和藥物敏感性試驗，再對患病大鯢的腎、脾、肺和肝等器官組織進行病理切片，觀察其病理組織學變化。從患病大鯢上分離病原菌并對其進行鑒定，對優勢菌株進行致病性試驗，進而確定導致大鯢患病的致病菌株，為大鯢養殖場的疾病防控提供科學指導。

1材料與方法

1.1主要試劑LB液體培養基、LB固體培養基;細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）和DNAMarkerV分子量標準（MD104）購自天根生化科技（北京）有限公司;PremixTaq TM購自寶日醫生物技術（北京）有限公司： 4% 多聚甲醛。

1.2主要儀器冰箱、恒溫培養箱、恒溫搖床、核酸電泳儀、PCR儀、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、分光光度計。

1.3病料采集 江西省井岡山市某大鯢養殖場出現部分大鯢染病和個別大鯢死亡情況，患病大鯢表現為活動減少、食欲不振，足有傷口或潰瘍。以該養殖場的2尾患病大鯢（圖1）作為試驗材料，體長（ 40±2 ） cm ，體質量（ 410±15 ）g；用無菌拭子分別采集患病大鯢傷口、口腔、皮膚、泄殖腔的病原菌，再將拭子浸泡在無菌水中；無菌解剖患病大鯢，并用無菌拭子采集腸道、血液、肝臟的病原菌，也將拭子浸泡在上述無菌水中，然后將經過劇烈振蕩、浸泡拭子的無菌水作為分離病原菌的樣品。

圖1患病大鯢Fig.1Sick giant salamander

1.4病原分離與培養將采集的樣品用滅菌水10倍梯度稀 釋，共5個梯度，然后在無菌條件下劃線接種于LB固體平板 上，每個梯度5個平板， 32^°C 下培養 48h ，挑取合適稀釋梯度 的單菌落，再次劃線接種在LB固體平板上，純化菌落1.5致病性試驗6月齡健康大鯢購自江西靖安冷水澗大鯢養殖場，體長（ 20±3） ） cm ，體質量（ 100±6^° ） g ，在 30% 下飼養于實驗室安靜避光環境中。試驗分3組，I組為養殖水中不加病原菌的健康大鯢5尾，I組為養殖水中加病原菌的健康大鯢5尾，Ⅱ組為養殖水中加病原菌且足部有人工傷口的大鯢5尾，添加病原菌的終濃度均為 5×10⁷ CFU/mL，共觀察20d 。

1.6HE染色試驗對上述\"1.5\"部分中出現染病死亡的試驗組，重新做1次試驗，在試驗第5天對試驗大鯢進行解剖，觀察其病變情況，然后取其腎、脾、肺和肝等器官組織用 4% 多聚甲醛固定，送科研狗儀器測試平臺進行病理切片，HE染色后觀察其病變特征。

1.7生化特性鑒定及藥物敏感性試驗細菌生化鑒定使用細菌生化鑒定試劑盒，根據《伯杰氏系統細菌學手冊》對試驗結果進行鑒定。采用Kirby-Bauer紙片擴散法測定細菌對藥物的敏感性，共使用30種抗菌藥物藥敏紙片。

2 結果與分析

2.1病原菌分離與培養結果分離的病原菌選擇在 32^°C 下培養，而不是 37^°C 或 30% 以下，主要是考慮到大鯢生活環境中有些致病菌的最適生長溫度在 30^qC 以下，有些致病菌的最適生長溫度在 37^°C 左右，在 32^°C 下培養這2種類型的病原菌都能生長。無差別挑取同一稀釋梯度的所有單菌落，再次劃線純化，共得到103個純化菌株，以供后續鑒定。

2.2病原菌的分子鑒定結果從103個分離純化的菌株中提取細菌基因組DNA，然后以27F和1492R為引物對16SrDNA進行PCR擴增，得到DNA片段約 1 450bp 。圖2為部分分離菌株16SrDNA的PCR擴增結果。PCR產物測序后進行比對，最終鑒定出13種細菌，如表1所示。豐度較高的前4種細菌分別為Chryseobacteriumoncorhynchi、布氏檸檬酸桿菌、維氏氣單胞菌、遲鈍愛德華菌，這4種優勢細菌對大鯢是否具有致病性還不清楚，因此用這4種細菌對大鯢做人工感染試驗。除了分離到上述4種優勢細菌外，還分離到摩氏摩根菌、洛菲不動桿菌、Acinetobactertjernbergiae、嗜水氣單胞菌、食酸戴爾福特菌、睪丸酮叢毛單胞菌、透明藉伏氏菌Rossellomoreamarisflavi和Niallianealsonii9種非優勢菌。由于這些細菌的豐度不高或已知對兩棲類的致病性不強，因此對這些細菌未做人工感染試驗。

圖2部分分離菌株16SrDNA的PCR擴增結果Fig.2ThePCRamplificationresultsof16SrDNA fromsome i-solated strains

注：M.DNAMarkerV分子量標準；1～7為部分分離菌株。

Note：M.MolecularweightstandardofDNAMarkerIV；1-7.Partially isolatedbacteria.

表1分離菌株及其單菌落數Table1Isolated strainsand their single colony count

2.3致病性試驗結果Chryseobacteriumoncorhynchi、布氏檸檬酸桿菌、維氏氣單胞菌和遲鈍愛德華菌4種優勢細菌對大鯢的致病性試驗結果如表2所示。其中，Chryseobacteriumon-corhynchi、布氏檸檬酸桿菌和遲鈍愛德華菌3種細菌在試驗觀察期內不僅沒有使大鯢致死，而且大鯢的正常生活也沒有受到影響;在Chryseobacteriumoncorhynchi 感染試驗中前3d大鯢活動頻繁、出現異動，3d后恢復正常；在維氏氣單胞菌感染試驗中，添加維氏氣單胞菌、健康大鯢的I組沒有出現大鯢染病的現象，但添加維氏氣單胞菌、足帶傷口大鯢的Ⅱ組在14d內5尾大鯢全部死亡，由此可推斷出大鯢傷口是導致維氏氣單胞菌感染并使大鯢致死的重要原因。

表2致病性試驗結果

Table2 Pathogenicitytestresults 單位：尾

2.4病理切片HE染色結果維氏氣單胞菌感染大鯢5d后做病理組織切片HE染色，結果如圖3所示。肝臟主要表現為臟器充血發紅，細胞出現腫脹，細胞骨架普遍受損嚴重，幾乎找不到一個完整的細胞骨架，部分細胞核著色淺、偶有崩解現象（圖3A）；脾臟細胞核染色質著色淺、細胞核多不規則，部分細胞核有崩解現象（圖3B）；腎臟主要表現為細胞腫脹，細胞核染色質著色淺且核內呈斑點狀，腎小球上皮細胞有脫落現象（圖3C）；肺臟無明顯病理變化（圖3D）。

圖3維氏氣單胞菌感染大鯢的組織病理學觀察（HE染色， 400× 一

2.5生化特性鑒定及藥物敏感性試驗結果分離到的維氏氣單胞菌可以分解利用蔗糖、葡萄糖和甘露糖;V-P試驗、氧化酶和精氨酸脫羧酶均呈陽性；能在無鹽胰陳水和 3%NaCl 胰陳水中生長；分離菌株對蛋白陳水、乳糖、肌醇、阿拉伯糖、賴氨酸脫羧酶、硫化氫、尿素、鳥氨酸脫羧酶 6%NaCl 胰肺水

9項生化指標均呈陰性（表3）。參照《常見細菌系統鑒定手 冊》，這些生化特性與維氏氣單胞菌相符，可初步判定該分離 菌株為維氏氣單胞菌。對分離的高致病性維氏氣單胞菌采 用Kirby-Bauer紙片擴散法進行藥物敏感性試驗，結果如表4 所示。該維氏氣單胞菌對哌拉西林、環丙沙星、頭孢曲松、諾 氟沙星、氧氟沙星、頭孢哌酮、呋喃唑酮、頭孢他啶、頭孢呋 辛、丁胺卡那、多西環素和氯霉素敏感，對頭孢氨芐、復方新 諾明、羧芐西林、頭孢拉定、慶大霉素、卡那霉素、多黏菌素 B、新霉素、四環素和米諾環素中度敏感，對苯唑西林、頭孢唑 啉、麥迪霉素、氨芐西林、萬古霉素、紅霉素、克林霉素和利福 霉素耐藥。以上結果表明分離到的維氏氣單胞菌耐藥現象 嚴重，并存在多重耐藥現象，

3討論

學者通常用一定濃度的菌液對大鯢腹腔注射的方法研究某種菌對大鯢的致病性，往往會得出該菌對大鯢有致病性的結論，但在自然環境中該菌是否會感染并使大鯢發病甚至致死取決于多種條件，比如該菌在水中的濃度、水溫、大鯢的自身抵抗力等。此外，菌液直接注射到大鯢體內容易讓大鯢患病，但在自然狀態下細菌很難大量進入大鯢體內，即使是優勢菌也很難達到快速致病的濃度，所以更難進入大鯢體內使之染病。該研究中維氏氣單胞菌對大鯢的致病性試驗并非采用菌液腹腔注射法[4-5，13]，而是在自然狀態下使其感染，讓試驗盡可能在自然狀態下完成，使試驗結果更加真實可靠。敖弟書等[17]的研究結果與這個判斷相一致，他們在水環境自然條件下用遲鈍愛德華菌感染大鯢，大鯢可正常生活；若遲鈍愛德華菌用注射腹腔法感染大鯢，則使大鯢死亡。

表3維氏氣單胞菌生化鑒定結果

Table3 Theresultsofbiochemicalidentification forAeromonasveronii

注： + 為陽性，-為陰性。 Note： + indicatedpositive，-indicatednegative.

表4維氏氣單胞菌藥敏試驗結果

Table 4 Drug susceptibility test results of Aeromonasveronii

注：R表示耐藥（ d?13mm ）；I表示中度敏感（ 13mm20mm ）Note：R.Resistant（ d?13mm ）;I.Intermediate（ 13mm20mm ）

該研究從患病大鯢上分離到13種細菌，其中嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、摩氏摩根菌3種細菌在朱盈名等5的試驗中同樣也分離到；嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌都是大鯢的致病菌，其中嗜水氣單胞菌可導致大鯢水腫[11-12]和皮膚潰爛[13]，維氏氣單胞菌可使大鯢發生腐皮病[5-6]。該研究結果表明維氏氣單胞菌可使大鯢感染致死，而嗜水氣單胞菌并不是優勢菌，故未做致病性試驗；傳統上認為摩氏摩根菌是條件致病菌，在該研究中它不是優勢菌，也未做該菌對大鯢的致病性試驗。李瑞偉等[認為摩氏摩根菌對大鯢有強致病性，考慮到試驗采用腹腔注射的方式攻毒，非自然狀態下感染大鯢，因此李瑞偉等°的研究結果并不能說明摩氏摩根菌在自然狀態下對大鯢有強致病性。此外，還分離到洛菲不動桿菌、Acinetobactertjernbergiae、食酸戴爾福特菌、睪丸酮叢毛單胞菌、透明藉伏氏菌、Rossellomoreamarisflavi和Niallianealsonii7種細菌，雖然這些菌具有一定的致病性，但因為這些菌都不是優勢菌，所以未開展致病性試驗。

該研究分離到的第一優勢菌為Chryseobacteriumon-corhynchi，是金黃色桿菌屬的一個種，其對大鯢的致病性試驗沒有發現強致病性，在分類上與其親緣關系最近的菌種為Chryseobacteriumureilyticum[18]，其生物危害程度為V類，因此推測Chryseobacteriumoncorhynchi也是生物危害程度V類菌。該研究分離的第二和第四優勢菌種分別為布氏檸檬酸桿菌和遲鈍愛德華菌，這2種菌在該研究攻毒試驗中對大鯢都沒有致病性。目前尚未見到布氏檸檬酸桿菌對大鯢有致病性的報道。敖弟書等[研究發現正常養殖水環境中遲鈍愛德華菌并不能感染大鯢，但大量灌喂遲鈍愛德華菌會使大鯢出現輕微感染癥狀，若注射感染遲鈍愛德華菌會使大鯢出現明顯感染癥狀甚至導致部分死亡。

維氏氣單胞菌的毒力很強，共有7類毒力因子[19-21]，包括外膜蛋白、毒素、運動相關因子、群體感應系統、蛋白酶、鐵離子獲取系統和分泌系統，有320個毒力相關基因[5]，可見維氏氣單胞菌具有很強的致病性;該菌攜帶磺胺類 Tet（E） 、β -內酰胺類AmpSblaTEM-1BblaCEPH-A3和氨基糖苷類aac（3）-Id 5 個耐藥基因[5，22-23]，對紅霉素、克林霉素、氨芐西林、苯唑西林、麥迪霉素、頭孢唑啉、萬古霉素和利福霉素具有強耐藥性。

4結論

此次試驗從江西省井岡山市某大鯢養殖場患病大鯢上分離到13種細菌，分別為Chryseobacteriumoncorhynchi、布氏檸檬酸桿菌、遲鈍愛德華菌、維氏氣單胞菌、摩氏摩根菌、洛菲不動桿菌、Acinetobactertjernbergiae、嗜水氣單胞菌、食酸戴爾福特菌、睪丸酮叢毛單胞菌、透明藉伏氏菌、Rossellomoreamarisflavi和Niallianealsonii，其中占優勢的維氏氣單胞菌是該研究中患病大鯢的主要病原菌，可以感染大鯢致其死亡。該菌符合維氏氣單胞菌的生化特性，對氨芐西林、苯唑西林、麥迪霉素、克林霉素、頭孢唑啉、萬古霉素、紅霉素和利福霉素具有耐藥性，而對頭孢典松、頭孢呋辛和氯霉素極其敏感，大鯢養殖場可以考慮用這3種藥物進行該病的預防和治療。該研究為江西省井岡山市大鯢養殖場患病大鯢找到了主要致病菌一維氏氣單胞菌，為養殖大鯢疫病預防和治療提供了一定的理論基礎。

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