小葉楊DREBID基因的克隆及單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析

中圖分類號：S722.3 文獻標識碼：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2025.05.003

CloningandSNPAnalysisoftheDREBlDGenein Populussimonii

Wang Jianyi

（ShanxiAcademyofForestryand Grassland Sciences，Taiyuan O3oo12，China）

AbstractInordertofullyexploretheexcelentstressresistanceofPopulussimonii，teDREBIDgeneofPopulussimoniiwasloned andsequenced，anditsgenesequenceandlinkagedisequlibriumcharacteristicswereanalyzed.TheresultssowedthattheEB geneof Populussimoni hadnointron，andthelengthof DREBIDgene was8Oo bp.Thegenecontainedacompleteopenreading frameand could encode a protein witha length of240amino acidresidues.The molecular weightof the protein was about ， andthe isoelectricpoint was4.85.The homologyofDREBIDsequence betweenPopulussimoni andPopulus trichocarpa wasashigh as 90% .TheSNP frequencyinthegenewas0.04375，andthere were5commonsingle nucleotidepolymorphisms（SNPs），30rare SNPs，24misensemutationsand11nonsensemutations.ThelinkagedisequilibriumhasbeendegradedintheDREBIDgeneof Populus simoni.

eyWordsPopulus simonii;DREBID gene;transcription factor;SNP;linkage disequilibrium

小葉楊（Populussimonii）是我國北方重要的鄉(xiāng)土樹種，以其抗旱、耐低溫和耐瘠薄等特性，在生態(tài)建設和經(jīng)濟發(fā)展中占據(jù)重要地位。然而，當前研究多集中于毛白楊（ P. tomentosa）美洲黑楊（P.deltoides）和歐美楊（ P. euramericana）等速生楊樹，這些樹種因生長速度快而備受關注。相比之下，小葉楊的資源保護和開發(fā)未得到足夠重視，面臨資源退化甚至滅絕的風險。近年來，隨著生態(tài)意識的增強和對生物多樣性保護的重視，小葉楊的抗逆特性和資源保護逐漸受到關注，其在抗性育種中的重要性日益凸顯[3-5]。

DREB（DehydrationResponsiveElementBinding）轉錄因子是植物響應干旱、低溫等逆境脅迫的關鍵調控因子。DREB家族成員根據(jù)其結構和功能被分為多個亞家族，其中DREB1D在調控植物逆境脅迫響應中具有重要作用。本研究旨在通過克隆和分析小葉楊DREBID基因，揭示其在小葉楊抗逆性中的潛在功能[6-8]。深入研究小葉楊DREB1D基因的分子遺傳機制，對于揭示其抗逆性狀的遺傳基礎具有重要意義。通過克隆和測序DREB1D基因，分析其基因序列和連鎖不平衡特征，可以為小葉楊的基因輔助育種提供重要理論依據(jù)。篩選出更耐旱、耐鹽堿的小葉楊新品種，并利用這些新品種營造防風固沙林和水土保持林，對于保障三北地區(qū)生態(tài)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義[1，9-10]。

本研究以小葉楊為研究對象，克隆并測序了DREB1D基因，分析了其基因序列和連鎖不平衡特征。為小葉楊DREB轉錄因子基因的連鎖不平衡作圖和基因輔助抗逆性狀的分子育種提供了理論支持，也為進一步挖掘小葉楊的抗逆基因資源奠定了基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料

小葉楊材料分別采自山西（1—4號）北京（5—8號）內蒙古（9—12號）吉林（13—16號）山東（17—18號）河南（19—24號）遼寧（25—28號）自然群體，從中隨機選擇了27株個體。為了確保樣本的代表性和準確性，每個樣本之間保持 100m 以上的間隔距離。在選定的小葉楊個體上，選擇生長健康、無明顯病蟲害的當年生嫩葉 6～10 片，將其迅速放人裝有冰袋的采樣箱中，以保持樣本的新鮮度。采集完成后，盡快將樣本帶回實驗室，在 -80^°C 的超低溫冰箱中保存，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法進行DNA提取，將提取好的DNA樣本保存于 -20°C 冰箱中備用。試驗于2021年3月在山西省林科院進行。

1.2 DREBID基因的克隆

利用NCBIORFFinder查找DREB1D基因完整的開放閱讀框（openreadingframe，ORF），用Primer5.0設計特異性引物（DREB1DF1：5'-CCTCTCAAAAGTTGAAACTgC-3'，DREB1DR1：5'-ACTgTAACTATGGCACTACG -3^ν ），以小葉楊的cDNA作為PCR擴增的模板，使用 1.5% 凝膠電泳檢測，用OMEGA（D2500）GetExtractionKit回收純化產(chǎn)物，用pEASY-Blunt克隆載體連接，將重組質粒轉化到大腸桿菌 DH5α 中（圖1），選擇單個菌落進行PCR驗證，取陽性菌溶液測序。獲得測序結果后，使用DNAMAN軟件將測序結果與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，并分析其序列特征。

圖1轉化后的大腸桿菌培養(yǎng)平板

1.3DREB1D基因序列及連鎖不平衡分析

將PCR擴增產(chǎn)物送至奧科生物公司進行測序，測序前可對PCR產(chǎn)物進行純化處理，以提高測序質量。通過比對和校正，得到高質量的DREB1D基因序列。將27個樣本的DREB1D基因序列導人到多序列比對軟件ClustaIX中進行比對。根據(jù)比對結果，找出序列中存在差異的位點，這些位點即為SNPs位點。通過分析基因序列，標注SNPs位點、計算SNPs頻率、轉換和顛換的SNPs數(shù)量。分析27個基因型個體的連鎖不平衡。應用Exce12019處理試驗數(shù)據(jù)，用ClustaIX軟件進行數(shù)據(jù)分析，用DNASP4.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1DREBID基因克隆及其結構分析

以擬南芥AtDREB1D的氨基酸序列為信息探針，通過篩選毛果楊（Populustrichocarpa）和楊樹EST全基因組數(shù)據(jù)庫，得到毛果楊DREBID的DNA序列[5-9]。根據(jù)理論序列，設計一對引物擴增編碼區(qū)全長，在對27個樣品的DREB1D基因進行PCR擴增后，發(fā)現(xiàn)不同個體的擴增片段大小存在差異。如圖2所示，大多數(shù)樣品的擴增片段大小約為800bp，與預期的DREB1D基因長度一致。然而，樣品05和24的擴增片段長度從約800bp延伸到 850bp ，與毛果楊的DREB1D基因長度一致。另一方面，樣品01和17的擴增片段長度從約800bp延伸到960bp，這一長度在其他樣品和毛果楊中均未觀察到。這種片段大小的差異可能與基因序列中的插入或缺失變異有關，也可能與引物結合位點的序列變異有關。進一步的測序分析將有助于明確這些變異的具體性質。

根據(jù)測序結果顯示，分離的DREBID基因片段總長度與理論上EST整合的核苷酸序列完全一致，故命名為DREB1D。在小葉楊的DREB1D序列中，該基因包含一個完整的，大小為720bp的開放閱讀框，可編碼長度為240個氨基酸殘基的蛋白質，該基因的5'UTR、3'UTR長度分別為37bp和40bp，基因內部沒有內含子。因此，DREBID的基因組DNA與cDNA序列完全一致。使用DNAman軟件估算該蛋白質的估計分子量為 33KDa ，其等電點為4.85。

2.2 DREBID基因結構特征

從表1可以看出，DREBID基因是一個沒有內含子且較短的基因。相關學者普遍認為，內含子有利于儲存更多的遺傳信息，有利于突變和進化，如果在連接序列處發(fā)生突變，會影響正常的剪切模式，使蛋白質結構發(fā)生很大變化，提高進化速度。因此，該基因中缺乏內含子可能意味著該基因沒有存儲太多遺傳信息。

表1小葉楊DREBID基因的結構

從表2和表3可以看出，整體來說，小葉楊DREB1D基因的SNPs頻率并不是非常高，僅為0.04375左右，即1/23，且常見SNP僅5個，這表明純化選擇對該基因的作用較為明顯。然而，在編碼區(qū)的35個SNP中，有24個是錯義突變，這一結果表明，DREB1D基因的編碼區(qū)可能受到較強的選擇壓力。這種選擇壓力可能源于該基因在調控植物逆境響應中的關鍵功能，以及需要通過多種氨基酸替換來適應不同的環(huán)境脅迫條件。高頻率的錯義突變可能反映了自然選擇對功能多樣性的需求，同時也提示該基因在進化過程中需要平衡保守性和多樣性。有關研究表明，第2密碼子位點是最保守的[910]，因為第3密碼子位點的變化對氨基酸的影響很小。因此，應該關注DREBID基因密碼子第1點的變化，這可能會帶來新的收獲。

從表4可以看出，在小葉楊DREB1D基因的35個SNPs中，28個屬于轉換，而只有8個屬于顛換，轉換與顛換的比例為3.5：1。相關研究表明，人類基因組中的SNP轉換與顛換的比例約為2：1。主要原因可能是SNP在CG序列中出現(xiàn)頻率最高，且多數(shù)為（ .T 。C^′ T的原因是CG中的C，即胞嘧啶，經(jīng)常被甲基化，自發(fā)脫氨后變成胸腺嘧啶。

表4基因替換類型

2.3不同采樣地小葉楊DREBID基因間的系統(tǒng)發(fā)育進化分析

通過將毛果楊與來自不同隨機采集點的27個小葉楊樣品的DREBID基因進行比較，結果見圖2。從圖2可以清楚地看到05和24與CK（毛果楊）的關系更密切。通過ClustaIX軟件分析發(fā)現(xiàn)，在DNA序列中，樣本05和24從約800bp開始，到850bp結束，存在與毛果楊長度一致的序列。另一方面，01和17從大約 800bp 開始，到 960bp 結束，有一個更長的序列，這在其他樣品和毛果楊中都不存在。結果表明，小葉楊DREBID基因的內部變異較大，進化速率不一致。

圖2小葉楊種內個體間同源進化樹

2.4DREBID蛋白質一級結構特征及其系統(tǒng)發(fā)育進化分析

與已發(fā)表的擬南芥基因序列相比，發(fā)現(xiàn)小葉楊的DREBID基因序列與擬南芥的DREBID基因高度同源，同源性達到 74% ，因此命名為PsDREB1D。為分析小葉楊PsDREB1D蛋白的一級結構特征，利用PrimerPremier軟件推導DREB1D的氨基酸序列。并與毛白楊（Populustomentosa CBF2）煙草（NicotianatabacumAVR9）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、辣椒（Capsicumannuum）菜棕（Sabalpalmetto）蘋果桉（Eucalyptusgunnii）、垂枝樺（Betula pendula、DREB1 transcription factor3）、番茄（Lycopersiconesculentum，CBF2）野生大豆（Glycinesoja，droughtresponsiveelementbindingprotein）、芥菜（Brassicajuncea）蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）河岸葡萄（Vitisriparia）、歐洲油菜（Brassicanapus）、芥藍（brassicaoleracea）毛果楊（Populustrichocarpa，簡稱CK）、小葉楊（PsDREBID）進行同源比較和結構分析，結果見圖3。

從圖3可以清楚地看到，小葉楊PsDREBID基因與毛果楊的相應基因同源度極高，高達 90% 。與煙草Avr9基因的同源性達到 60% 。與毛白楊和桉樹基因的同源度分別達到 50% 和 48% 。圖3中其他植物與小葉楊的同源關系基本上在 44%～70% 。通過NCBI的檢索，沒有在動物中發(fā)現(xiàn)DREBID基因，說明該類基因僅在植物中存在，對植物的抗性產(chǎn)生影響[。在大部分菌類中，也沒有發(fā)現(xiàn)該基因[5-。

圖3小葉楊PsDREBID與部分其他植物DREB的無根系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.5 連鎖不平衡（linkagedisequilibrium，LD）分析

采用DNASP4.0軟件分析小葉楊27個基因型個體中DREB1D基因的連鎖失衡，結果如圖4所示，隨著DREB1D基因核苷酸序列長度的增加，SNPs的連鎖不平衡逐漸減弱，在長度達到約740bp時完全消失。這表明在候選基因內部進行LD分析是可行的。然而，由于整個楊樹基因組的LD衰減速度較快，且重組頻率較高，基于整個基因組水平的LD分析在技術上難以實現(xiàn)，且成本較高，因此，對于小葉楊DREB1D基因的研究，基于候選基因的LD分析是更為高效和經(jīng)濟的方法。

圖4小葉楊DREBID基因的連鎖不平衡R

群體遺傳學理論，罕見變異可能比常見變異更晚出現(xiàn)，更有可能代表群體的特異性。為了排除假SNP，結合重復測序和雙向測序策略，有效降低了檢測誤差。

值得注意的是，植物基因組中的SNP密度普遍高于人類基因組。例如，玉米中每57bp存在1個SNP[14]，而大豆中每272bp存在1個SNP[3]，人類基因組中平均每1000bp存在1個SNP[15]。這表明植物基因組中的SNP資源極為豐富，具有巨大的開發(fā)潛力[6-17]。小葉楊DREBID基因的SNP分析顯示了較高的遺傳多樣性，為后續(xù)的遺傳學研究和分子育種提供了重要基礎。

研究發(fā)現(xiàn)，小葉楊DREBID基因無內含子，長度為 800bp ，包含完整開放閱讀框，編碼240個氨基酸殘基的蛋白質，分子量約 ，等電點為4.85。無內含子的基因結構可能使基因表達調控更為直接和高效，在面臨逆境脅迫時，能夠快速響應并表達相關蛋白。例如，在干旱、高鹽等逆境條件下，無內含子基因可以避免內含子剪接過程所消耗的時間，迅速合成抗逆相關蛋白，從而增強小葉楊的抗逆能力[]。這一基因結構特點暗示了小葉楊DREB1D基因在抗逆過程中可能具有獨特的優(yōu)勢，為進一步研究其抗逆分子機制提供了重要線索。

小葉楊與毛果楊的DREB1D序列同源性高達90% ，這表明二者在進化上具有較近的親緣關系。從抗逆角度來看，相似的基因序列可能意味著其在抗逆功能上存在一定的保守性。然而，即便序列同源性高，在不同的物種中，由于所處生態(tài)環(huán)境的差異，基因的表達調控和功能可能會有所不同。因此，雖然可以借鑒毛果楊DREBID基因的相關研究成果，但對于小葉楊而言，仍需深人探究其DREBID基因在自身抗逆過程中的具體作用機制，以充分挖掘其獨特的抗逆潛力。

3討論

單核昔酸多態(tài)性（SNP）作為遺傳變異的重要形式，廣泛應用于基因組學研究。然而，傳統(tǒng)的SNP檢測方法多側重于判斷堿基是否發(fā)生突變，難以精準識別突變類型。直接測序法通過對比不同個體的DNA序列，能夠精確識別堿基突變及其類型，是目前篩選SNP的有效手段。盡管如此，直接測序法仍存在誤差，主要源于PCR擴增的假陽性、連接和轉化過程中的突變引入，以及測序本身的誤差。這些誤差可能導致檢測到的突變并非真正的SNP[6，12-13]。在本研究中，檢測到的SNP可能是實驗誤差導致的假突變，也可能是反映基因新突變方向的罕見SNP。根據(jù)

本研究檢測到小葉楊DREBID基因的SNP頻率為0.04375，存在5個常見SNP、30個稀有SNP，以及24個錯義突變和11個無義突變。豐富的SNP位點為小葉楊的抗逆遺傳多樣性提供了物質基礎。錯義突變可能會導致編碼的蛋白質氨基酸序列發(fā)生改變，進而影響蛋白質的結構和功能。在抗逆過程中，這些改變可能會使蛋白質獲得新的抗逆特性，或者增強原有的抗逆功能。例如，某些錯義突變可能會使DREB1D蛋白與其他抗逆相關蛋白的相互作用更加緊密，從而提高小葉楊的抗逆能力。而稀有SNP可能代表了群體的特異性，更有可能反映基因新的突變方向，為篩選具有獨特抗逆性狀的小葉楊種質資源

提供了可能[18-19]連鎖不平衡在小葉楊DREB1D基因中已被降解，這對于基因輔助分子育種具有重要意義。連鎖不平衡的降解意味著基因內不同位點之間的關聯(lián)性減弱，使得在育種過程中能夠更準確地定位與抗逆性狀相關的基因位點。通過對這些位點的選擇和操作，可以更有效地將優(yōu)良的抗逆基因導人到自標品種中，提高育種效率[20-22]。同時，也有助于打破不利基因與抗逆基因之間的連鎖，避免在育種過程中引入不必要的不良性狀，從而培育出具有更強抗逆能力的小葉楊新品種。

林木的抗旱性是一個復雜的數(shù)量性狀，受多個基因的共同調控，單個基因的影響相對較小且可能是多方面的。本研究發(fā)現(xiàn)，小葉楊DREB1D基因的SNP表現(xiàn)出較高的多樣性，且部分SNP可能與抗逆性狀存在關聯(lián)。然而，僅從SNP分析尚不能完全解釋其抗逆機制，未來需要結合更多功能驗證實驗，深人探究這些SNP在抗逆性狀中的具體作用。

綜上所述，本研究對小葉楊DREB1D基因的深入分析為進一步揭示其抗逆分子機制和開展基因輔助分子育種提供了重要的理論依據(jù)。未來的研究可以結合功能基因組學、蛋白質組學等技術，進一步驗證這些SNP位點與抗逆性狀的關聯(lián)性，明確DREB1D基因在抗逆信號傳導通路中的具體作用，為小葉楊的抗逆育種實踐提供更精準的指導。

4結論

本研究成功克隆了小葉楊DREBID基因，揭示了其基因結構和遺傳變異特征。該基因全長 800bp 無內含子，包含一個完整的開放閱讀框，編碼240個氨基酸殘基的蛋白質，分子量約為 ，等電點為4.85。基因的SNP頻率為0.04375，檢測到35個SNP位點，其中，5個為常見SNP，30個為稀有SNP。這些SNP中，24個為錯義突變，11個為無義突變。單核苷酸多態(tài)性分析顯示，小葉楊DREB1D基因具有豐富的SNP位點，平均每23個核苷酸中存在1個SNP，且大多數(shù)為錯義突變。與松樹和桉樹相比，小葉楊DREB1D基因表現(xiàn)出更高的多樣性。這些發(fā)現(xiàn)為小葉楊DREB1D基因的連鎖不平衡作圖和基因輔助分子育種提供了重要的理論基礎。

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