一測多評法同時測定五爪子中金絲桃苷·蕓香苷和綠原酸的含量

關鍵詞五瓜子；一測多評法;金絲桃苷;蕓香苷;綠原酸;相對校正因子

中圖分類號R284文獻標識碼A

文章編號 0517-6611（2025）16-0175-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.16.038

AbstractObectie]Tstablishmetdofquantiativeanalysisofulti-ompoentsbygle-markrQAM）forsultaeoslyete mining the content of hyperoside，rutin，and chlorogenic acid in Wuzhaozi.[Method] Using Agilent HC- C₁₈（2） chromatographic column （ 4.6mm×250mm ， 5μm ），with acetonitrile（A） -0.1% formic acid（B） as mobile phase，gradient elution，column temperature of 30^qC ， flow rate of 1mL/min ，injection volume of 15μL ，detection wavelength of 360nm .Using chlorogenic acid as the internal reference，calculated therelativecorrectionfactor（RCF）betwnclorogicacidndhyperoside，rutin，andevaluatetedurabilityofCF；comparedadaalyzedtheresultsof theQAMSmethodwiththeexteraltandardmethod（ESM）.Result]Hypercintinandchlorogenicacidhadagd linear relationship within a certain range （ R²≥0.9988 ），and the system adaptability test，precision，repeatability，stability，and spiked recoveryratealletteeqremnts；tratoreonfactosfoperosidadutwereclaedt.9nd.esp tively，andthfctsofolutmperature，foate，ndjectionamoutonCFererelativelysallwitiertainrangethreas nosignficantdiferenceintemeasuementresultsbetweeQAMSndESM.Conclusion]TemetodofQAMSestablishedintisudycan beusedtodeterineteontentofhyperoside，utin，ndchlorogenicacidinWuzhaozi，andcanprovidereferencefortequalityevauation of it.

KeywordsWuzhoz;Metodofquantiativeaalyssofulticompoentsbysing-marker;Hyproside;utin;Chlrogenicacid;elative correctionfactor

五爪子為五加科植物刺五加［Acanthopanaxsenticosus（Rupr.et Maxim.）Harms]的葉，因其由五枚掌狀小復葉組成而得名[1]。據《神農本草經》記載，刺五加具有安神補腦、益氣養脾、補腎壯陽、活血化瘀、清熱解毒等功效，通常用于體虛乏力、失眠多夢、食欲不振等癥狀[2]。在甘肅、陜西等地區，人們常在4月初采摘刺五加葉食用，營養價值極高。臨床研究發現其可用于預防和治療高血壓、冠心病、腦血栓、糖尿病等疾病[3]。

現代研究表明刺五加葉與其傳統的藥用部位根和根莖相比，具有類似的活性成分和藥理作用，這些活性成分主要包括黃酮類、皂苷類、有機酸類、多糖類等[4-6]。其中，黃酮類成分占比最大，高達 37.25% ，目前已發現刺五加葉中的黃酮類化合物主要有金絲桃昔、槲皮素和蕓香苷，它們均具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤、保護心腦血管等藥理作用[7-8]。此外，有機酸類化合物綠原酸在刺五加葉中的含量也較為豐富，并具有明顯的抗疲勞作用[9]。由于黃酮類和有機酸類化合物均對刺五加葉的藥用療效起到了關鍵作用，故常被作為刺五加葉質量控制的重要指標。在對刺五加葉的質量控制方法研究中，雖然已有利用液相色譜技術如RP-HPLC、UPLC-DCD法同時測定刺五加葉中黃酮類、有機酸類等成分的研究，但是這些研究方法都需要有充足的化學對照品[10-11]。由于中藥的化學對照品提取分離非常困難且價格昂貴，導致質量檢測成本過高，限制了其在中藥質量控制中的廣泛應用。王智民等[12]于2006年首次提出將一測多評（QAMS）法用于中藥多個成分質量評價中，即選擇一個穩定性好、易于獲取且廉價的成分作為內參物，然后通過建立內參物與其他待測成分的相對校正因子，來實現同時對多個成分進行質量評價。目前，關于QAMS法測定刺五加葉中多個成分含量的相關報道較少，如關欣等[13]采用QAMS法對刺五加葉中多個酚類成分進行了含量測定。該試驗在已有檢測方法的基礎上，通過建立一測多評法來同時測定五爪子中金絲桃苷、蕓香昔、綠原酸的含量，為科學評價五爪子質量提供參考依據。

1試驗材料

1.1儀器LC-20A高效液相色譜儀，島津有限公司;1000型高速粉碎機，武義海納電器有限公司；SY-500超聲提取器，上海寧商超聲儀有限公司；SQP分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司;SHB-111循環水式真空泵，河北博匯儀器有限公司；TD5A離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；60目篩網，成都企航儀器有限公司； 0.45μm 微孔濾膜，上海新亞凈化器件廠；移液槍， ，力辰科技有限公司。

1.2試劑金絲桃苷對照品（ ?98% ，士峰生物科技有限公司）；蕓香苷對照品（ ?98% ，士峰生物科技有限公司）；綠原酸對照品（ 98% ，士峰生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，天津市富寧精細化工有限公司）；乙腈（色譜純，山東禹王實業有限公司）；甲酸（色譜純，西隴科學股份有限公司）。

1.3藥材該試驗藥材采摘自陜西省隴縣固關鎮的刺五加 嫩葉，經鑒定為刺五加[Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms]。

2試驗方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1樣品溶液的配制。將刺五加葉置于陽光下晾曬 檢查質地，確保其干燥后粉碎，過60目篩，精密稱取粉末5.0501g ，置 100mL 具塞錐形瓶中，量取甲醇溶液 50mL 加入錐形瓶中進行超聲波輔助提取（功率 $3 0 0 ～ ＼mathrm { ＼textW }$ ，溫度 40% ，時間 45min ），提取完成后，待樣品冷卻，用甲醇補充提取過程中失去的重量并進行抽濾，然后離心，轉速設為 3000r/min ，離心 20min ，取上清液。最后用 0.45μm 的微孔濾膜對提取液進行過濾，即得樣品溶液，陰涼處存放備用[14]

2.1.2混合對照品溶液的配制。精密稱取金絲桃苷、蕓香苷、綠原酸對照品適量，分別轉移置 10mL 容量瓶中，加甲醇溶解后定容，配制成質量濃度分別為 1.06，1.02，1.05mg/mL 的單一對照品溶液。再精密吸取各單一對照品溶液 2mL 置于 20mL 容量瓶中，加甲醇定容后搖勻，配制質量濃度分別為 0.106，0.102，0.105mg/mL 的混合對照品溶液A;精密量取1.0，1.5，2.5，3.0，4.0mL 混合對照品溶液A分別轉移到 5mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，稀釋成不同濃度的混合對照品溶液，標記為混合對照品溶液A1、A2、A3、A4、A5，冷藏保存備用。

2.2高效液相色譜參數色譜柱為 Agilent HC-C₁₈（2） ，250mm×4.6mm，5μm ；流動相為乙腈 （A）-0.1% 甲酸溶液（B），梯度洗脫： 0～5min 10%～10%A 5～10min 10%～25% A; 10～20min 25%～25% A; 20～25min 25%～10%A ;柱溫30% ，檢測波長 360nm ，流速 1mL/min ，進樣量 15μL ，分析時間 25min 。

2.3 方法學考察

2.3.1系統適用性測試。吸取適量甲醇溶液注入進樣瓶中，設置色譜參數，進樣檢測。結果表明，空白溶劑甲醇對檢測結果無干擾。再吸取“2.1.1\"項下的樣品溶液和“2.1.2”項下的混合對照品溶液A適量，分別注人進樣瓶中，設置色譜參數，進樣檢測，測定結果見圖1。由圖1可知，樣品溶液色譜圖中目標成分的吸收峰與混合對照品溶液色譜圖的吸收峰位置相對應，且相鄰兩峰的分離度均大于1.5，符合要求；拖尾因子均接近1，即色譜峰的對稱性良好，符合要求。按照“2.2”色譜條件下，對照品和樣品中目標成分的分離效果均較好，能夠準確地對目標成分進行定性分析，也為下一步定量分析奠定了基礎。

圖1混合對照品溶液（A）與樣品溶液（B）HPLC色譜圖

Fig.1The HPLC chromatograms of the mixed reference solution（A）and the sample solution（B）

2.3.2線性關系考察。精密吸取“2.1.2\"項下各單一對照品溶液 5，10，20，50，100，200μL 依次注入進樣瓶中，加甲醇稀釋成6個不同濃度的單一對照品溶液，設置色譜參數，進樣檢測，并記錄峰面積。再以各種成分的質量濃度作為自變量（x） 、色譜峰面積作為因變量 （y） ，繪制出各種成分的標準曲線，如圖2所示。

通過數據處理得到每個成分的線性回歸方程、線性擬合效果的相關系數（ ?R² ）及線性檢測范圍，記錄結果見表1。由表1可知，待測成分的線性相關系數 （R²） ）均不小于0.9988，表明金絲桃苷、蕓香苷和綠原酸的質量濃度與色譜峰面積在各自分析范圍內具有良好的線性關系，即在后續的定量分析中可以通過測定色譜峰面積來確定樣品中各成分的含量。

2.3.3精密度試驗。吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液A適量，注入進樣瓶中，設置色譜參數，連續進樣5次，并記錄峰面積。計算每個成分峰面積的相對標準偏差（RSD），結果見表2。由表2可知，金絲桃苷、蕓香苷和綠原酸峰面積的RSD分別為 0.11%0.35%0.29% ，表明此次試驗所使用的高效液相色譜儀具有良好的精密度。

圖2金絲桃苷（a）、蕓香苷（b）和綠原酸（c）的標準曲線

Fig.2The standard curves of hyperoside（a）， rutin（δb） and chlorogenic acid（c）

表1金絲桃苷、蕓香苷及綠原酸的線性關系考察結果

Table1 Theresultsof the linearrelationship investigationof hyperoside，rutinandchlorogenicacid

表2精密度試驗結果Table2The results of precision test

2.3.4重復性試驗。依照“2.1.1\"項下方法，平行制備5份樣品溶液，設置色譜參數，依次進樣測定，記錄峰面積，并計算每個成分峰面積的RSD，結果見表3。由表3可知，金絲桃苷、蕓香苷和綠原酸峰面積的RSD分別為 1.11%，1.36% 、0.45% ，表明此次試驗方法具有良好的重復性。

表3重復性試驗結果

Table3Theresultsofrepeatability test

2.3.5穩定性試驗。精密稱取刺五加樣品 2.5041g ，按照“2.1.1\"項下方法，重新配制樣品溶液，將其放置在室溫下中 20～30°C? ，分別在 0.3，6，12，24h 進行采樣，進樣檢測，記錄峰面積，并計算每個成分峰面積的RSD，結果見表4。由表4可知，金絲桃苷、蕓香苷和綠原酸峰面積的RSD分別為1.24%.0.26%.0.65% ，表明此次試驗的樣品溶液在 24h 內具有良好的穩定性。

表4穩定性試驗結果

Table4Theresultsofstabilitytest

2.3.6加標回收率試驗。控制供試品與標準品溶液濃度比為 1：1 ，確定加標體積，再加入樣品溶液至 1mL ，按照此方法，每種成分平行3組，制備加標溶液。依次進樣檢測，記錄峰面積，并計算加標溶液的濃度和加標回收率，結果見表5。由表5可知，金絲桃苷、蕓香苷和綠原酸的平均加樣回收率分別為 96.58%92.39%.99.32% ，RSD分別為 1.77%.2.35% 、1.18% ，表明此次該驗方法具有良好的準確性。

2.4相對校正因子的確立在構建一測多評法時，確立內參物與其他指標成分的相對校正因子是最為關鍵的一步，因為相對校正因子一旦確定，便被作為一個常數，應用于后續的定量分析過程中。王智民等[15]最初采用多點校正法計算相對校正因子，隨后，何兵等[16]又提出了斜率校正法作為計算相對校正因子的新方法。

2.4.1多點校正法。吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液A1、A2、A3、A4、A5適量，注入進樣瓶中，設置色譜參數，進樣檢測，并記錄峰面積，然后以綠原酸作為內參物，分別計算綠原酸與金絲桃昔、蕓香昔的相對校正因子，計算公式如下：

表5加標回收率試驗結果Table5The determinationresultsof recovery withspiked standards

f_SR=f_S/f_R=（A_s×C_R）/（C_s×A_R）

式中 ?f_SR 為內參物與其他組分之間的相對校正因子； C_s 為內參物對照品的質量濃度： Ω_SA_S 為內參物對照品的峰面積； C_R 為其他對照品的質量濃度； A_R 為其他對照品的峰面積[15]。計算結果見表6。由表6可知，金絲桃苷與蕓香苷的相對校正因子分別為 0.6705，0.8989 。

表6綠原酸與其他待測組分之間的相對校正因子

2.4.2斜率校正法。根據“2.3.2\"項下所建立的內參物及待測成分的標準曲線，將曲線斜率帶入公式 ，式中， K_s 為內參物綠原酸標準曲線的斜率（ K_s=5674.9 ） K_R 為金絲桃苷和蕓香苷標準曲線的斜率，分別為 8494.1，6194.7 。計算得出金絲桃苷和蕓香苷的相對校正因子分別為 0.668 1 、0.916 1。

2.5 相對校正因子的耐用性考察

2.5.1不同流速對相對校正因子的影響。吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液A適量，置于進樣瓶中，按照“2.2”項下色譜參數，只改變流速 （0.8、1.0、1.1mL/min） ，考察不同流速對金絲桃苷和蕓香昔相對校正因子的影響，結果見表7。由表7可知，金絲桃苷和蕓香苷相對校正因子的RSD分別為 1.45% 、1.21% ，表明不同流速對相對校正因子未產生顯著影響。

2.5.2不同進樣量對相對校正因子的影響。吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液A適量，置于進樣瓶中，按“2.2”項下色譜參數，設置進樣量分別為 10，15，20μL ，考察不同進樣量對金絲桃苷和蕓香苷相對校正因子的影響，結果見表8。由表8可知，金絲桃苷與蕓香苷相對校正因子的RSD分別為0.84% 、 1.16% ，表明不同進樣量對相對校正因子未產生顯著影響。

表7不同流速對相對校正因子的影響

表8不同進樣量對相對校正因子的影響

2.5.3不同柱溫對相對校正因子的影響。吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液A適量，置于進樣瓶中，按照“2.2”項下色譜參數，設置柱溫分別為 25，30，35°C ，考察不同柱溫對金絲桃苷和蕓香苷相對校正因子的影響，結果見表9。由表9可知，金絲桃苷與蕓香苷相對校正因子的RSD分別為 1.55% 1.99% ，表明不同柱溫對相對校正因子未產生顯著影響。

表9不同柱溫對相對校正因子的影響

Table9The effectsofdifferentcolumn temperature on relativecorrection factor

2.6待測成分的色譜峰定位方法在使用一測多評法對樣品中待測成分的色譜峰進行定位時，由于對照品只有內參物一個，所以無法通過將每一個對照品的保留時間與樣品中待測成分的保留時間一一對應來進行定位。為了解決這個問題，通常會采用保留時間差法或相對保留時間法定位，但根據相關文獻報道，保留時間差法在不同色譜柱和儀器上的時間差值波動較大，會影響定位的準確性[17]。所以，該試驗選擇相對保留時間法定位，首先通過內參物綠原酸（s）和其他2種對照品（i）的保留時間 （r） ，計算相對保留時間（ RRT= r_i/r_s ），然后在樣品中找到近似值的相對保留時間進行定位。如在圖1中，峰1綠原酸的保留時間為 8.002min ，峰2蕓香苷的保留時間為 16.769min ，計算得蕓香苷的RRT為2.096，故在樣品中RRT接近2.096的色譜峰就定位為蕓香昔，同法定位金絲桃昔。

2.7QAMS法與EMS法檢測結果比較精密稱取樣品適量，按“2.1.1\"項下方法配制供試品溶液，平行配制5份，確保試驗結果的準確性，再按“2.2”項下色譜參數，進樣測定，記錄峰面積。最后采用QAMS法和EMS法分別計算樣品中金絲桃苷、蕓香苷、綠原酸的含量，并通過計算相對誤差（RE）來評估2種方法的精確度。計算公式如下：

ESM：C_x=（A_x-b）/a

式中： C_x 為樣品中目標成分的濃度; C_s 為樣品中內參物的濃度： Ω_AX 為樣品中目標成分的峰面積; A_s 為樣品中內參物的峰面積[18]； a 為標準曲線的斜率； b 為標準曲線的截距。

樣品含量計算結果見表10。由表10可知，2種方法的RE 均小于 3% ，表明采用一測多評法和外標法所測定的樣品中金絲桃苷、蕓香苷和綠原酸的含量結果基本一致。

表10QAMS法與ESM法測定結果比較

Table10Comparison of the resultsobtainedbyQAMSand ESM methods

3討論

該試驗參考一測多評（QAMS）法建立的技術指南[15]，選擇待測成分中含量相對較高、穩定性較好、價格低廉的綠原酸作為一測多評法的內參物。然后采用多點校正法和斜率校正法，對金絲桃苷、蕓香昔的相對校正因子進行了計算，結果顯示2種方法計算得到的相對校正因子沒有顯著差異，故選擇2種方法的算術平均值作為最終的相對校正因子，即金絲桃苷和蕓香苷的相對校正因子分別為 0.669 3、0.907 5 。此外，還對相對校正因子的耐用性進行了考察，即考察不同流速、不同進樣量、不同柱溫對相對校正因子的影響，結果顯示RSD均小于 5% ，進一步證實了選擇綠原酸作為內參物建立一測多評法的可行性。最后，將QAMS法與外標法（EMS）的含量計算結果進行對比分析，結果表明2種方法測得的含量無明顯差異，說明該試驗建立的QAMS法具有良好的準確性。

4結論

該試驗建立了以綠原酸為內參物，同時測定五爪子中金絲桃苷和蕓香昔含量的一測多評方法，并通過一系列方法學的考察證實了該方法的穩定性、準確性和可行性，實現了只需要測定綠原酸一個對照品就可以通過相對校正因子計算出金絲桃苷和蕓香苷的含量，這對于解決對照品不穩定、保存困難、稀缺、昂貴和檢測成本高等問題具有積極作用。因此，該試驗所建立的一測多評法可以為科學評價五爪子的質量提供參考依據。

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