哈茨木霉T9131鑒定及其拮抗病原菌和誘導黃芪抗病的作用分析

中圖分類號：Q945.8 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2025）08-1508-10

Abstract：Thefungus Trichodermaspp.is ubiquitouslydetectableinsoil andplantrots，and it playsacrucial roleinthe biologicalcontrolof agriculture.To explore the influenceof Trichoderma spp.ontheresistanceof Astragalus membranaceus to rotrot，thisstudyisolatedandidentifiedTrichodermaspp.fromAstragalus membranaceusrootrot，andsubsequently investigated itsantagonisticactiononpathogenandanalyzed itsefectsonphysiological indexes of diseaseresistanceof Astragalus membranaceus，determined the typeof Trichodermaspp.throughmorphological characteristics，ITSand tef1 sequenceanalysis，analyzedantagonistic effects of Trichoderma spp.isolate on Fusarium solani HYFS-1 byplate confrontationassy.Thisstudyalso determined thephysiological indexessuch ascatalase（CAT），superoxidedismutase （SOD），phenylalanine ammonia-lyase（PAL），peroxidase（POD）and proline（Pro）to clarify the roleof Trichoderma spp.isolate ininducingthediseaseresistanceof Astragalusmembranaceus.Theresults wereasfollows：（1）TheTrichoderma spptype isolated from Astragalus membranaceus root rotwas identifiedas Trichoderma harzianumandnamed T9131.（2） Theinhibition rate of Trichoderma harzianum T9l31 against Fusarium solani HYFS-1 reached 72%±1% after6days of confrontation.（3）Compared to HYFS-1alone，T9131significantlyenhanced SODactivityat0hafter HYFS-1infection；at the 24 h HYFS-1 infection，T9131markedlyincreasedSODactivity，PODactivity，andProcontent;bythe48hHYFS-1 infection，T9131significantlyelevatedPODactivity，PALactivity，andProcontent.Tosumup，Trichodermaharziaum T9131 cancontrolAstragalus membranaceus rotrotbydirectlyinhibitingthe growthof HYFS-1andinducingtheactivities of SOD，POD，PALandProcontentof Astragalus membranaceus under Fusarium solani HFS-1 stres.Thisresearch will laythefoundationforexploring thebiocontroleffectofTrichodermaharzianumanditsmachanismofresistanceofAstragalus membranaceus root rot.

Keywords：Astragalus membranaceusroot rot，Trichoderma harzianum，Fusarium solani，antagonistic action， physiological index determination

黃芪（Astragalusmembranaceus）是豆科多年生草本植物，分為膜莢黃芪（A.membranaceus）或蒙古黃芪（A.membranaceusvar.mongholicus）兩大類，以根入藥，是藥用價值很高的中藥材（任小霞等，2016）。但是，黃芪根腐病已成為嚴重制約黃芪產業發展的重要因素（馬瑩瑩等，2019）。黃芪根腐病防治措施主要有農業防治和化學防治，但農業防治如輪作等實施困難，化學防治容易引起農藥殘留造成環境污染（任小霞等，2016；高芬等，2019）。生物防治劑作為傳統化學農藥的環保替代品，在病害管理中得到了突出的應用（Singhetal.，2023）。山西大同縣作為黃芪的主產區，目前篩選出的黃芪根腐病生防菌主要以細菌為主，包括芽孢桿菌（Bacillus）G1O（任小霞等，2016）萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）R88（高芬等，2019）和貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）C44（馬紅珍，2023）。然而，生防真菌的篩選報道較少。木霉菌（Trichodermaspp.）是自然界中分布較廣的生防真菌，類型已超370種，其中哈茨木霉（Trichodermaharzianum）因其可防治各種各樣的農作物病原微生物而獲得廣泛關注（Singhetal.，2023）。哈茨木霉常見于溫帶氣候，存在于土壤、其他真菌、腐爛植物和植物體內（Guzman-Guzmanetal.，2023）。它作為一種生物防治劑，主要通過競爭、抗生和誘導植物防御反應來有效抑制植物病原體（Braun et al.，2O18;Guzman-Guzman et al.，2023）。張曉塵等（2024）研究表明哈茨木霉EMF910能抑制寧夏鹽堿地區黃芪根腐病致病菌生長和降低黃芪發病率；本課題組前期研究表明哈茨木霉T9131能顯著提高黃芪對大同縣致病菌腐皮鐮刀菌（Fusariumsolani）HYFS-1的抗性（Niuetal.，2024），但哈茨木霉T9131的鑒定還未見報道。此外，生物防治劑誘導植物對病原體的防御機制是實現植物保護的新途徑（Singh et al.，2014；Niuetal.，2024）。哈茨木霉T9131已被報道通過初期誘導黃芪 H₂O₂ 含量的增加和后期降低 H₂O₂ 含量來抵制HYFS-1 侵染（Niu et al.，2024）。 H₂O₂ 是一種重要的活性氧（reactiveoxygen species，ROS），ROS的積累會促進細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）進而限制病原菌的侵染（Sehrish etal.，2020），但ROS的過度積累會對植物造成損傷（Singhetal.，2023），所以必須嚴格調控ROS的產生與清除。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）能調控 H₂O₂ 含量的變化（Sharmaetal.，2012）。脯氨酸（proline，Pro）也可以作為抗氧化劑調控ROS的平衡（Gratao et al.，2012；Sarkeramp; Oba，2018），并能被木霉誘導積累（Batooletal.，2020；張林等，2023；廉華等，2023）。哈茨木霉T9131是否通過 SOD、POD、CAT 和 Pro 來調控 H₂O₂ 含量有待研究。前期研究還發現從黃芪中提取的總黃酮對腐皮鐮刀菌HYFS-1有顯著抑制作用（牛景萍等，2023）。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonia-lyase，PAL）為黃酮類物質合成的關鍵酶，在植物抵御各種非生物脅迫和生物脅迫中起重要作用（Macdonaldamp;Dcunha，2007）。PAL是否參與哈茨木霉 T9131誘導黃芪抗病有待研究。生物防治真菌主要通過抑制病原菌生長和促進植物的抗性來防治植物病害（Shoresh etal.，2010）。盡管前期研究表明T9131能誘導黃芪對HYFS-1的抗性，但在大同縣根腐病防治中生防真菌鑒定及其抑菌能力和誘導植物抗病酶活等生理指標未見相關報道。本研究以鑒定大同縣黃芪根腐病生防真菌為目標，采用形態學觀察、分子鑒定、平板對峙及黃芪生理指標測定等方法，擬探討以下問題：（1）確定生防真菌類型;（2）明確生防真菌對黃芪根腐病的防治作用；（3）解析生防真菌誘導黃芪抗病生理生化機制。本研究以期為大同縣黃芪根腐病的防治提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

木霉分離使用的黃芪根腐病病株于2021年取

自山西大同縣；黃芪致病菌腐皮鐮刀菌HYFS-1由實驗室分離保存備用；用于生理指標檢測的感病黃芪材料為蒙古黃芪。

1.2方法

1.2.1木霉形態學鑒定木霉分離及純化與牛景萍等（2023）方法一致，將木霉在PDA培養基上培養6～7d，觀察其菌落特征和分生孢子，分生孢子的觀察用熒光顯微鏡（LeicaDM6B）進行。參考Chaverri等（2015）和楊合同（2009）的方法進行木霉形態學鑒定。

1.2.2木霉分子鑒定取生長4～5d的木霉菌絲，利用真菌基因組DNA抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司]進行DNA提取，分別利用真菌鑒定引物ITS1/ITS4和EF1-728F/teflrev（表1）進行PCR擴增（牛景萍等，2023）。擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果結合劉青等（2019）和Sadfi-Zouaoui等（2009）的序列信息并利用MEGA7.0軟件的鄰接法（neighbor-joining）（bootstrap設為1000）構建系統發育樹。

表1ITS序列擴增引物 Table 1 Primers used for amplification of ITS sequences

1.2.3哈茨木霉與腐皮鐮刀菌的對峙培養在含有PDA培養基的 90mm 培養皿中，分別在距離培養血兩端約 20mm 處分別放置 6mm 哈茨木霉T9131和腐皮鐮刀菌HYFS-1菌餅，以只接種HYFS-1為對照，每組3個重復，均放置于 27°C 培養6d，每天測量HYFS-1生長半徑并計算抑菌率（馬文旭等，2021），抑菌率 （%）= （對照處理菌落半徑-處理組菌落半徑）/對照處理菌落半徑 ×100 。1.2.4哈茨木霉孢子懸浮液的培養哈茨木霉T9131在平板上生長7d后，每個平板加入 5mL 蒸餾水，用移液槍反復吹打，將獲得的孢子懸浮液收集在離心管中，將孢子懸浮液稀釋100倍，充分搖勻，吸 6μL 加到Watson177-212C型血球計數板上放在顯微鏡下進行計數，最終獲得孢子懸浮液濃度為 1×10⁸CFU?mL^-1

1.2.5生理指標測定選取飽滿完整的蒙古黃芪種子種植于外口徑為 14cm 的花盆中（營養土與蛭石比例為 1：2，V/V） ，每盆種植20粒左右。將其放置于 光照 /8h 黑暗的培養箱中生長，待植株生長到4～5葉期，處理組每盆用150mL 哈茨木霉T9131（T）孢子懸浮液進行灌根，以灌根 150mL 純水為對照。灌根處理 ^48h 后，利用下胚軸接種法（牛景萍等，2023）對所有植株接種生長5d的HYFS-1（H），分別在接種HYFS-1后0.24.48h 時取根進行生理指標PAL、POD、SOD、CAT和 Pro 的測定，每個生理指標重復3次。生理指標測定分別采用生工生物工程（上海）股份有限公司的PAL活性檢測（D799599-0050）POD活性檢測（D799591-0050）、SOD活性檢測（D799593-0050）CAT含量檢測（D799597-0050）Pro含量檢測（D799575-0050）試劑盒完成。

1.2.6數據處理利用WPSOfficeExcel軟件對實驗數據進行計算。采用GraphPadPrism9軟件繪制柱狀圖。使用SPSS23軟件對數據進行顯著性差異分析，設置 Plt;0.05 為顯著性水平。

2 結果與分析

2.1木霉形態學鑒定

前期對黃芪病株進行病原菌分離純化共獲得5個真菌分離物（牛景萍等，2023），其中1個分離真菌在PDA培養基上迅速生長，初期菌落和菌絲均為白色，菌絲呈絮狀（圖1：A），后期菌落變為綠色（圖1：B）。分生孢子形狀為圓形或卵圓形，邊緣光滑，顏色為綠色（圖1：C），大小為（3.6～5.4）μm×（3.2～5.1） 1 μm 。該木霉形態特征與哈茨木霉形態特征基本一致。

A.PDA培養基上生長3d的菌落形態；B.PDA培養基上生長7d的菌落形態；C.分生孢子。 A.ColonymorphologyonPDA mediumfor 3d ；B.ColonymorphologyonPDAmediumfor 7d ; C.Conidia

圖1分離菌株的形態學特征

Fig.1Morphological characteristics of isolated strain

2.2木霉分子鑒定

利用真菌鑒定引物進行木霉ITS序列（GenBank：PQ465589）和tef1序列（GenBank：PQ490419）PCR擴增，ITS1和ITS4擴增測序結果表明ITS序列片段大小為 595bp （圖2：A），EF1-728F和teflrev擴增測序片段大小為 626bp （圖3：A）。對兩條序列分別構建系統發育進化樹，以暹羅芽孢桿菌（Bacillussiamensis）為外類群，結果表明兩條擴增序列與哈茨木霉的同源性最高（圖2：B；圖3：B），結合形態特征，鑒定該分離菌株為哈茨木霉，命名為 T9131。

2.3哈茨木霉對腐皮鐮刀菌的拮抗作用

為了研究哈茨木霉T9131對腐皮鐮刀菌HYFS-1的抑制，對二者進行對峙試驗，結果表明T9131生長迅速，培養1d后二者相遇（圖4：A）；培養2d后T9131產生綠色孢子，開始向HYFS-1蔓延，同時發現HYFS-1產生了橘黃色的色素（圖4：B）;3d后T9131覆蓋整個HYFS-1，HYFS-1停止生長，3d的抑制率為 47%±1% ;6d的抑制率為72%±1% （圖4：C）。

2.4哈茨木霉誘導蒙古黃芪抗病生理指標測定

在前期研究中發現腐皮鐮刀菌HYFS-1侵染黃芪 ^48h 后黃芪開始萎蔫（牛景萍等，2023），用哈茨木霉T9131灌根處理蒙古黃芪后再接種HYFS-1可緩解蒙古黃芪的萎蔫程度（Niuetal.，2024）。為研究T9131在蒙古黃芪抗病中的作用，測定了生理指標SOD（圖5：A）POD（圖5：B）、CAT（圖5：C）和PAL（圖5：D）的活性及 Pro 含量（圖5：E）。結果表明，與 H_-0h 相比，POD、CAT和PAL的活性在 T+H₀h 顯著下調，SOD活性顯著上調， Pro 含量上調；與 H_-24h 相比，SOD、POD和 Pro 在 T+H_24h 顯著上調，CAT無顯著變化，PAL顯著下調；與 H_-48h 相比，POD、PAL 和Pro在 顯著上調，SOD上調，CAT無顯著變化（圖5）。這說明哈茨木霉T9131主要誘導POD、SOD和PAL的活性及提高 Pro 含量。

圖2哈茨木霉ITS1和ITS4引物分子鑒定 ig.2Molecular identification of ITS1 and ITS4 primers for Trichoderma harzianum

A.擴增產物瓊脂糖凝膠電泳；B.擴增序列進化樹；*表示模式菌株。

A.Agarose gel electrophoresis for amplification product；B.Phylogenetic tree of amplification sequences； * indicates the type of strains.

3討論與結論

腐皮鐮刀菌是黃芪根腐病主要致病菌之一，已在黃芪種植區，如山西（任小霞等，2016；牛景萍等，2023）、青海（馬桂花等，2022）、甘肅隴西（牛世全等，2016）、甘肅渭源（陳健等，2020）和寧夏吳忠（張曉塵等，2024）等地被分離鑒定。其中，在寧夏吳忠分離的腐皮鐮刀菌X12能被哈茨木霉EMF910抑制生長，本研究表明大同縣分離的哈茨木霉T9131也能抑制腐皮鐮刀菌HYFS-1的生長，說明哈茨木霉對黃芪致病菌腐皮鐮刀菌的防治具有潛在價值。黃芪根腐病為土傳病害（牛景萍等，2023）且哈茨木霉EMF910分離自土壤中（張曉塵等，2024），而本研究中哈茨木霉T9131分離自黃芪病根中，據報道哈茨木霉可以存在于腐爛根中或作為植物內生菌存在（Guzman-Guzmanetal.，2023），因此T9131是否為黃芪內生菌有待進一步研究。在病原菌的脅迫下，木霉菌可以誘導植物產生防御酶活性（龐麗等，2023）。在立枯絲核菌脅迫下，哈茨木霉NBRI-1055能提高向日葵SOD和CAT的活性（Singhetal.，2011）;在禾谷鐮刀菌PH-1脅迫下，哈茨木霉T-aloe顯著提高小麥POD和CAT的活性（龐麗等，2023）；在尖孢鐮刀菌Fol脅迫下，哈茨木霉Th顯著提高番茄 SOD、POD、CAT和PAL的活性（Zehraetal.，2023）。本研究表明在HYFS-1脅迫下，哈茨木霉T9131顯著提高SOD、POD和PAL的活性，與前人研究結果一致。SOD和POD的活性還與Pro的積累成正相關（韓曉玲，2006），Pro能受木霉誘導而積累（Batooletal.，2020），本研究結果表明在HYFS-1脅迫下，T9131使Pro含量整體高于對照，說明

A.擴增產物瓊脂糖凝膠電泳；B.擴增序列進化樹。

A.Agarose gel electrophoresis for amplification product；B.Phylogenetic tree of amplification sequences.

圖3哈茨木霉EF1-728F和teflrev引物分子鑒定

Fig.3Molecular identificationof EF1-728F and teflrevprimers for Trichoderma harzianum

T9131可能通過誘導Pro積累進而提高SOD和POD的活性。在氧化防御過程中，SOD能將 0₂^- ·分解成 H₂O₂，H₂O₂ 可以被POD和CAT分解成水和 0₂ （Sharmaetal.，2012），本研究中T9131誘導SOD和POD的活性變化與T9131誘導的 H₂O₂ 含量變化（Niuetal.，2024）趨勢基本一致，說明SOD和POD可能參與調控 H₂O₂ 的平衡。此外，焦蓉等（2011）認為 Pro 能通過自身積累提高 SOD 和POD的活性進而清除ROS，推測在腐皮鐮刀菌HYFS-1脅迫下，哈茨木霉T9131可能先誘導Pro的積累，然后通過 Pro 的積累來提高SOD和POD的活性，最后通過SOD和POD調控 H₂O₂ 的含量從而提高黃芪對HYFS-1的抗性（圖6）。綜上表明，從大同縣病根中鑒定的生防真菌為哈茨木霉T9131，哈茨木霉T9131能直接抑制黃芪致病菌腐皮鐮刀HYFS-1的生長，同時，哈茨木霉T9131通過誘導黃芪SOD、POD、PAL和Pro等生理指標來提高黃芪對腐皮鐮刀菌的抗性。以上研究結果可為哈茨木霉作為生防菌提供理論基礎。

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A.對崎1d；B.對崎2d；C.對崎6 d A.Confrontation for ;B.Confrontationfor2d;C.Confrontationfor6d.

圖4哈茨木霉T9131和腐皮鐮刀菌HYFS-1平板對峙試驗

Fig.4A plate confrontation assay of Trichoderma harzianum T9131 and Fusarium solani HYFS-1

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H.腐皮鐮刀菌 HYFS-1；T.哈茨木霉 T9131。 ? 表示有顯著性差異（ Plt;0.05： ； ?? 表示二者極顯著性差異（ Plt;0.01 。H.Fusarium solani HYFS-1；T. Trichoderma harzianum T9131. ? indicatessignificant differences（ Plt;0.05. ； ** indicates extremelysignificant differences （Plt;0.01） ）

圖5哈茨木霉T9131誘導蒙古黃芪根酶活性及Pro含量 Fig. 5Root enzyme activity and Pro content of Astragalus membranaceus var. mongholicus inducedbyTrichoderma harzianum T9131

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圖6腐皮鐮刀菌HYFS-1脅迫下哈茨木霉T9131誘導抗病的模型 Fig.6A model of Trichoderma harzianum T9131 inducing resistance under Fusarium solani HYFS-1 stress

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（責任編輯 周翠鳴）